Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation grant 1739308, NSF CAREER grant 1944130 och av Air Force Office of Science Research grant number FA9550-18-1-0199. γPNA sekvenser var en generös gåva från Dr Tumul Srivastava av Trucode Gene Repair, Inc. Vi vill tacka Dr Erik Winfree och Dr Rizal Hariadi för deras hjälp samtal om DNA Design Toolbox MATLAB kod. Vi vill också tacka Joseph Suhan, Mara Sullivan och Center for Biological Imaging för deras hjälp vid insamlingen av TEM-data.

1. γPNA sekvens design
<ol><li>Ladda ner DNA Design Toolbox22 som utvecklats av Winfree Lab på Caltech23 i mappen som innehåller programmeringsskript för att utforma sekvenser.</li>
	<li>Öppna ett fjärde generationens programmeringsspråk som är kompatibelt med filtillägget ".m" inom den sekvensens designmapp och lägg sedan till mappen "DNAdesign" som tidigare har hämtats till sökvägen med följande kommando: >> addpath DNAdesign</li>
	<li>Därefter köra f...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Denna artikel fokuserar på att anpassa och förbättra befintliga nukleinsyra nanoteknik protokoll mot organiska lösningsmedel blandningar. De metoder som beskrivs här fokuserar på modifieringar och felsökning inom ett definierat experimentellt utrymme av utvalda polära aprotiska organiska lösningsmedel. Det finns ännu en outforskad potential för att andra etablerade nukleinsyrananoteknikprotokoll ska anpassas inom detta utrymme. Detta skulle kunna förbättra potentiella tillämpningar genom integration inom an...

Framgångsrik konstruktion av talrika komplexa nanostrukturer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 i vattenhaltiga eller väsentligen hydrerade medier som görs med hjälp av naturliga 4 , 5,6,7,8 ,9,10 och RNA11,12 har visats i tidigare arbeten. Men naturligt förekommande nukleinsyror genomgår duplex spiralformade konformationsförändringar eller har minskat termiska stabilities i organiska lösningsmedelblandningar 13,14.
Tidigare har vårt labb rapporterat en metod mot konstruktion av 3-helix nanofibrer med hjälp av gamma-position modifierade syntetisk nukleinsyra härmar kallas gamma-peptid nukleinsyror (γPNA)15 (Figur 1A). Behovet av en sådan utveckling och potentiella tillämpningar av den syntetiska nukleinsyran efterliknar PNA har diskuterats inom området16,17. Vi har visat, genom en anpassning av strategin single-stranded tile (SST) som presenteras för DNA nanostrukturer18,19,20, att 9 sekventiellt distinkta γPNA-oligomerer kan utformas för att bilda 3-helix nanofibrer i utvalda polära aprotiska organiska lösningsmedelsblandningar som DMSO och DMF. γPNA-oligomererna beställdes kommersiellt med modifieringar av (R)-diethyleneglykol (mini-PEG) vid tre γ-positioner (1, 4 och 8 baspositioner) längs varje 12-bas oligomer baserat på metoder som publicerats av Sahu et al. 21 Dessa gamma-modifieringar orsakar den spiralformade förorganisation som är associerad med den högre bindningsaffinitet och termisk stabilitet av γPNA i förhållande till omodifierade PNA.
Denna artikel är en anpassning av vårt rapporterade arbete där vi undersöker effekterna av lösningsmedelslösning och substitution med DNA på bildningen av γPNA-baserade nanostrukturer15. Syftet med denna artikel är att ge detaljerade beskrivningar av konstruktionen samt detaljerade protokoll för lösningsmedelsanpassade metoder som utvecklades för självmontering och karakterisering av γPNA nanofiber. Således introducerar vi först den modulära SST-strategin, en allmän plattform för nanostrukturdesign med hjälp av den syntetiska nukleinsyran som efterliknar PNA.
Den spiralformade stigningen för PNA-duplex har rapporterats vara 18 baser per varv i jämförelse med DNA-duplex, som genomgår ett varv per 10,5 baser (Figur 1B). Därför domän-längd på den påvisade γPNA SSTs sattes till 6 baser för att rymma en tredjedel av en fullständig sväng eller 120° av rotation för att möjliggöra interaktion mellan tre triangulärt arrayed helices. Också, till skillnad från tidigare SST-motiv, innehåller varje SST bara 2 domäner, effektivt skapa en 1-dimensionell band-liknande struktur som sveper för att bilda en tre-helix bunt (Figur 1C). Varje 12-bas γPNA oligomer är gamma modifierad vid 1, 4 och 8 positioner för att säkerställa enhetligt fördelade fördelning av mini-PEG grupper över den totala SST motiv. Dessutom, inom motivet, det finns två typer av oligomerer: "sammanhängande" strängar som finns på en enda spiral och helix-spänner "crossover" strängar (Figur 1D). Dessutom är oligomererna P8 och P6 märkta med fluorescerande Cy3 (grön stjärna) respektive biotin (gul oval),föratt möjliggöra detektering av strukturbildning med hjälp av fluorescensmikroskopi. Sammantaget är SST-motivet gjort av 9 totalt oligomerer för att möjliggöra bildandet av 3-helix nanofibrer genom programmerad komplementaritet av varje enskild domän till motsvarande domän på en angränsande oligomer (Figur 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Nuvarande strategier inom DNA och RNA nanoteknik möjliggör självmontering av en mängd olika nukleinsyrananostruktur i vattenhaltiga eller väsentligt hydrerade medier. I den här artikeln beskriver vi detaljerade protokoll som möjliggör konstruktion av nanofiberarkitekturer i organiska lösningsmedelsblandningar genom självmontering av unikt adresserbara, enkelsträngade, gammamodifierade plattor för peptidnukleinsyra (γPNA). Varje enkelsträngad bricka (SST) är en 12-bas γPNA oligomer består av två hopkonkatenerade modulära domäner på 6 baser vardera. Varje domän kan binda till en ömsesidigt gratis domän som finns på angränsande strängar med hjälp av programmerade komplementaritet för att bilda nanofibrer som kan växa till mikrometer i längd. SST-motivet är tillverkat av 9 totalt oligomerer för att möjliggöra bildande av 3-helix nanofibrer. I motsats till analoga DNA-nanostrukturer, som bildar diameter-monodisperse strukturer, dessa γPNA-system bildar nanofibrer som buntar längs sina bredder under självmontering i organiska lösningsmedelsblandningar. Självmonteringsprotokoll som beskrivs här inkluderar därför också ett konventionellt ytaktiva, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), för att minska kombinationseffekter.

