Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Bu çalışma kısmen National Science Foundation hibe 1739308, NSF CAREER hibe 1944130 ve Hava Kuvvetleri Ofis Bilim Araştırma hibe numarası FA9550-18-1-0199 tarafından desteklenmiştir. γPNA dizileri Trucode Gen Onarım, Inc Dr Tumul Srivastava cömert bir hediye vardı. Dr. Erik Winfree ve Dr. Rizal Hariadi'ye DNA Tasarım Araç Kutusu MATLAB kodu hakkındaki yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca Joseph Suhan, Mara Sullivan ve Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ne TEM verilerinin toplanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

1. γPNA sıra tasarımı
<ol><li>Caltech23'teki Winfree Lab tarafından geliştirilen DNA Tasarım Araç Kutusu22'yi dizileri tasarlamak için programlama komut dosyaları içeren klasöre indirin.</li>
	<li>Bu sıra lı tasarım klasöründe, ".m" dosya uzantısı ile uyumlu dördüncü nesil bir programlama dili açın ve daha önce indirilen "DNAdesign" klasörünü aşağıdaki komutu kullanarak yola ekleyin: >> addpath DNAdesign</li>
	<li>Daha sonra aşağıdaki ...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Bu makale, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin organik çözücü karışımlarına uyarlanması ve iyileştirilmesi üzerine odaklanılmıştır. Burada açıklanan yöntemler, belirli polar aprotik organik çözücülerin tanımlanmış deneysel alanı içinde modifikasyonlar ve sorun giderme üzerine odaklanmaktadır. Bu alana adapte olacak diğer çekirdekik asit nanoteknoloji protokolleri için henüz keşfedilmemiş bir potansiyel vardır. Bu genellikle benzer organik çözücüler2...

Çok sayıda karmaşık nanoyapıların başarılı yapısı1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12doğal olarak oluşan nükleik asitler kullanılarak yapılan sulu veya önemli ölçüde sulu medya 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ve RNA11,12 önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, doğal olarak oluşan nükleik asitler dupleks sarmal konformasyonel değişikliklere uğrar veya organik çözücü karışımlarında termal stabiliteleri azaltmıştır13,14.
Daha önce laboratuvarımız gama-peptit nükleik asitler (γPNA)15 (Şekil 1A)adı verilen gama pozisyonu modifiye edilmiş sentetik nükleik asit taklitleri kullanarak 3 sarlisli nanofiberlerin yapımına yönelik bir yöntem bildirmiştir. Böyle bir gelişme ve sentetik nükleik asit taklit PNA potansiyel uygulamaları için ihtiyaç alan16,17içinde ele alınmıştır. Biz göstermiştir ki, DNA nanoyapılar için sunulan tek iplikli karo (SST) stratejisinin bir adaptasyon yoluyla18,19,20, 9 sırayla farklı γPNA oligomerler DMSO ve DMF gibi belirli polar aprotik organik çözücü karışımları 3-sarmalı nanofiberler oluşturmak için tasarlanmış olabilir. ΓPNA oligarmerleri ticari olarak (R)-dietilen glikol (mini-PEG) modifikasyonları ile sipariş edildi üç γ pozisyonlarında (1, 4 ve 8 baz-pozisyonlar) her 12-baz oligomer Boyunca Sahu ve arktarafından yayınlanan yöntemlere dayalı . 21 Bu gama modifikasyonları, γPNA'nın değiştirilmemiş PNA'ya göre daha yüksek bağlayıcı yakınlığı ve termal stabilitesi ile ilişkili sarmal ön organizasyona neden olur.
Bu makale, solvent çözeltisi ve DNA ile ikame γPNA tabanlı nanoyapıların oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak bildirilen çalışmamızın biruyarlamasıdır 15. Bu makalenin amacı, γPNA nanofiber'in kendi kendine montajı ve karakterizasyonu için geliştirilen solvent uyarlanmış yöntemler için ayrıntılı protokollerin yanı sıra tasarımın ayrıntılı açıklamalarını sağlamaktır. Böylece, ilk modüler SST stratejisi, sentetik nükleik asit pna taklit kullanarak nanoyapı tasarımı için genel bir platform tanıtmak.
PNA dupleksleri için sarmal adım 10,5 baz başına bir dönüş geçmesi DNA dupleksler ile karşılaştırıldığında dönüş başına 18 baz olduğu bildirilmiştir(Şekil 1B). Bu nedenle, gösterilen γPNA SST'lerin etki alanı uzunluğu, üç üçgen dizili helikler arasındaki etkileşimi etkinleştirmek için tam dönüşün üçte birini veya 120° döndürmeyi karşılamak üzere 6 tabanda ayarlanmıştır. Ayrıca, önceki SST motiflerinin aksine, her SST sadece 2 etki alanı içerir ve üç sarlis demeti oluşturmak için sarar 1 boyutlu şerit benzeri bir yapı oluşturur(Şekil 1C). Her 12-baz γPNA oligomer genel SST motifi arasında mini PEG gruplarının düzgün aralıklı dağılımını sağlamak için 1, 4 ve 8 pozisyonlarda gama modifiye edilir. Ayrıca, motif içinde, oligomerler iki türü vardır: tek bir sarlis ve sarlak yayılan "crossover" iplikçikleri üzerinde var "bitişik" iplikçikler(Şekil 1D). Buna ek olarak, oligomerler P8 ve P6 floresan Cy3 ile etiketlenir (yeşil yıldız) ve biotin (sarı oval), sırasıyla(Şekil 1D),floresan mikroskop ile yapı oluşumunun tespitini sağlamak için. SST motifi, her bir etki alanının komşu bir oligomer üzerindeki ilgili etki alanına programlı tamamlayıcılığı yoluyla 3 sarli salık nanofiberoluşumunu mümkün kılmak için toplam 9 oligomerden oluşur(Şekil 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

