Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1739308 de la National Science Foundation, la subvención NSF CAREER 1944130 y por la subvención FA9550-18-1-0199 de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea. Las secuencias de la ADP fueron un regalo generoso del Dr. Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Erik Winfree y al Dr. Rizal Hariadi por sus útiles conversaciones sobre el código MATLAB de DNA Design Toolbox. También queremos dar las gracias a Joseph Suhan, Mara Sullivan y el Centro de Imágenes Biológicas por su asistencia en la recopilación de datos de TEM.

1. Diseño de la secuencia de la ADNA
<ol><li>Descargue DNA Design Toolbox22 desarrollado por Winfree Lab en Caltech23 en la carpeta que contiene scripts de programación para diseñar secuencias.</li>
	<li>Dentro de esa carpeta de diseño de secuencia, abra un lenguaje de programación de cuarta generación compatible con la extensión de archivo ".m" y, a continuación, agregue la carpeta "DNAdesign" descargada anteriormente a la ruta de acceso mediante el siguiente com...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Este artículo se centra en adaptar y mejorar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes hacia las mezclas de disolventes orgánicos. Los métodos descritos aquí se centran en las modificaciones y la solución de problemas dentro de un espacio experimental definido de disolventes orgánicos aproticos polares seleccionados. Todavía existe un potencial inexplorado para que otros protocolos establecidos de nanotecnología de ácido nucleico se adapten dentro de este espacio. Esto podría mejorar las a...

Construcción exitosa de numerosas nanoestructuras complejas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 en medios acuosos o sustancialmente hidratados hechos con natural ácidos nucleicos que ocurren tales como ADN1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 y RNA11,12 se ha demostrado en trabajos anteriores. Sin embargo, los ácidos nucleicos de origen natural se someten a cambios de conformación helicoidales dúplex o han reducido las estabilidades térmicas en mezclas de disolventes orgánicos13,14.
Anteriormente, nuestro laboratorio ha informado de un método para la construcción de nanofibras de 3 hélices utilizando imitaciones de ácido nucleico sintético modificado de posición gamma llamadas ácidos nucleicos de péptido gamma (-PNA)15 (Figura 1A). La necesidad de tal desarrollo y aplicaciones potenciales del ácido nucleico sintético imitado PNA se ha discutido en el campo16,17. Hemos demostrado, a través de una adaptación de la estrategia de baldosas de una sola cadena (SST) presentada para las nanoestructuras de ADN18,19,20, que 9 oligómeros de la VNA secuencialmente distintos pueden ser diseñados para formar nanofibras de 3 hélices en mezclas selectas de disolventes orgánicos aproticos polares como DMSO y DMF. Los oligómeros de la APna fueron ordenados comercialmente con modificaciones de (R)-dietilenglicol (mini-PEG) en tres γ posiciones (1, 4 y 8 posiciones de base) a lo largo de cada oligómero de 12 bases basado en métodos publicados por Sahu et al. 21 Estas modificaciones gamma provocan la pre-organización helicoidal que está asociada con la mayor afinidad de unión y la estabilidad térmica de la ADN en relación con la ANP no modificada.
Este artículo es una adaptación de nuestro trabajo reportado en el que investigamos los efectos de la solución solvente y la sustitución por ADN en la formación de nanoestructuras basadas enELPna 15. El objetivo de este artículo es proporcionar descripciones detalladas del diseño, así como protocolos detallados para los métodos adaptados a disolventes que se desarrollaron para el autoensamble y la caracterización de la nanofibra de LAPNA. Por lo tanto, primero presentamos la estrategia modular SST, una plataforma general para el diseño de nanoestructuras utilizando el ácido nucleico sintético imitar PNA.
Se ha informado que el tono helicoidal para los dúplex PNA es de 18 bases por turno en comparación con los dúplex de ADN, que se someten a un giro por 10,5 bases(Figura 1B). Por lo tanto, la longitud de dominio de los SST de la serie de comandos de la serie de datos de la serie de productos se estableció en 6 bases para dar cabida a un tercio de un giro completo o a 120o de rotación para permitir la interacción entre tres hélices triangularmente matrices. Además, a diferencia de los motivos anteriores de SST, cada SST contiene solo 2 dominios, creando efectivamente una estructura de 1 dimensión similar a una cinta que se ajusta para formar un paquete de tres hélices (Figura 1C). Cada oligómero de 12 bases de LA APna se modifica gammamente en las posiciones 1, 4 y 8 para garantizar una distribución uniformemente espaciada de los grupos mini-PEG a través del motivo general de SST. Además, dentro del motivo, hay dos tipos de oligómeros: hebras "contiguas" que existen en una sola hélice y hebras "cruzadas" que abarcan hélices (Figura 1D). Además, los oligómeros P8 y P6 están etiquetados con Cy3 fluorescente (estrella verde) y biotina (oval amarillo), respectivamente (Figura 1D), para permitir la detección de la formación de la estructura mediante microscopía de fluorescencia. En total, el motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices a través de la complementariedad programada de cada dominio individual al dominio correspondiente en un oligómero vecino (Figura 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Las estrategias actuales en nanotecnología de ADN y ARN permiten el autoensamble de una variedad de nanoestructuras de ácido nucleico en medios acuosos o sustancialmente hidratados. En este artículo, describimos protocolos detallados que permiten la construcción de arquitecturas de nanofibra en mezclas de disolventes orgánicos a través del autoensamble de baldosas de ácido nucleico péptido modificado en gamma, de una sola cadena, direccionables de forma única. Cada tesela de una sola cadena (SST) es un oligómero de 12 bases de LANA compuesto por dos dominios modulares concatenados de 6 bases cada uno. Cada dominio puede unirse a un dominio mutuamente complementario presente en las hebras vecinas utilizando la complementariedad programada para formar nanofibras que pueden crecer a micras de longitud. El motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices. En contraste con las nanoestructuras de ADN análogas, que forman estructuras monodispersas de diámetro, estos sistemas de ARPna forman nanofibras que se agrupan a lo largo de sus anchuras durante el autoensamble en mezclas de disolventes orgánicos. Por lo tanto, los protocolos de autoensamble descritos aquí también incluyen un tensioactivo convencional, el sulfato de dodetil sódico (SDS), para reducir los efectos de agrupación.

