Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer at JoVE.com

We zijn vooral dankbaar voor alle leden van het departement chirurgie, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center aan de Johns Hopkins University School of Medicine voor nuttige discussies en technische ondersteuning. We danken Kristen Rodgers ook voor de genereuze technische begeleiding bij de procedures voor bisulfite behandeling en qMSP.

Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van de ethische commissie van de instellingen voor menselijk onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Juntendo University Shizuoka Hospital, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd kwijtgescholden vanwege het retrospectieve ontwerp.
1. Het wassen van de glijbanen
<ol><li>Bereid 10 μm van niet-gekleurde formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) secties voor.</li>
	<li>Plaats dia's in een glazen schuifhouder: gebruik ongeveer 3-5 grootste dwarsdoorsnededia's, tenzij het weefsel minimaal is en er meer glijbanen nodig zijn.</li>
	<li>Vul de schuifhouder met xyleen en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan onder water staat. Laat 15 minuten zitten.</li>
	<li>Giet na 15 minuten de xyleen uit met de glijbanen met een pipettepunt, zodat de glijbanen er niet uitvallen.</li>
	<li>Giet in meer xyleen op hetzelfde niveau als voorheen. Laat nog 15 minuten zitten.</li>
	<li>Na 15 minuten, giet de xyleen weer.</li>
	<li>Vul de schuifhouder met 100% ethanol (EtOH) en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan volledig onder water staat. Laat 3 minuten zitten.</li>
	<li>Giet de EtOH af terwijl u de glijbanen zorgvuldig vasthoudt. Bijvullen op hetzelfde niveau met meer EtOH. Laat 2 minuten zitten.</li>
	<li>Giet de EtOH opnieuw af en verwijder de dia. Plaats ze voorzichtig naar boven op een schone papieren handdoek te drogen. Laat 10 minuten zitten.</li>
</ol>2. Schrapen van de dia's
<ol><li>Bereid de digestie/lysebuffer voor met 650 mL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water, 100 mL ethyleenediaminetetraacetisch zuur (EDTA), 50 ml Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 en 200 mL van 10% natrium dodecylsulfaat (SDS) (zie tabel met materialen).</li>
	<li>Vul een polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik van 1,5 mL met 80 μL digestie/lysisbuffer (zie tabel met materialen).</li>
	<li>Doe een schone pipetpunt in de buffer.</li>
	<li>Identificeer kankerweefsels van het tumorgebied dat het meest geschikt is voor macrodissection volgens de juiste H&E-gekleurde sectie. OPMERKING: Het tumorgebied voor macrodissection moet worden geïdentificeerd door bij voorkeur twee gekwalificeerde pathologen.</li>
	<li>Macrodissect kankerweefsel op basis van de gemarkeerde H & E gekleurde sectie.<ol>
<li>Neem een schoon scheermesje en schraap voorzichtig het kankerweefsel van de glijbaan, in een poging om het te houden in een stuk, zodat het gemakkelijker is om mee te werken.</li>
		<li>Neem de pipetpunt uit polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik met buffer en gebruik deze om het afgedankte weefsel over te brengen in de bufferbak (zie Tabel van materialen). LET OP: De natte tip moet het weefsel aantrekken, wat de overdracht gemakkelijker maakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 met de rest van de dia's.</li>
	<li>Na al het weefsel is in eenmalig gebruik polypropyleen buis, gebruik maken van de tip om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig ondergedompeld en is niet vast aan de wand van de buis.</li>
	<li>Voeg 20 μL van een subtilisine-gerelateerde serine protease toe aan de flacon en veeg voorzichtig om te mengen (zie Tabel van Materialen).</li>
	<li>Plaats de flacon minstens 4 uur of 's nachts in een 55 °C-warmteblok. Zorg ervoor dat u iets vortex na 2 uur.</li>
</ol>3. Behandeling met bisulfie
<ol><li>Gebruik 45 μL van de verteerde weefseloplossing als monster.</li>
	<li>Voer de bisulfitebehandeling uit met reagentia in een bisulfite conversiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).<ol>
<li>Voeg 5 μL verdunningsbuffer toe aan het DNA-monster en broed gedurende 15 minuten bij 37 °C (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Terwijl de monsters uitbroeden, bereidt u het bisulfiteconversiereagereagerensagemiddel voor door 750 μL dH2O en 210 μL verdunningsbuffer toe te voegen aan één buis CT-omzettingsreagensage (zie tabel met materialen). Meng de buizen door vortexing voor 10 min.</li>
		<li>Voeg na de incubatie van 15 minuten 100 μL van het voorbereide CT-conversiereagemiddel toe aan elk monster en meng door inversie.</li>
		<li>Broed de monsters in het donker in het donker bij 50 °C gedurende 12 tot 16 uur.</li>
