Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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我们特别感谢约翰霍普金斯大学医学院的外科、西德尼·金梅尔综合癌症中心的所有成员，感谢他们进行有益的讨论和技术支持。我们还感谢克里斯汀·罗杰斯对双硫化素治疗和 qMSP 程序的慷慨技术指导。

所遵循的所有程序都符合各机构的人类研究伦理委员会的道德标准。这项研究得到了日本大学静冈医院的机构审查委员会的批准，由于回顾性设计，放弃了书面知情同意。
1. 清洗幻灯片
<ol><li>准备 10 μm 未沾污的固定石蜡嵌入 （FFPE） 部分。</li>
	<li>将幻灯片放在玻璃幻灯片架中：使用大约 3~5 个最大的横截面滑梯，除非组织最小，并且需要更多的幻灯片。</li>
	<li>用二甲苯填充滑轨架，并确保幻灯片上的所有组织都被淹没。允许坐15分钟。</li>
	<li>15 分钟后，用带移液器尖端的滑轨将二甲苯倒出，这样幻灯片不会脱落。</li>
	<li>将更多的二甲苯倒入与之前相同的水平。允许再坐15分钟。</li>
	<li>15分钟后，再次倒出二甲苯。</li>
	<li>用 100% 乙醇 （EtOH） 填充滑轨支架，并确保幻灯片上的所有组织全部浸没。允许坐 3 分钟。</li>
	<li>小心地握住幻灯片，然后倒掉 EtOH。使用更多 EtOH 重新填充到同一级别。允许坐2分钟。</li>
	<li>再次向下倒 EtOH 并拆下幻灯片。小心地把它们放在干净的纸巾上晾干。允许坐10分钟。</li>
</ol>2. 刮擦幻灯片
<ol><li>用 650 mL 二乙酰碳酸酯 （DEPC） 处理水、100 mL 乙酰胺乙酸 （EDTA）、50 ml 三氧化三酸 （Tris-HCL） 2 M pH 8.8 和 200 mL 10% 多基硫酸钠 （SDS）（参见材料表） 来准备消化/裂解 缓冲液。</li>
	<li>用 80 μL 消化/解氧缓冲液填充 1.5 mL 一用聚丙烯管（ 参见材料表）。</li>
	<li>将干净的移液器尖端放入缓冲器中。</li>
	<li>根据适当的H&E染色部分，确定最适合大切除的肿瘤区域的癌症组织。 注：大手术的肿瘤区域最好由两名合格的病理学家确定。</li>
	<li>基于标记的 H&E 染色部分的宏观肿瘤组织。<ol>
<li>拿一把干净的剃须刀刀片，轻轻地刮掉幻灯片上癌组织，尽量把它留在一块，以便更容易使用。</li>
		<li>将移液器尖端从一用聚丙烯管中拿出，并用它来将废组织转移到缓冲瓶中（ 参见材料表）。 注：湿尖端应吸引组织，这使得转移更容易。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对幻灯片的其余部分重复步骤 2.5。</li>
	<li>所有组织都在一用聚丙烯管中后，使用尖端确保组织完全浸没，不会粘在管壁上。</li>
	<li>将20μL的亚蒂林相关丝氨酸蛋白酶添加到小瓶中，轻轻轻拂混合（ 参见材料表）。</li>
	<li>将小瓶放在 55 °C 热块中至少 4 小时或过夜。确保2小时后稍微涡旋。</li>
</ol>3. 双硫化治疗
<ol><li>使用消化组织溶液的45μL作为样品。</li>
	<li>根据制造商的说明，使用双硫酸盐转化套件中的试剂进行双硫酸盐处理（ 参见材料表）。<ol>
<li>将 5 μL 稀释缓冲液加入 DNA 样品，在 37 °C 下孵育 15 分钟（ 参见材料表）。</li>
		<li>当样品孵育时，通过将750μL的dH2O和210μL的稀释缓冲液添加到CT转化试剂的一管中（参见材料表）来制备双硫基转化 试剂。通过涡旋混合管10分钟。</li>
		<li>孵育15分钟后，将100μL的制备CT转化试剂加入到每个样品中，然后通过反转混合。</li>
		<li>在黑暗中孵育样品在50°C下12至16小时。</li>
		<li>孵育后，取出样品，放在冰上10分钟。</li>
		<li>添加 400 μL 的装订缓冲液，通过上下移液混合每个样品（ 参见材料表）。将每个样品装入旋转柱，然后将柱放入 2 mL 收集管中（ 参见材料表）。</li>
		<li>全速（10，000 x g）将每个样品离心1分钟，然后丢弃流经。</li>