De protokoll som diskuteras i avsnitten ovan beskriver utformningen av ett anpassat SST-motiv från DNA-nanofibrer för den robusta generationen självmonterade nanofiberstrukturer med hjälp av flera, distinkta γPNA-oligomerer. Detta avsnitt beskriver tolkningen av uppgifter som erhållits från framgångsrika rekreation av de protokoll som beskrivs.
Efter det protokoll som beskrivs i avsnitt 5 för TIRF bildframställning av prover av γPNA oligomerer glödgat i 75% DMSO: H2O (v ...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Denna artikel ger protokoll för utformning och självmontering av nanostrukturer från gamma-modifierad peptid nukleinsyra oligomer i organiska lösningsmedel blandningar.

Självmontering av gammamodifierad peptidnukleinsyror till komplexa nanostrukturer i organiska lösningsmedelsblandningar

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Denna roman protokoll beskriver användningen av flera olika sekvenser av den syntetiska nukleinsyra härma gamma PNA att bilda nanostrukturer i specifika organiska lösningsmedel blandningar. De analyser som beskrivs här visar behovet av att anpassa befintliga nukleinsyrananoteknikprotokoll mot organiska lösningsmedel där lite eller inga protokoll har publicerats. Utövare som är nya i denna teknik kan ha svårt att anpassa befintliga protokoll som utvecklats för vattenrika miljöer till organiska lösningsmedelsrika miljöer på grund av benägenheten hos nanomaterialet PNA att aggregera.Börja med att förbereda gamma PNA-bestånden. Efter att ha erhållit HPLC-sort renade gamma PNA-strängar från en kommersiell tillverkare, resuspend varje sträng i avjoniserat vatten till 300 mikromolar koncentrationer. Förvara gamma-PNAs på minus 20 grader Celsius i upp till flera månader.När du är redo att utföra självmontering, förbereda glödgda batchprover i 75%DMSO, 75%DMF och 40%1, 4-dioxan. Först förbereda 20 mikromolar dellager av varje oligomer genom aliquoting 0,67 mikroliter från huvudbeståndet och lägga avjoniserat vatten för en slutlig volym av 10 mikroliter. Lägg till en mikroliter av varje oligomer från 20 mikromolar dellager till en 200 microliter PCR-röret, som kommer att komma till en total volym av nio mikroliter för nio olligomer.Tillsätt 30 mikroliter av vattenfritt DMSO eller DMF med ytterligare en mikroliter av avjoniserat vatten för en slutlig volym på 40 mikroliter. För att förbereda 40%1, 4-dioxan partiet, tillsätt 16 mikroliter av 1, 4-dioxan och föra volymen till 40 mikroliter med avjoniserat vatten. Glödgproven i 22,5 timmar i en termisk cycler kylning från 90 till 20 grader Celsius.Typiskt, smälttemperaturer som erhållits för två oligomer och tre oligomer gamma PNA delmängder ligger i intervallet 40 till 70 grader Celsius för olika lösningsmedel villkor. Programmera termiska cyclern enligt manuskriptriktningar. När glödgningen är klar kan prover lagras vid fyra grader Celsius i 12 till 24 timmar före karakterisering.Gör en fuktighetskammare från en tom pipettspetslåda genom att fylla lådan med cirka fem milliliter vatten. Bered en 20-faldig utspädning av kommersiellt tillgänglig 2%collodion i amylacetat med isoamylacetatlösningsmedel för att skapa nitrocellulosalösningen. Använd pincett för att doppa en coverslip i nitrocellulosalösningen och låt den lufttorka, sedan göra en flödeskammare ur ett mikroskop bild, två dubbelsidig tejp remsor, och nitrocellulosa-belagda täcken.Bered biotin BSA-lösningen genom att väga ett milligram biotin BSA och lösa upp den i en milliliter PBS. Pipett 15 mikroliter av biotin BSA in i flödeskanalen i vinkel och inkubera den i två till fyra minuter vid rumstemperatur i den befuktade kammaren. Blås 15 mikroliter av tvättbufferten, som består av ett milligram BSA i en milliliter pbs, i kanalen för att tvätta bort överflödig biotin BSA, sedan passivate ytan genom att inkubera flödeskanalen i två till fyra minuter i den befuktade kammaren.Mät 0,5 milligram streptavidin och ett milligram BSA, lös sedan upp båda i en milliliter PBS. Pipett 15 mikroliter av streptavidinlösningen i flödeskanalen och placera den i den befuktade kammaren i två till fyra minuter och tvätta kanalen genom att flöda 15 mikroliter tvättbuffert. Därefter flöde 15 mikroliter av glödgat parti gamma PNA olligomer i den befuktade kammaren, sedan tvätta de obundna nanostrukturer genom att flöda 15 mikroliter av en millimolar Trolox i samma lösningsmedel sammansättning som nanostrukturer.