		<li>Verwijder na de incubatie de monsters en leg 10 minuten op ijs.</li>
		<li>Voeg 400 μL bindende buffer toe en meng elk monster door op en neer te pipetten (zie tabel met materialen). Laad elk monster in een draaikolom en plaats de kolom in een verzamelbuis van 2 mL (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Centrifugeren elk monster op volle snelheid (10.000 x g)gedurende 1 min en gooi de doorstroom weg.</li>
		<li>Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Voeg 200 μL desulfonatiebuffer toe aan elke kolom en laat de kolom 15 min op kamertemperatuur staan (zie Tabel met materialen). Na de incubatie draait u de kolommen gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg.</li>
		<li>Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai 1 min op volle snelheid (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Herhaal deze stap nog een keer.</li>
		<li>Voeg 46 μL dH2O toe aan elke kolom en plaats elke kolom in een nieuwe steriele 1,5 mL polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik (zie tabel met materialen). Draai elke buis 2 minuten om het DNA te ontwijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder elke draaikolom uit de polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik en gooi deze weg (zie tabel met materialen). Het DNA is nu klaar voor de analyse.</li>
</ol>4. Array platform voor de evaluatie van DNA-methylatie op een CpG locus in het menselijk genoom
<ol><li>Beoordeel de kwaliteit van DNA (kwaliteitscontrole: QC) met behulp van FFPE QC-test op een real-time PCR-versterkings- en detectie-instrument, met latere gegevensanalyse uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikanten (zie Tabel van materialen). LET OP: Monsters met ∆Cq-waarden lager dan de aanbevolen 5.0 worden verder verwerkt14.</li>
	<li>Analyseer monsters met een arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie om de methylatiestatus van >450.000 CpG-sites in het genoom te beoordelen (zie Tabel van materialen). Productinformatieblad, gegevensblad en productbestanden voor het arrayplatform zijnbeschikbaar 15. OPMERKING: De test wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant voor FFPE-materiaal14.</li>
	<li>Bereken hoge en lage locusmethylatie in een data-analysetool voor een arrayplatform als β-waarde, met een bereik van respectievelijk 0 tot 1 (zie Tabel met materialen). Gebruik commercieel beschikbare software (zie Tabel van materialen)om een β-waarde te berekenen.</li>
	<li>Importeer gegevens die op het arrayplatform worden gegenereerd voor complexe evaluatie van DNA-methylatieplatform in de R-softwareomgeving (R v.2.15.1) en verwerk ze met behulp van een tool voor het analyseren van methylatiearrays16,17. OPMERKING: Op de heatmap, die wordt gegenereerd met behulp van een data-analyse tool, kolommen worden besteld door onbewaakte clustering, terwijl de volgorde van rijen is gebaseerd op de afnemende betekenis van de t-statistiek voor differentiële methylatie van boven naar beneden.</li>
	<li>Verdeel de heatmap in hoge en lage methylatiegroepen met behulp van de eerste differentiator in de onbewaakte clustering. OPMERKING: Voor validatie met kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP), kies genen op basis van een grotere β-waarde in relatie tot CpG-eilanden in de promotor regio, en vanwege hun geschiktheid voor primer en sonde ontwerp voor qMSP.</li>
</ol>5. Kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP)
<ol><li>Gebruik het bisulfie-gemodificeerde DNA van stap 3.3 als sjabloon voor op fluorescentie gebaseerde real-time PCR in qMSP om methylatie van het promotorgebied in elke genanalyse te evalueren.</li>
	<li>Voer qMSP uit met behulp van een 96-goed Real-Time PCR-instrument (zie tabel met materialen).<ol>
<li>Controleer op de promotor methylatie status van het doelgen op de bisulfite-gemodificeerde DNA met behulp van 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, en 80 nM sondes. Bereid de mastermix voor met 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluoresceïne, 0,166 mM van elk deoxynucleotide struikelfosfaat en 0,04 U/μl DNA-polymerase (zie tabel met materialen). Het uiteindelijke reactievolume in elke put voor alle tests is 25 μL.</li>