		<li>将 200 μL 的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转 1 分钟，丢弃流式处理（ 参见材料表）。</li>
		<li>向每列添加 200 μL 脱硫缓冲液，使柱在室温下站立 15 分钟（ 参见材料表）。孵育后，全速旋转柱 1 分钟，然后丢弃流经。</li>
		<li>将 200 μL 的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转 1 分钟（ 参见材料表）。</li>
		<li>重复此步骤一次。</li>
		<li>将 46 μL 的 dH2O 添加到每根柱中，并将每根柱放在新的无菌 1.5 mL 一用聚丙烯管 中（参见材料表）。旋转每个管2分钟，以脱氧核糖核酸。</li>
	</ol>
</li>
	<li>从一用聚丙烯管中取下每个旋转柱并丢弃（ 参见材料表）。DNA现在已准备好进行分析。</li>
</ol>4. 人类基因组中CPG位点DNA甲基化评估阵列平台
<ol><li>使用实时 PCR 扩增和检测仪器的 FFPE QC 检测评估 DNA 质量（质量检查：QC），然后根据制造商的说明进行后续数据分析（ 参见材料表）。 注：如果∆Cq值小于建议的5.0，将进一步处理14。</li>
	<li>使用阵列平台分析样品，以对DNA甲基化进行复杂评估，以评估基因组中+gt;450，000CpG位点的甲基化状态（ 参见材料表）。阵列平台的产品信息表、数据表和产品文件有 15。 注：测定是按照制造商对FFPE材料14的说明进行的。</li>
	<li>在阵列平台的数据分析工具中计算高位和低位甲基化β值，范围分别从 0 到 1（ 参见材料表）。使用市售软件 （参见材料表）计算β值。</li>
	<li>将阵列平台上生成的数据导入R软件环境（R v.2.15.1），并使用分析甲基化阵列16、17的工具进行处理。 注：在使用数据分析工具生成的热图上，列按无监督聚类排序，而行的顺序则基于从上到下差分甲基化 t 统计的递减显著性。</li>
	<li>使用无人监督聚类中的第一个分集器将热图分为高和低甲基化组。 注：对于定量甲基化特异性PCR（qMSP）的验证，选择基于启动子区域中CPG岛较大的β值的基因，并由于其适合qMSP的底注和探针设计。</li>
</ol>5. 定量甲基化特异性PCR（qMSP）
<ol><li>使用步骤3.3中的双硫化物修饰DNA作为qMSP中基于荧光的实时PCR的模板，以评估每个基因分析中启动子区域的甲基化。</li>
	<li>使用 96 井实时 PCR 仪器执行 qMSP（ 参见材料表）。<ol>
<li>使用200 nM正向底向、200 nM反向底土和80 nM探针检查双硫化基因修饰DNA上靶子基因的启动子甲基化状态。使用 16.6 mM （NH4）2SO4 、67mM Tris pH 8.8， 准备主混合， 10 mM β-甲醇，10 nM 荧光素，每脱氧核苷酸三磷酸 0.166 mM，DNA聚合酶 0.04 U/μl（参见材料表）。所有测定的每个井的最终反应量为25μL。</li>
		<li>执行 qMSP 的循环时间如下：95 °C 5 分钟，然后 55 个循环 95 °C 15 s，60°C 循环 1 分钟，72°C 循环 1 分钟。 注：目标基因应基于具有较大β值、与启动子区域中的CpG岛屿相关以及适合qMSP的底注和探针设计的标准进行选择。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用用CpG甲基酶（M.SSSI）处理的人类基因组作为正甲基化控制（ 参见材料表）。 注：甲基化的最终定量定义为相对甲基化值（RMV），并计算为每个甲基化检测复制的2μCt，与β-Actin（ACTB）18的均数Ct相比。底图和探针序列显示在表1 中。Ct 为 100 用于未检测到的复制，该复制的值为 2μCt，接近于零。使用以下公式：均值 2[Ct] （RMV） = （2 =Ct_replicate_1 = 2====Ct_replicate_2============Ct_replicate_3========================================================================================================================================= </li>
</ol>