Los protocolos discutidos en las secciones anteriores describen el diseño de un motivo SST adaptado a partir de nanofibras de ADN para la generación robusta de estructuras automontadas de nanofibras utilizando múltiples oligómeros de ARPna distintos. Esta sección describe la interpretación de los datos obtenidos de la recreación exitosa de los protocolos descritos.
Siguiendo el protocolo descrito en la sección 5 para la toma de imágenes TIRF de muestras de oligómeros de ARPna recocid...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Este artículo proporciona protocolos para el diseño y autoensamble de nanoestructuras a partir de oligómeros de ácido nucleico modificados gamma en mezclas de disolventes orgánicos.

Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Este novedoso protocolo describe el uso de múltiples secuencias distintas del ácido nucleico sintético imitan la gamma PNA para formar nanoestructuras en mezclas específicas de disolventes orgánicos. Los ensayos descritos aquí muestran la necesidad de adaptar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes a disolventes orgánicos donde se han publicado pocos o ningún protocolo. A los practicantes nuevos en esta técnica les podría resultar difícil adaptar los protocolos existentes desarrollados para entornos ricos en acuos en entornos orgánicos ricos en disolventes debido a la propensión de la ANP de nanomaterial para agregar.Comience preparando las existencias de gamma PNA. Después de obtener hilos de PNA gamma purificados de grado HPLC de un fabricante comercial, resuspendir cada hebra en agua desionizada a 300 concentraciones micromolares. Almacene los PNA gamma en menos 20 grados Centígrados durante un máximo de varios meses.Cuando esté listo para realizar el autoensamble, prepare muestras de lotes recocidos en 75%DMSO, 75%DMF y 40%1, 4-dioxano. En primer lugar, preparar 20 substocks micromolares de cada oligómero mediante la alícuota de 0,67 microlitros de la población principal y la adición de agua desionizada para un volumen final de 10 microlitros. Agregue un microlitro de cada oligómero de los 20 substocks micromolares a un tubo PCR de 200 microlitros, que llegará a un volumen total de nueve microlitros para nueve oligómeros.Agregue 30 microlitros de DMSO o DMF anhidros con un microlitro adicional de agua desionizada para un volumen final de 40 microlitros. Para preparar el lote 40%1, 4-dioxano, añadir 16 microlitros de 1, 4-dioxano y llevar el volumen a 40 microlitros con agua desionizada. Anneal las muestras durante 22,5 horas en un ciclor térmico de enfriamiento de 90 a 20 grados Celsius.Típicamente, las temperaturas de fusión obtenidas para dos subconjuntos de PNA gamma oligómero y tres oligómeros se encuentran en el rango de 40 a 70 grados Celsius para diferentes condiciones de disolvente. Programe el ciclor térmico de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez finalizada la recocido, las muestras se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante 12 a 24 horas antes de la caracterización.Haga una cámara de humedad a partir de una caja de puntas de pipeta vacía llenando la caja con aproximadamente cinco mililitros de agua. Preparar una dilución de 20 veces de 2% de colodión disponible comercialmente en acetato de amilo con disolvente de acetato de isoamilo para crear la solución de nitrocelulosa. Utilice pinzas para sumergir un cubreobjetos en la solución de nitrocelulosa y permitir que se seque al aire, luego haga una cámara de flujo de un portaobjetos del microscopio, dos tiras de cinta de doble cara y la tapa recubierta de nitrocelulosa.Preparar la solución de BSA de biotina pesando un miligramo de BSA de biotina y disolviéndola en un mililitro de PBS. Pipetear 15 microlitros de la BSA de biotina en el canal de flujo en ángulo e incubarlo durante dos a cuatro minutos a temperatura ambiente en la cámara humidificada. Soplar 15 microlitros del tampón de