		<li>Het fietsen van qMSP als volgt uitvoeren: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 55 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 min en 72 °C gedurende 1 min. OPMERKING: Doelgen moet worden gekozen op basis van de criteria van het hebben van grotere bètawaarden, die gerelateerd zijn aan CpG-eilanden in het promotorgebied en geschikt zijn voor primer- en sondeontwerp voor qMSP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik Human genomic behandeld met CpG Methylase (M.SssI) als een positieve methylatie controle (zie Tabel van materialen). OPMERKING: De uiteindelijke kwantificering van methylatie wordt gedefinieerd als de relatieve methylatiewaarde (RMV) en berekend als 2–ΔΔCt voor elke methylatiedetectiereplicatie in vergelijking met de gemiddelde Ct voor β-Actin (ACTB)18. Primer- en sondesequenties worden weergegeven in tabel 1. Een Ct van 100 wordt gebruikt voor onopgemerkte replicaties, wat een waarde van 2–ΔΔCt dicht bij nul geeft. De volgende formule wordt gebruikt: gemiddelde 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+unfinished+symphony.">Epigenetics: unfinished symphony.</a> Nature. 441 (7090), 143-145 (2006).</li><li>Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+colorectal+cancer:+emerging+biomarkers.">Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers.</a> Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).</li><li>Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+DNA+methylation+in+colorectal+mucosa+and+cancer.">Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer.</a> Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).</li><li>Hsieh, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+the+p16INK4a+promoter+in+colectomy+specimens+of+patients+with+long-standing+and+extensive+ulcerative+colitis.">Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis.</a> Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).</li><li>Ushijima, T., Okochi-Takada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+methylations+in+cancer+cells:+where+do+they+come+from.">Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from.</a> Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).</li><li>Copped&#232;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+biomarkers+of+colorectal+cancer:+Focus+on+DNA+methylation.">Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation.</a> Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).</li><li>Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+and+microRNAs:+new+players+in+the+pathogenesis+of+myelodysplastic+syndromes.">Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes.</a> Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).</li><li>Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+data+analysis+and+its+application+to+cancer+research.">DNA methylation data analysis and its application to cancer research.</a> Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).</li><li>Morris, T. J., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+pipelines+and+packages+for+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip+(450k)+data.">Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data.</a> Methods. 72, 3-8 (2015).</li><li>Rauluseviciute, I., Drabl&#248;s, F., Rye, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+data+by+sequencing:+experimental+approaches+and+recommendations+for+tools+and+pipelines+for+data+analysis.">DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis.</a> Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).</li><li>Cazaly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+the+epigenome+using+data+integration+approaches.">Making sense of the epigenome using data integration approaches.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).</li><li>Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell-free+DNA-based+epigenomic+approaches+for+cancer+detection.">Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).</li><li>Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+methylation+and+expression+profiling+identify+a+novel+epigenetic+signature+in+gastrointestinal+pan-adenocarcinomas.">Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas.</a> Epigenomics. 12 (11), (2020).</li><li>Wong, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translational+epigenetic+studies+involving+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue:+applying+the+Infinium+HumanMethyation450+Beadchip+assay+to+large+population-based+studies.">Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies.</a> BMC Research Notes. 8, 543 (2015).</li><li>. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html">https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html</a> (2020)</li><li>Fackler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+methylation+analysis+identifies+genes+specific+to+breast+cancer+hormone+receptor+status+and+risk+of+recurrence.">Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence.</a> Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).</li><li>Dedeurwaerder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+Infinium+HumanMethylation450+data+processing.">A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing.</a> Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).