Överför flödeskanalen till bildhållaren och avbilda den med ett fluorescensmikroskop utrustat med TIRF-avbildning, ett mål för oljesänkning på 60X och en 1,5X-förstoringsapparat. Skanna flödeskanalen med antingen 60 eller 90X förstoring medan du övervakar Cy3-kanalen. Förbered 20 och 6% SDS lager enligt manuskriptet riktningar, sedan glödg gamma PNA oligomerer genom att lägga till en mikroliter av varje 20 mikromolar oligomer till en 200 microliter PCR rör.Tillsätt 30 mikroliter av vattenfritt DMSO och en mikroliter på 6%eller 20%SDS till PCR-rören för en slutlig volym på 40 mikroliter, vilket kommer att resultera i en slutlig SDS-koncentration på 5,25 eller 17,5 millimolar respektive. Anneal de gamma PNAs i thermocycler som tidigare beskrivits. Karakterisera gamma PNA nanostrukturer i närvaro av SDS med hjälp av TIRF eller TEM protokollet.TIRF bildframställning av gamma PNA oligomerer glödgat i 75%DMSO visade välorganiserade arkitekturer medan glödgning i 75%DMF resulterade i spicule-formad eller nål-liknande nanostrukturer. Den 40%1, 4-dioxan tillstånd produceras en gles dekoration av fintrådiga nanostrukturer. Vidare, proverna av gamma PNA nanorör bildas i 75%DMSO visat buntning av nanofibrer vid hög förstoring eller nanoskopiska upplösningar under TEM imaging.Kvantitativ analys av bredden på nanostrukturerna visade en medianbredd på 16,3 nanometer med maximala värden utöver 80 nanometer. Isosequential DNA oligomerer som ersatt sammanhängande gamma PNAs bildas raka fintrådiga strukturer medan ersättning av crossover gamma PNAs resultera i stellate strukturer. De nanostrukturer som ersattes med sammanhängande DNA-vägörare hade medianbredder på cirka 19 nanometer.Vid höga SDS-koncentrationer antar gamma PNA nanofibrer också mycket nätverksanslutna morfologier i jämförelse med dess kritiska glnellkoncentrationer när de ses med TIRF-avbildning. TEM imaging indikerar att gamma PNA montering i 5,25 millimolar SDS har de mest betydande minskningarna av strukturella kombinationserbjudanden. När man försöker detta protokoll, är det viktigt att komma ihåg att behålla lösningsmedelssammansättningarna som nämnts på grund av nanostrukturernas benägenhet att aggregera.Dessa metoder uppmuntrar utövare att driva andra outforskade vägar av olika lösningsmedel sammansättningar, ytaktiva ämnen, och andra PNA DNA nanostrukturer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Riktad Cellular Self-Assembly att tillverka-cellerna Tissue Ringar för Biomekaniska analys och Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Fast fas Submonomer Syntes av Peptoid polymerer och deras självorganisering till mycket beställt Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip isotakofores för separation av joner och rening av nukleinsyror

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Kontinuerligt omrörd anaerob rötkammare för att omvandla organiskt avfall till biogas: System Setup och Basic drift

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet kemi och peptid immobilisering på polytetrafluoretylen för förbättrad cellvidhäftning

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabricera nedbrytbara Thermoresponsive Hydrogels på flera längdskalor via reaktiva extrudering, mikrofluidik, självmontering och Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...