lavado, que consiste en un miligramo de BSA en un mililitro de PBS, en el canal para lavar el exceso de biotina BSA, luego pasivar la superficie incubando el canal de flujo durante dos a cuatro minutos en la cámara humidificada.Mida 0,5 miligramos de estreptavidina y un miligramo de BSA, luego disuelva ambos en un mililitro de PBS. Pipetear 15 microlitros de la solución de estreptavidina en el canal de flujo y colocarlo en la cámara humidificada durante dos a cuatro minutos y lavar el canal mediante el flujo de 15 microlitros de tampón de lavado. A continuación, fluya 15 microlitros del lote recocido de oligómeros gamma PNA en la cámara humidificada, luego lave las nanoestructuras no enlazadas mediante el flujo de 15 microlitros de un Trolox milimotor en la misma composición solvente que las nanoestructuras.Transfiera el canal de flujo al portaobjetos e újelo con un microscopio de fluorescencia equipado con imágenes TIRF, un objetivo de inmersión de aceite 60X y una lupa 1.5X. Escanee el canal de flujo con un aumento de 60 o 90X mientras supervisa el canal Cy3. Preparar 20 y 6%SDS stocks de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego recobrar los oligómeros gamma PNA añadiendo un microlitro de cada 20 oligómeros micromolares a un tubo PCR de 200 microlitros.Añadir 30 microlitros de DMSO anhidro y un microlitro de 6%o 20%SDS a los tubos de PCR para un volumen final de 40 microlitros, lo que dará lugar a una concentración final de SDS de 5,25 o 17,5 militrolares respectivamente. Anneal los PNAs gamma en el termociclo como se describió anteriormente. Caracterizar las nanoestructuras gamma PNA en presencia de SDS utilizando el protocolo TIRF o TEM.Las imágenes TIRF de oligómeros de PNA gamma recocidos en 75%DMSO mostraron arquitecturas bien organizadas mientras que el recocido en 75%DMF dio lugar a nanoestructuras en forma de espículo o en forma de aguja. La condición 40%1, 4-dioxano produjo una escasa decoración de nanoestructuras filamentosas. Además, las muestras de nanotubos gamma PNA formados en 75%DMSO demostraron la agrupación de nanofibras a alta ampliación o resoluciones nanoscópicas durante las imágenes TEM.El análisis cuantitativo de la anchura de las nanoestructuras mostró una anchura media de 16,3 nanómetros con valores máximos superiores a 80 nanómetros. Los oligómeros de ADN isosecuentes que reemplazaron a los ANN gamma contiguos formaron estructuras filamentosas rectas, mientras que la sustitución de los ANN gamma cruzados dan como resultado estructuras estelares. Las nanoestructuras que fueron reemplazadas por oligómeros de ADN contiguos tenían anchos medios de alrededor de 19 nanómetros.A altas concentraciones de SDS, las nanofibras gamma PNA también adoptan morfologías altamente en red en comparación con sus concentraciones críticas de micelas cuando se ven con imágenes TIRF. Las imágenes TEM indican que el ensamblaje de la ANP gamma en SDS de 5,25 mililitros tiene las reducciones más sustanciales en la agrupación estructural. Al intentar este protocolo, es importante recordar mantener las composiciones de disolvente como se mencionó debido a la propensión de las nanoestructuras a agregar.Estos métodos alientan a los practicantes a buscar otras vías inexploradas de diferentes composiciones de disolventes, tensioactivos y otras nanoestructuras de ADN de ansancho.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Investigación

Bioingeniería

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Continuamente agitado digestor anaeróbico para convertir los desechos orgánicos en biogás: configuración del sistema y funcionamiento básico

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Un supramolecular hidrogel inyectable de Drogas y cargadas para Inyección local catéter en el corazón de cerdo

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Química húmeda y el péptido Inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...