</li><li>Hulbert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+of+lung+cancer+using+DNA+promoter+hypermethylation+in+plasma+and+sputum.">Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).</li><li>Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+remnant+gastric+cancer+really+differ+from+primary+gastric+cancer?+A+systematic+review+of+the+literature+by+the+Task+Force+of+Japanese+Gastric+Cancer+Association.">Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association.</a> Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).</li><li>Eijsink, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cervical+neoplasia+by+DNA+methylation+analysis+in+cervico-vaginal+lavages,+a+feasibility+study.">Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study.</a> Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+genome-wide+analysis+in+remnant+and+primary+gastric+cancers.">DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers.</a> Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).</li><li>Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+analyzing+DNA+methylation+data+from+Illumina+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip.">A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip.</a> BMC Bioinformatics. 19, 115 (2018).</li><li>Teh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-capture+sequencing+vs.+Infinium+450K+methylation+array+for+methylome+analysis+in+clinical+samples.">Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples.</a> Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).</li><li>Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization,+annotation+and+innovative+use+of+Infinium+DNA+methylation+BeadChip+probes.">Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn drie kritieke stappen in het verkrijgen van nauwkeurige resultaten van DNA-methylatie genoom-brede analyse. De eerste is macrodissection van een tumorgebied door bij voorkeur twee gekwalificeerde pathologen op basis van representatieve H&E gekleurde secties. Onnauwkeurige macrodissection kan besmetting veroorzaken met aangrenzende niet-kankerweefsels, wat onbetrouwbare resultaten oplevert; dus, zorgvuldige macrodissection is vereist. De tweede is de beoordeling van de DNA-kwaliteit (kwaliteitscontrole: QC). Monsters die niet de QC (∆Cq > 5.0) kunnen geven slechte kwaliteit gegevens. Daarom moeten monsters met ∆Cq > 5.0 worden verwijderd en andere worden gebruikt. De derde stap is de berekening van de β-waarde, die wordt bepaald door een data-analyse tool voor de array platform software als de gemethyleerde signaal / het totale (gemethyleerde + onmetide) signaal17. De β-waarde varieert van 0-1 (of 0%-100%), wat eenvoudig biologisch te interpreteren is17. Het belangrijkste probleem met deze waarde is de slechte statistische eigenschappen, omdat de hoge heteroscedasticiteit impliceert dat variantie tussen monsters bij methylatiebereik extremen (β = 0 of β = 1) sterk is verminderd17. Bovendien mogen β-waarden wegens slechte monsterkwaliteit geen reproduceerbare bifasische pieken22vertonen , en moeten monsters zonder dergelijke pieken van verder onderzoek worden uitgesloten. Bovendien moet doelgen worden gekozen op basis van de criteria van het hebben van grotere bètawaarden, die gerelateerd zijn aan CpG-eilanden in het promotorgebied en geschikt zijn voor primer- en sondeontwerp voor qMSP.
Evaluatie van DNA-methylatie op een CpG locus in het menselijk genoom wordt uitgevoerd met behulp van microarray-gebaseerde technologie met een vast aantal sondes om specifieke genomische loci te onderzoeken. Het is de meest gebruikte methode in epigenome-brede associatie studies (EWAS) vanwege de lage kosten, kleine hoeveelheid DNA nodig, en aanzienlijk kortere monster verwerkingstijd, die een hoge doorvoer verwerking van veel klinische monsters23mogelijk maakt. Echter, een array platform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG locus wordt beperkt door het aantal en de specificiteit van sondes voor epigenetisch veranderde loci, die verkenning van sommige genomische regio's voorkomt. WGBS wordt over het algemeen gezien als de gouden standaardmethode vanwege het bredere spectrum van genomische dekking10,11. Deze methode heeft echter aanzienlijke kosten en een relatief lange verwerkingstijd voor de analyse van een groot aantal monsters10,11. Het is dus niet altijd haalbaar. Ter vergelijking, het array platform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG locus in het menselijk genoom is redelijk voor gebruik in termen van kosten en genomische dekking. Onlangs hebben de nieuwste verbeterde kraal chips gekregen klaar om te gebruiken24. Deze testen kunnen ons helpen bij het analyseren van bijna dubbel gemeten CpG-sites, die een ideale genoombrede associatiestudie (GWAS) kunnen bereiken voor grote steekproefpopulaties.