DNA ve RNA nanoteknolojisindeki mevcut stratejiler, sulu veya önemli ölçüde sulu ortamda çeşitli nükleik asit nanoyapıların kendi kendine biraraya ılmasını sağlar. Bu makalede, organik çözücü karışımlarında nanofiber mimarilerin, benzersiz adreslenebilir, tek iplikli, gama modifiye peptid nükleik asit (γPNA) karolarının kendi kendine montajı yoluyla inşa edilmesini sağlayan ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Her tek iplikli döşeme (SST), her biri 6 bazdan oluşan iki modüler etki alanından oluşan 12 bazlı bir γPNA oligomerdir. Her etki alanı, uzunlukta mikronlara büyüyebilen nanofiberler oluşturmak için programlanmış tamamlayıcılık kullanarak komşu ipliklerde bulunan karşılıklı olarak ücretsiz bir etki alanına bağlanabilir. SST motifi, 3 sarli salik nanofiberlerin oluşumunu sağlamak için toplam 9 oligomerden yapılmıştır. Çap-monodisperse yapılar oluşturan benzer DNA nanoyapılarının aksine, bu γPNA sistemleri organik çözücü karışımlarında kendi kendine montaj sırasında genişlikleri boyunca biraraya gelen nanolifler oluştururlar. Bu nedenle burada açıklanan kendi kendine montaj protokolleri de geleneksel bir yüzey aktif içerir, Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS), donanmış etkilerini azaltmak için.

Yukarıdaki bölümlerde tartışılan protokoller, dna nanofiberlerinden uyarlanmış bir SST motifinin, birden fazla γPNA oligomerkullanılarak kendi kendine biraraya getirilmiş nanofiber yapıların sağlam nesli için tasarlanmis tasarımını açıklayabilmiştir. Bu bölümde, açıklanan protokollerin başarılı bir şekilde yeniden canlanmasından elde edilen verilerin yorumlanması açıklanmaktadır.
%75 DMSO'da bulunan γPNA oligomerörneklerinin TIRF görüntülemesi için böl?...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Bu makalede, organik çözücü karışımlarında gama modifiye peptit nükleik asit oligomerlerinden nanoyapıların tasarımı ve kendi kendine montajı için protokoller sağlandığı belirtilmiştir.

Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Bu yeni protokol, sentetik nükleik asit taklit gama PNA'nın belirli organik çözücü karışımlarında nanoyapılar oluşturmak için birden fazla farklı dizinin kullanımını açıklamaktadır. Burada açıklanan tahliller, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin çok az veya hiç protokol yayınlanmamış organik çözücülere uyarlanma gereğini göstermektedir. Bu tekniğin yeni uygulayıcıları, nanomalzeme PNA'nın toplama eğilimi nedeniyle sulu-zengin ortamlar için geliştirilen mevcut protokolleri organik çözücü açısından zengin ortamlara uyarlamakta zorlanabilirler.Gama PNA stokları hazırlayarak başlayın. Ticari bir üreticiden HPLC sınıfı saflaştırılmış gama PNA iplikçikleri aldıktan sonra, deiyonize sudaki her bir ipliği 300 mikromolar konsantrasyona geri alın. Gama PNA'larını eksi 20 derecede birkaç aya kadar saklayın.Kendi kendine montaj yapmaya hazır olduğunuzda, %75 DMSO, %75 DMF ve %40 1, 4-dioksan toplu iş örnekleri hazırlayın. İlk olarak, ana stoktan 0,67 mikrolitre aliquoting ve 10 mikrolitre son bir hacim için deiyonize su ekleyerek her oligomer 20 mikromolar alt stokları hazırlayın. 20 mikromolar alt hisse senetlerinden her bir oligomerin bir mikrolitresini 200 mikrolitrelik PCR tüpüne ekleyin, bu da dokuz oligomer için toplam dokuz mikrolitre hacmine gelecektir.40 mikrolitre lik son hacim için bir mikrolitre deiyonize su ile 30 mikrolitre susuz DMSO veya DMF ekleyin. 40%1, 4-dioksan toplu hazırlamak için, 1, 4-dioksan 16 mikrolitre ekleyin ve deiyonize su ile 40 mikrolitre hacmi getirmek. 90 ila 20 santigrat derece soğutma bir termal döngüc içinde 22,5 saat boyunca örnekler anneal.Tipik olarak, iki oligomer ve üç oligomer gama PNA alt kümesi için elde edilen erime sıcaklıkları farklı çözücü koşulları için 40 ila 70 santigrat derece aralığında dır. Termal döngücörü el yazması talimatlara göre programla. Anneleştirme tamamlandıktan sonra, örnekler karakterizasyondan önce 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklanabilir.Kutuyu yaklaşık beş mililitre suyla doldurarak boş bir pipet ucu kutusundan nem haznesi yapın. Nitroselüloz çözeltisi oluşturmak için izoamyl asetat çözücü ile amil asetat ticari olarak kullanılabilir% 2 kolokit 20 kat seyreltme hazırlayın. Nitroselüloz çözeltisine bir kapak daldırma ve hava-kuru izin için cımbız kullanın, sonra bir mikroskop slayt bir akış odası yapmak, iki çift taraflı bant şeritler, ve nitroselüloz kaplı coverslip.Biotin BSA çözeltisini bir miligram biotin BSA tartarak ve bir mililitre PBS'de eriterek hazırlayın. Pipet 15 mikrolitre biotin BSA bir açıyla akış kanalına ve nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında 2-4 dakika kuluçka. Bir mililitre PBS'de bir miligram BSA'dan oluşan yıkama tamponunun 15 mikrolitresini, fazla biotin BSA'yı temizlemek için kanala üfleyin, sonra da akış kanalını nemlendirilmiş odada 2-4 dakika kuluçkaya yatırarak yüzeyi pasifize edin.