<ol>
	<li>Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+unfinished+symphony.">Epigenetics: unfinished symphony.</a> Nature. 441 (7090), 143-145 (2006).</li><li>Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+colorectal+cancer:+emerging+biomarkers.">Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers.</a> Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).</li><li>Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+DNA+methylation+in+colorectal+mucosa+and+cancer.">Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer.</a> Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).</li><li>Hsieh, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+the+p16INK4a+promoter+in+colectomy+specimens+of+patients+with+long-standing+and+extensive+ulcerative+colitis.">Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis.</a> Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).</li><li>Ushijima, T., Okochi-Takada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+methylations+in+cancer+cells:+where+do+they+come+from.">Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from.</a> Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).</li><li>Copped&#232;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+biomarkers+of+colorectal+cancer:+Focus+on+DNA+methylation.">Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation.</a> Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).</li><li>Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+and+microRNAs:+new+players+in+the+pathogenesis+of+myelodysplastic+syndromes.">Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes.</a> Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).</li><li>Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+data+analysis+and+its+application+to+cancer+research.">DNA methylation data analysis and its application to cancer research.</a> Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).</li><li>Morris, T. J., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+pipelines+and+packages+for+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip+(450k)+data.">Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data.</a> Methods. 72, 3-8 (2015).</li><li>Rauluseviciute, I., Drabl&#248;s, F., Rye, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+data+by+sequencing:+experimental+approaches+and+recommendations+for+tools+and+pipelines+for+data+analysis.">DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis.</a> Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).</li><li>Cazaly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+the+epigenome+using+data+integration+approaches.">Making sense of the epigenome using data integration approaches.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).</li><li>Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell-free+DNA-based+epigenomic+approaches+for+cancer+detection.">Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).</li><li>Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+methylation+and+expression+profiling+identify+a+novel+epigenetic+signature+in+gastrointestinal+pan-adenocarcinomas.">Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas.</a> Epigenomics. 12 (11), (2020).</li><li>Wong, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translational+epigenetic+studies+involving+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue:+applying+the+Infinium+HumanMethyation450+Beadchip+assay+to+large+population-based+studies.">Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies.</a> BMC Research Notes. 8, 543 (2015).</li><li>. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html">https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html</a> (2020)</li><li>Fackler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+methylation+analysis+identifies+genes+specific+to+breast+cancer+hormone+receptor+status+and+risk+of+recurrence.">Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence.</a> Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).</li><li>Dedeurwaerder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+Infinium+HumanMethylation450+data+processing.">A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing.</a> Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).</li><li>Hulbert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+of+lung+cancer+using+DNA+promoter+hypermethylation+in+plasma+and+sputum.">Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).</li><li>Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+remnant+gastric+cancer+really+differ+from+primary+gastric+cancer?+A+systematic+review+of+the+literature+by+the+Task+Force+of+Japanese+Gastric+Cancer+Association.">Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association.</a> Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).</li><li>Eijsink, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cervical+neoplasia+by+DNA+methylation+analysis+in+cervico-vaginal+lavages,+a+feasibility+study.">Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study.</a> Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+genome-wide+analysis+in+remnant+and+primary+gastric+cancers.">DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers.</a> Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).</li><li>Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+analyzing+DNA+methylation+data+from+Illumina+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip.">A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip.</a> BMC Bioinformatics. 19, 115 (2018).</li><li>Teh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-capture+sequencing+vs.+Infinium+450K+methylation+array+for+methylome+analysis+in+clinical+samples.">Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples.</a> Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).</li><li>Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization,+annotation+and+innovative+use+of+Infinium+DNA+methylation+BeadChip+probes.">Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