Samengevat kan DNA-methylatie genoombrede analyse met het arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG-locus in het menselijk genoom belangrijke informatie verschaffen over epigenetische biomarkers bij maag-darmkanker. In vergelijking met WGBS is deze methode kosteneffectief en vermindert de verwerkingstijd van de steekproef. Daarom is deze methode voor de detectie van DNA-methylatie op een CpG locus is waarschijnlijk op grote schaal worden gebruikt in epigenetische biomarker onderzoek.

Epigenetica verwijst naar erfelijke veranderingen in de genfunctie zonder wijziging van de sequentie van DNA1. Dergelijke veranderingen kunnen te wijten zijn aan DNA-methylatie, waarbij methylgroepen op een DNA-basis de genexpressie kunnen veranderen door veranderingen in chromatineverpakking. Kankerontwikkeling en progressie kunnen optreden als dit effect resulteert in een veranderde expressie van tumorsuppressorgenen2. Veroudering en chronische ontsteking zijn beide oorzaken van kanker en de belangrijkste redenen voor veranderingen in DNA-methylatie bij mensen3,4,5. Bijgevolg maakt dit het gebruik van DNA-methylatie als biomarker in de diagnose van kanker mogelijk, en als doelwit voor behandeling en preventie. Voor vroegtijdige opsporing en kankerprognose worden DNA-methylatie gemeten in tumor-, bloed-, urine- en ontlastingsmonsters6, terwijl demethylerende middelen nu worden gebruikt voor de behandeling van leukemie zoals myelodysplastisch syndroom7.
Genoombrede DNA-methylatieanalyse met behulp van een arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie bij een individuele CpG-locus in het menselijk genoom kan worden gebruikt om de methylatiestatus van meer dan 450.000 CpG-sites in genomisch DNA8,9,die verkenning van kankerepiden ( zie Tabel van Materialen) mogelijk maakt te onderzoeken. Hele genoombiulfie sequencing (WGBS) technologieën hebben onze benaderingen op het gebied van epigenetica10,11veranderd. Er zijn echter enkele nadelen aan de technologieën in termen van een aanzienlijke kosten - en verwerkingstijd voor de epigenetische analyse van een groot aantal monsters10,11. Daarom is het arrayplatform haalbaarder voor complexe evaluatie van DNA-methylatie in het menselijk genoom. De beschikbaarheid van benaderingen voor genoombrede methylatieanalyses is de afgelopen jaren verbeterd en stelt ons in staat om onze kennis uit te breiden over hoe DNA-methylatie bijdraagt aan de ontwikkeling van kanker en progressie12. Recente vooruitgang in microarray-platform benaderingen bieden ons de reden voor genoom-brede methylatie analyse om een nieuwe epigenetische handtekening in gastro-intestinale kankers te identificeren13. Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving van hoe deze methode wordt gebruikt voor biomarker identificatie in GI maligniteiten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische verandering die biologisch zinvol is en een frequente focus van kankeronderzoek. Genoombrede DNA-methylatie is een nuttige maatregel om een nauwkeurige analyse te geven van de methylatiestatus van gastro-intestinale (GI) maligniteiten. Gezien de vele potentiële translationele toepassingen van DNA-methylatieanalyse, moeten praktiserende clinici en anderen die nieuw zijn bij DNA-methylatiestudies stap voor stap kunnen begrijpen hoe deze genoombrede analyses worden uitgevoerd. Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving te geven van hoe deze methode wordt gebruikt voor de biomarker-identificatie in GI-maligniteiten. Belangrijk is dat we drie kritieke stappen beschrijven die nodig zijn om nauwkeurige resultaten te verkrijgen tijdens genoombrede analyse. Duidelijk en beknopt geschreven, deze drie methoden ontbreken vaak en niet merkbaar aan die nieuw voor epigenetische studies. We gebruikten 48 monsters van een GI maligniteit (maagkanker) om praktisch te benadrukken hoe genoom-brede DNA-methylatie analyse kan worden uitgevoerd voor GI maligniteiten.