Ölçü 0.5 streptavidin miligram ve BSA bir miligram, sonra PBS bir mililitre her ikisi de çözünür. Pipet 15 mikrolitre streptavidin çözeltisi akış kanalına yerleştirin ve 2-4 dakika nemli haznesine yerleştirin ve 15 mikrolitre yıkama tamponu dederek kanalı yıkayın. Daha sonra, nemlendirilmiş odada gama PNA oligomerlerinin 15 mikrolitrelik kısmını boşaltın, sonra da bir milimolar Trolox'un 15 mikrolitresini nanoyapılarla aynı çözücü bileşiminde akıtarak bağlanmamış nanoyapıları yıkayın.Akış kanalını slayt tutucuya aktarın ve TIRF görüntüleme, 60X yağ daldırma hedefi ve 1,5 X büyüteçle donatılmış bir floresan mikroskobuyla görüntüleyin. Cy3 kanalını izlerken akış kanalını 60 veya 90X büyütme de tazyin. El yazması talimatlara göre 20 ve%6 SDS stokları hazırlayın, ardından 200 mikrolitrelik PCR tüpüne her 20 mikromolar oligomerden bir mikrolitre ekleyerek gama PNA oligarmerlerini anneal.40 mikrolitrelik son bir hacim için PCR tüplerine 30 mikrolitre susuz DMSO ve %6 veya %20 SDS mikrolitre ekleyin ve bu da sırasıyla 5,25 veya 17,5 milimolar son bir SDS konsantrasyonu ile sonuçlanır. Anneal gama PNA'lar termocycler daha önce açıklandığı gibi. TIRF veya TEM protokolünü kullanarak SDS varlığında gama PNA nanoyapılarını karakterize edin.%75 DMSO'da bulunan gama PNA oligomerlerinin TIRF görüntülemesi iyi organize edilmiş mimariler gösterirken, %75 DMF'de annealing spicule şekilli veya iğne benzeri nanoyapılarla sonuçlandı. 40%1, 4-dioksan durumu ipliksi nanoyapıların seyrek bir dekorasyon üretti. Ayrıca, %75 DMSO'da oluşturulan gama PNA nanotüpleri, TEM görüntüleme sırasında yüksek büyütme veya nanoskobik çözünürlüklerde nanofiberlerin birleştirilmesini göstermiştir.Nanoyapıların genişliğinin nicel analizi, maksimum değerler80 nanometrenin üzerinde olan 16,3 nanometre ortanca genişlik gösterdi. Bitişik gama PNA'larının yerini alan izoardiye DNA oligomerleri düz ipliksi yapılar oluşurken, çapraz gama PNA'larının değiştirilmesi yıldız yapılarına neden olur. Bitişik DNA oligomerleri ile değiştirilen nanoyapıların ortanca genişlikleri yaklaşık 19 nanometreidi.Yüksek SDS konsantrasyonlarında, gama PNA nanofibers de TIRF görüntüleme ile bakıldığında kritik micelle konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında son derece ağ morfolojileri benimsemek. TEM görüntüleme, 5.25 milimolar SDS'deki gama PNA montajının yapısal donatmada en önemli azalmalara sahip olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, nanoyapıların toplama eğilimi nedeniyle belirtildiği gibi çözücü bileşimlerini korumak önemlidir.Bu yöntemler uygulayıcıları farklı çözücü bileşimleri, yüzey aktif maddeler ve diğer PNA DNA nanoyapılarının keşfedilmemiş diğer yollarını takip etmeye teşvik eder.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Yüksek Sıralı Nanosheets Peptoid Polimerler ve Self-Meclis Solid-faz Submonomer Sentezi

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Sistem Kurulumu ve Temel İşlemler: Organik Atıklardan Biyogaz haline dönüştürme Anaerobik Digester sürekli karıştırılan

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Domuz Kalbe Yerel Kateter Enjeksiyon için bir Enjekte ve İlaç yüklü Supramoleküler Hidrojel

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Parçalanabilir Thermoresponsive Hydrogels birden fazla uzunluğu ölçeklerde yolu ile reaktif ekstrüzyon, havacilik, kendinden montajlı imalatı ve Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...