从DNA甲基化全基因组分析获得准确结果有三个关键步骤。第一种是肿瘤区域的宏观切除，最好由两名合格的病理学家基于代表性的H&E染色部分。不准确的大手术可导致相邻非癌组织污染，导致结果不可靠;因此，需要仔细的宏观分段。第二是DNA质量评估（质量检查：QC）。未能通过 QC（∆ Cq > 5.0）的样本可能会提供质量差的数据。因此，应删除∆ Cq > 5.0 的样品，并使用其他样本。第三步是计算β值，该值由阵列平台软件的数据分析工具确定为甲基化信号/总（甲基化 + 未甲基化）信号17。该β值范围为 0+1（或 0%~100%），这从生物学上解释 17 。此值的主要问题是其统计性能差，因为它的高异方差意味着甲基化范围极端（β = 0 或 β = 1） 的样本方差高度减少17。此外，由于样品质量差，β值可能不会显示可重复的双相峰22，没有这种峰值的样品应排除在进一步研究之外。此外，目标基因应基于具有较大β值、与启动子区域的CpG岛屿相关以及适合qMSP的底法和探针设计的标准进行选择。
人类基因组中CpG位点DNA甲基化的评估使用基于微阵列的技术进行，并采用固定数量的探针来测量特定的基因组位点。它是表观基因组全关联研究（EWAS）中应用最广泛的方法，由于其成本低，需要的DNA少量，样品处理时间明显短，使得许多临床样品的吞吐量高。然而，单个CpG位点DNA甲基化复杂评估的阵列平台受到表观基因改变位点探针的数量和特异性限制，这会阻止某些基因组区域的探索。WGBS通常被视为金本位方法，因为它的基因组覆盖范围更广，范围10，11。然而，这种方法有相当大的成本和相对较长的处理时间，用于分析大量的样品10，11。因此，它并不总是可行的。相比之下，人类基因组中单个CpG位点DNA甲基化复杂评估阵列平台在成本和基因组覆盖率方面是合理的。最近，最新升级的珠子芯片已准备就绪，可以使用24。这些测定可以帮助我们分析几乎翻倍的CpG位点，从而实现对大量样本群的理想全基因组关联研究（GWAS）。
总之，DNA甲基化全基因组分析与阵列平台，在人类基因组的单个CpG位点进行DNA甲基化的复杂评估，可以提供胃肠道癌表观遗传生物标志物的重要信息。与WGBS相比，该方法具有成本效益，缩短了样品处理时间。因此，这种在CpG位点检测DNA甲基化的方法很可能被广泛应用于表观遗传生物标志物研究。