De kenmerken van 48 patiënten met maagkanker in het opleidingscohort zijn als volgt (Tabel 2): de mediane leeftijd van patiënten was 74 jaar (52-89 jaar), en het cohort omvatte 38 mannetjes (79,2%) en 10 vrouwen (20,8%). Er waren 35 patiënten (72,9%) primaire maagkanker en bij 13 patiënten (27,1%) met restkanker (primaire maagkanker: eerste optreden van een niet-gemetastaseerde maligniteit in de maag; restant maagkanker: kanker in de rest maag die zich meer dan 5 jaar na destalige gastrectomie ontwikkelde, ongeacht de reden voor de oorspronkelijke resectie19). Er waren 23 patiënten (47,9%) met lymfekliermetastase en 25 patiënten (52,1%) Zonder. Ten eerste werden alle 48 monsters (het trainingscohort) geladen voor de identificatie van uitschieters (figuur 1A). Twee monsters gaven pieken die groter waren dan twee standaarddeviaties verplaatst van de anderen, en deze monsters werden verwijderd (Figuur 1B). Daarom werden 46 monsters geclusterd door DNA-promotor hypermethylatie. De resulterende heatmap werd verdeeld in twee groepen op basis van hoge en lage methylatie (figuur 2). Deze heatmap maakt visualisatie van de top 50 sondes binnen 1.500 bp van de transcriptie start site (TSS) in de differentiële methylatie analyse. De hoge en lage methylatiegroepen verschilden in clinicopathologische factoren die verband hielden met een agressief kwaadaardig fenotype. Dat wil zeggen, de vorm van kanker (primaire maagkanker: PGC) (p = 0,01, odds ratio = 9,09 (1,67–50,00)) en aanwezigheid van lymfekliermetastase (positief) (p = 0,03, odds ratio = 6,82 (1,16–40,08)) ontdoken als significante onafhankelijke voorspellende factoren toen de clinicopathologische factoren werden gebruikt als covariaten in multivariate analyse (tabel 3). Ten slotte hebben we het EPB41L3-gen20,21 (primer- en sondesequenties in tabel 1)geïdentificeerd om sterk geassocieerd te worden met het codificeren van het trainingscohort in hoge en lage methylatiegroepen in de microarray-analyse. Met behulp van qMSP werden de resultaten van de microarray-analyse voor EPB41L3 in het testcohort (126 monsters) gevalideerd. De kenmerken van de patiënten in het testcohort zijn weergegeven in tabel 4. MPV's van EPB41L3 in PGC-weefsels waren aanzienlijk hoger dan die bij restkanker (RGC) in univariate analyse (p = 0,01) (figuur 3A). Evenzo waren MPV's in monsters met lymfekliermetastase aanzienlijk hoger dan die zonder lymfekliermetastase (p = 0,03) (figuur 3B). Op deze manier kan DNA-methylatie genoombrede analyse ons helpen om specifieke genen te identificeren om bepaalde klinische status te karakteriseren bij patiënten met GI-maligniteiten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> Figuur 1: Bètawaarden in 48 monsters (trainingscohort). Alle 48 monsters (trainingscohort) werden geladen en uitschieters werden onderzocht (A). Twee monsters hadden pieken die uitschieters waren, en deze werden verwijderd (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> Figuur 2: De resulterende heatmap. De overige 46 monsters werden geclusterd door DNA promotor hypermethylatie. De heatmap was verdeeld in hoge en lage methylatiegroepen. Deze heatmap maakt visualisatie van de top 50 sondes binnen 1.500 bp van de transcriptie start site (TSS) in de differentiële methylatie analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> Figuur 3: Relatieve methylatiewaarden (KMV's) voor EPB41L3 bij primaire maagkanker (PGC) vs. restant maagkanker (RGC), en in gevallen met en zonder lymfekliermetastase. De resultaten van microarray-analyse voor EPB41L3 in het testcohort (126 monsters) werden gevalideerd met behulp van qMSP. (A) In univariate analyse waren de MPV's van EPB41L3 in PGC-weefsels aanzienlijk hoger dan die in RGC (p = 0,01). (B) Evenzo waren MPV's in monsters met lymfekliermetastase aanzienlijk hoger dan bij m'n metastasase zonder lymfeklier (p = 0,03). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gen</td>
			<td>Vooruit 5' - 3'</td>
			<td>Reverse 5' - 3'</td>
			<td>Sonde</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-ACTIN</td>
			<td>TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT</td>
			<td>AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC</td>
			<td>\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABKFQ\</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG C</td>