表观遗传学是指基因功能的遗传性变化，而不改变DNA1的序列。这种变化可能是由于DNA甲基化，其中DNA基座上的甲基组可能通过染色质包装的变化改变基因表达。如果这种效应导致肿瘤抑制基因2的表达改变，则可能发生癌症的发育和进展。衰老和慢性炎症都是癌症的病因，也是人类DNA甲基化变化的主要原因3，4，5。因此，这允许利用DNA甲基化作为癌症诊断的生物标志物，并作为治疗和预防的目标。对于早期发现和癌症预后，DNA甲基化正在肿瘤，血液，尿液和粪便样本6测量，而脱乙基化剂现在用于治疗白血病，如骨髓增生综合征7。
利用阵列平台对人类基因组中单个CpG位点DNA甲基化进行复杂评估的全基因组DNA甲基化分析可用于检测基因组DNA8、9中超过45万CpG位点的甲基化状态，从而可以探索癌症表观遗传学（见材料表）。全基因组异种化测序（WGBS）技术改变了我们在表观遗传学10、11领域的方法。然而，在大量样品10、11的表观遗传分析方面，技术存在一些缺点。因此，阵列平台对于人类基因组中DNA甲基化的复杂评价更为可行。在过去几年中，全基因组甲基化分析方法的可得性有所改进，使我们能够扩大对DNA甲基化如何促进癌症发展和进展12的了解。微阵列平台方法的最新进展为我们提供了全基因组甲基化分析的基本原理，以确定胃肠癌13中的新表观遗传特征。该协议的目标是提供此方法如何用于GI恶性肿瘤中的生物标志物识别的详细说明。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

DNA甲基化是一种重要的表观遗传变化，具有生物学意义，是癌症研究的经常焦点。全基因组DNA甲基化是准确分析胃肠道（GI）恶性肿瘤甲基化状态的有用措施。鉴于DNA甲基化分析的多种潜在转化用途，执业临床医生和其他新进入DNA甲基化研究的人需要能够逐步了解这些全基因组分析是如何进行的。该协议的目标是提供此方法如何用于GI恶性肿瘤中生物标志物识别的详细说明。重要的是，我们描述了在全基因组分析过程中获得准确结果所需的三个关键步骤。清晰而简洁地写，这三种方法往往缺乏，不明显那些新的表观遗传学研究。我们使用48个GI恶性肿瘤（胃癌）样本来强调如何对GI恶性肿瘤进行全基因组DNA甲基化分析。

培训组48名胃癌患者的特点如下（表2）：患者的平均年龄为74岁（52~89岁），其中男性38岁（79.2%）和10名女性（20.8%）。有35名患者（72.9%）原发性胃癌和13例患者（27.1%）与残余胃癌（原发性胃癌：胃中第一次发生非转移性恶性肿瘤;残余胃癌：在未进行胃切除术5年以上后，无论最初切除19的原因， 残胃癌发展为5年以上）。有23名患者（47.9%）淋巴结转移和25名患者（52.1%）没有。首先，所有48个样本（培训组）都加载，用于识别异常值（图1A）。两个样本给出的峰值大于两个标准偏差，这些样本被移除（图1B）。因此，46个样本被DNA促进剂超甲基化聚类。由此产生的热图被分成两组，基于高甲基化和低甲基化（图2）。此热图允许在差分甲基化分析中转录启动位 （TSS） 的 1，500 bp 内可视化前 50 个探头。高和低甲基化组在临床病理因素与侵略性恶性表型不同。也就是说，癌症类型（原发性胃癌：PGC）（p = 0.01， 赔率比 = 9.09 （1.67–50.00））和淋巴结转移（阳性） （p = 0.03， 赔率比 = 6.82 （1.16=40.08）） 的存在，在多变量分析中将临床病理因子用作协变量时，成为重要的独立预测因子 （表 3）.最后，我们确定了EPB41L3基因20、21（表1所示的底片和探针序列），与在微阵列分析中将训练组编成高低甲基化组有强烈关系。利用 qMSP，验证了测试组（126个样本）中EPB41L3的微阵列分析结果。测试组患者的特点见表4。PGC组织中EPB41L3的RMV明显高于单变量分析中残余胃癌（RGC）中的RMV（p = 0.01）（图3A）。同样，淋巴结转移样本中的RMV明显高于无淋巴结转移的样本（p = 0.03）（图3B）。这样，DNA甲基化基因组范围分析可以帮助我们确定特定基因，以描述GI恶性肿瘤患者的某些临床状态。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> 图1：48个样本中的Beta值（培训队列）。所有48个样本（训练组）都加载，并检查了离群值（A）。两个样本的峰值为异常值，这些峰值被移除 （B）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> 图 2：由此产生的热图。其余46个样本由DNA促进剂超甲基化聚类。热图分为高甲基化组和低甲基化组。此热图允许在差分甲基化分析中转录启动位 （TSS） 的 1，500 bp 内可视化前 50 个探头。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> 图3：EPB41L3在原发性胃癌（PGC）与残余性胃癌（RGC）以及淋巴结转移的情况下的相对甲基化值（RMV）。利用qMSP验证了测试组（126个样本）中EPB41L3的微阵列分析结果。（A） 在单变量分析中，PGC组织中EPB41L3的RMV明显高于GCC（p = 0.01）。（B） 同样，淋巴结转移样本中的RMV明显高于无淋巴结转移样本（p = 0.03）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>基因</td>
			<td>前进 5' - 3'</td>
			<td>反向 5' - 3'</td>
			<td>探针</td>
		</tr>
<tr>
<td>B - ACTIN</td>
			<td>标签 Gga Gta Tat Agg Ttg Gg Aag Tt</td>
			<td>Aac Aca Caa AA CAA ACA AA ATT CAC</td>
			<td>[56 - fam] Tgt G Gtg [Zen] Gtg Atg Gag Gtt 标签 [3iabkfq]</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>G Ata Gtg G Ttg Acg C</td>
			<td>Ata A Atc Ccg Acg Aac Ga</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：底图和探针序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>临床病理因素</td>
			<td>变量</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>年龄</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>性别</td>
			<td>男/女</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>类型</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>淋巴结转移</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC：原发性胃癌，RGC：残余胃癌</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 中位数（最小-最大值）</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：48例胃癌患者在培养组的特点。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>P 值</td>
			<td>赔率比率</td>
			<td>95% 置信区间</td>
		</tr>
<tr>
<td>类型 （PGC）</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>淋巴结转移 （+）</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC：原发性胃癌</td>
		</tr>
</tbody></table>表3：高甲基化组（B组）的预测因子。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>临床病理因素</td>
			<td>变量</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>年龄</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>性别</td>
			<td>男/女</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>类型</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>淋巴结转移</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC：原发性胃癌，RGC：残余胃癌</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 中位数（最小-最大值）</td>
		</tr>
</tbody></table>表4：126例胃癌患者在检测组的特点。