			<td>ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer en sonde sequenties.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Clinicopathologische factoren</td>
			<td>Variabelen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leeftijd</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geslacht</td>
			<td>Man / Vrouw</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymfekliermetastase</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Primaire maagkanker, RGC: Restant maagkanker</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Mediaan (minimum-maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: De kenmerken bij 48 patiënten met maagkanker in het trainingscohort.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>P-waarde</td>
			<td>Verhouding kansen</td>
			<td>95% Betrouwbaarheidsinterval</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type (PGC)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymfekliermetastase (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC: Primaire maagkanker</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Voorspellende factoren voor de hoge methylatiegroep (cluster B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Clinicopathologische factoren</td>
			<td>Variabelen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leeftijd</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geslacht</td>
			<td>Man / Vrouw</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymfekliermetastase</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Primaire maagkanker, RGC: Restant maagkanker</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Mediaan (minimum-maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: De kenmerken bij 126 patiënten met maagkanker in het testcohort.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer at JoVE.com

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Hierin beschrijven we een procedure voor genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag-darmkanker. De procedure is van belang voor studies die onderzoeken relaties tussen methylatiepatronen van genen en factoren die bijdragen aan carcinogenese bij maag-darmkanker.

Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Dus DNA-methylatie genoom-brede analyse met de LA platform voor complexe aberratie van DNA-methylatie in het menselijk genoom kan belangrijke informatie van epigenetische biomarkers in gastro-intestinale kanker. Hoewel dit LA-platform voor complexe aberratie van DNA-methylatie in het menselijk genoom, is het optimaal in termen van kosten en genomische dekking. Dus het aantonen van de procedure zal Hirotaka Momose zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om te beginnen, bereiden 10 micrometer van niet-gekleurde formaline-vaste paraffine ingebedde secties. Plaats de glijbanen in een glazen schuifhouder en vul deze met zout, zodat al het weefsel op de glijbaan onder water staat. Laat de glijbanen 15 minuten in xyleen staan en giet de xyleen uit terwijl u de glijbanen vasthoudt met een pipetpunt, zodat ze er niet uitvallen.Giet in meer xyleen op hetzelfde niveau als voorheen en herhaal de incubatie. Giet de xyleen uit en vul de schuifhouder met 100% ethanol, zodat al het weefsel op de glijbaan volledig onder water staat. Laat de dia's in de ethanol voor drie minuten, vervang dan de ethanol met verse ethanol en laat ze incubeer voor twee minuten.Giet de ethanol af en verwijder de glijbanen. Leg ze voorzichtig naar boven op een schone papieren handdoek en laat ze 10 minuten drogen. Vul een 1,5 milliliter polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik met 80 microliter lysebuffer en steek een schone pipetpunt in de buffer.Identificeer kankerweefsels van het tumorgebied dat het meest geschikt is voor macrodissection volgens de juiste H&E-gekleurde sectie, en macrodissect het kankerweefsel op basis van de gemarkeerde sectie. Neem een schoon scheermesje en schrap het kankerweefsel voorzichtig van de glijbaan en probeer het in één stuk te houden. Gebruik de pipetpunt om het geschraapte weefsel over te brengen in de lysebuffer flacon.Herhaal dit proces met de rest van de dia's. Na al het weefsel is in de buis, gebruik maken van de tip