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

在这里，我们描述了胃肠道癌症DNA甲基化全基因组分析的程序。该程序与研究基因甲基化模式与导致胃肠癌致癌因素之间的关系的研究有关。

胃肠癌DNA甲基化基因组全谱分析

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

因此，利用LA平台对人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变进行DNA甲基化全基因组分析，可以提供胃肠道癌表观遗传生物标志物的重要信息。虽然这个LA平台用于人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变，但它在成本和基因组覆盖率方面是最佳的。因此，演示这个程序将是Hirotaka莫莫斯，一个研究生从我的实验室。首先，准备10微米未污染的固定石蜡嵌入部分。将幻灯片放在玻璃滑梯架中，并加满盐水，确保幻灯片上的所有组织都被淹没。将幻灯片留在二甲苯中 15 分钟，然后倒出二甲苯，同时用移液器尖端握住幻灯片，这样它们不会脱落。将更多的二甲苯倒入与之前相同的水平，并重复孵育。倒出二甲苯，用100%乙醇填充滑轨架，确保滑梯上的所有组织全部浸没。将幻灯片留在乙醇中三分钟，然后用新鲜乙醇代替乙醇，并允许它们再孵育两分钟。倒掉乙醇并取出幻灯片。小心地把它们放在干净的纸巾上，让它们干燥10分钟。用 80 微升的解液缓冲液填充 1.5 毫升一用聚丙烯管，并在缓冲液中放入干净的移液器尖端。根据适当的H&E染色部分确定肿瘤区域最适合大切除的肿瘤组织的癌症组织，然后根据标记部分对癌症组织进行宏观切除。拿一把干净的剃刀刀片，轻轻地刮掉幻灯片的癌组织，试图把它留在一块。使用移液器尖端将刮伤的组织转移到解液缓冲瓶中。对幻灯片的其余部分重复此过程。所有组织都在管中后，使用尖端确保组织完全被淹没，并且不会粘在墙壁上。将20微升的亚蒂林相关丝氨酸蛋白酶添加到小瓶中，轻轻轻拂混合。将小瓶放在55摄氏度的加热块中至少4小时或过夜，确保两小时后稍微涡流。根据制造商的说明，使用双硫化转化套件对消化组织的 45 微升进行双硫化处理。在样品中加入5微升稀释缓冲液，在37摄氏度下孵育15分钟。同时，在一管CT转化试剂中加入750微升蒸馏水和210微升稀释缓冲液，准备双硫基转化试剂。通过涡旋混合管10分钟，然后将100微升的制备CT转换试剂添加到每个样品中，然后通过反转混合。在黑暗中在50摄氏度下孵育样品12至16小时。孵育后，将样品放在冰上10分钟。添加 400 微升的绑定缓冲液，通过上下移液混合每个样品。将每个样品加载到旋转柱中，然后将柱放入两毫升收集管中。全速离心样品一分钟，然后丢弃流经。将 200 微升的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转一分钟，然后丢弃流式处理。在每个列中添加 200 微升脱硫缓冲液，使柱在室温下站立 15 分钟。孵育后，全速旋转柱一分钟，然后丢弃流经。每次洗涤后，用 200 微升的洗涤缓冲液以全速将柱进行两次清洗。在每个柱子中加入46微升蒸馏水，并将其放在新的无菌1.5毫升一用聚丙烯管中。旋转管两分钟以脱氧核糖核酸并丢弃柱。DNA现在已准备好进行分析。使用双硫化改性DNA作为定量甲基化特异性PCR的模板，在每个基因分析中评估启动子区域的甲基化。将文本手稿中描述的试剂组合在一起，并使用 96 井实时 PCR 仪器运行热循环协议。培训组48名胃癌患者的特点如下。患者的平均年龄为74岁，其中男性38岁，女性10岁。首先，所有48个样本都加载，用于识别异常值。两个样本给出的峰值大于两个标准偏差，这些偏差从其他样本中移出，这些样本被移除。由此产生的热图被分成两组，基于高甲基化和低甲基化。此热图允许在差分甲基化分析中转录启动位点 1，500 个基对内对前 50 个探头进行可视化。当临床病理因子在多变量分析中用作协变量时，癌症的类型和淋巴结转移的存在成为重要的独立预测因素。最后，发现EPB41L3基因与在微阵列分析中将训练组编成高低甲基化组有强烈关系。对试验组EPB41L3的微阵列分析结果进行了定量甲基化特异性PCR的验证。在单变量分析中，PGC组织中EPB41L3的RMV明显高于残余胃癌。同样，淋巴结转移样本中的RGV明显高于无淋巴结转移的样本。因此，根据适当的H&E染色部分，对最适合大手术的癌症组织进行鉴定，才能成功执行此方案。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

无细胞DNA完整性分析尿样中

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

科研

癌症研究

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

在直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

遗传工程小鼠模型的散发性结肠直肠癌

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

全基因组的 rna 干扰筛查以确定调节溶瘤病毒治疗的宿主因素

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

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pT3N0M0 胃癌组织石蜡嵌入幻灯片上的弹性染色

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Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

使用结构DNA改变分析和患者衍生异种移植测试癌症的靶向疗法

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