om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig was ondergedompeld en is niet vast aan de muur. Voeg 20 microliter van een subtilisine-gerelateerde serine protease toe aan de flacon en veeg voorzichtig om te mengen.Plaats de flacon in een 55 graden Celsius warmteblok voor ten minste vier uur of 's nachts, zorg ervoor dat iets vortex na twee uur. Voer de bisulfite behandeling uit op 45 microliters van het verteerde weefsel met behulp van een bisulfite conversie kit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vijf microliter verdunningsbuffer toe aan het monster en broed het gedurende 15 minuten uit bij 37 graden Celsius.Bereid ondertussen het bisulfite conversiereagemiddel voor door 750 microliter gedestilleerd water en 210 microliter verdunningsbuffer toe te voegen aan één buis CT-conversiereageagemiddel. Meng de buizen door vortexing voor 10 minuten, voeg vervolgens 100 microliter van de voorbereide CT conversie reagens aan elk monster en meng door inversie. Incubeer de monsters in het donker op 50 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur.Na de incubatie, plaats de monsters op ijs gedurende 10 minuten. Voeg 400 microliters bindende buffer toe en meng elk monster door op en neer te pipetten. Laad elk monster in een spinkolom en plaats de kolom in een verzamelbuis van twee milliliter.Centrifugeren de monsters op volle snelheid gedurende een minuut en gooi de flow-through. Voeg 200 microliters wasbuffer toe aan elke kolom en draai één minuut op volle snelheid en gooi de flow-through weg. Voeg 200 microliters desulfonatiebuffer toe aan elke kolom en laat de kolommen 15 minuten op kamertemperatuur staan.Na de incubatie draait u de kolommen gedurende één minuut op volle snelheid en gooi de doorstroom weg. Was de kolom twee maal met 200 microliters wasbuffercentrifuging gedurende een minuut op volle snelheid na elke wasbeurt. Voeg 46 microliter gedestilleerd water toe aan elke kolom en plaats het in een nieuwe steriele 1,5 milliliter polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik.Draai de buizen twee minuten om het DNA te ontwijken en gooi de kolom weg. Het DNA is nu klaar voor de analyse. Gebruik het bisulfie gemodificeerde DNA als sjabloon voor kwantitatieve methylatiespecifieke PCR om de methylatie van het promotorgebied in elke genanalyse te evalueren.Combineer de reagentia zoals beschreven in het tekstmanuscript en gebruik een 96-goed real-time PCR-instrument om het thermofietsprotocol uit te voeren. De kenmerken van 48 patiënten met maagkanker in het trainingscohort worden hier getoond. De gemiddelde leeftijd van de patiënten was 74 jaar en het cohort omvatte 38 mannen en 10 vrouwtjes.Ten eerste werden alle 48 monsters geladen voor de identificatie van uitschieters. Twee monsters gaven pieken die groter waren dan twee standaarddeviaties verplaatst van de anderen en deze monsters werden verwijderd. De resulterende warmtekaart werd verdeeld in twee groepen op basis van hoge en lage methylatie.Deze warmtekaart maakt visualisatie van de top 50 sondes binnen 1, 500 basisparen van de transcriptie startsite in de differentiële methylatieanalyse mogelijk. Het type kanker en de aanwezigheid van lymfekliermetastase kwamen naar voren als significante onafhankelijke voorspellende factoren wanneer de klinische pathologische factoren werden gebruikt als covariaten in de multivariate analyse. Ten slotte bleek het EPB41L3-gen sterk geassocieerd te zijn met het codificeren van het trainingscohort in hoge en lage methylatiegroepen in de microarray-analyse.De resultaten van de microarray-analyse voor EPB41L3 in het testcohort werden gevalideerd met kwantitatieve methylatiespecifieke PCR. MMU's van EPB41L3 in PGC-weefsels waren aanzienlijk hoger dan die in restdierkanker in univariate analyse. Ook RMU's in monsters met lymfekliermetastase waren aanzienlijk hoger dan die zonder lymfekliermetastase.Dus identificatie op kankerweefsel meest geschikt voor macrodissection volgens de juiste H & E gekleurde sectie is vereist om met succes dit protocol uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Met behulp van hoge resolutie echografie naar Monitor Tumor ontstaan en groei in genetisch gemanipuleerde alvleesklierkanker modellen

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...