Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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Nous sommes particulièrement reconnaissants à tous les membres du Département de chirurgie, le Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center de la Johns Hopkins University School of Medicine pour des discussions utiles et un soutien technique. Nous remercions également Kristen Rodgers pour les conseils techniques généreux sur les procédures de traitement de la bisulfite et qMSP.

Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité d’éthique de la recherche humaine des institutions. L’étude a été approuvée par la Commission d’examen institutionnel de l’hôpital de Shizuoka de l’Université Juntendo, et le consentement éclairé écrit a été annulé en raison de la conception rétrospective.
1. Laver les toboggans
<ol><li>Préparer 10 μm de sections non tachées de paraffine fixe à la paraffine (FFPE).</li>
	<li>Placez les glissières dans un porte-glissière en verre : utilisez environ 3 à 5 plus grandes diapositives transversales à moins que le tissu ne soit minimal et qu’il y ait plus de diapositives nécessaires.</li>
	<li>Remplissez le support de diapositives de xylène et assurez-vous que tous les tissus de la glissière sont submergés. Laisser reposer pendant 15 min.</li>
	<li>Après 15 min, versez le xylène avec les glissières maintenues avec une pointe de pipette de sorte que les glissières ne tombent pas.</li>
	<li>Verser plus de xylène au même niveau qu’auparavant. Laisser reposer encore 15 min.</li>
	<li>Après 15 min, verser à nouveau le xylène.</li>
	<li>Remplissez le support de la glissière avec 100% d’éthanol (EtOH), et assurez-vous que tous les tissus de la lame sont complètement submergés. Laisser reposer pendant 3 min.</li>
	<li>Versez l’EtOH tout en tenant soigneusement les glissières. Rechargez au même niveau avec plus d’EtOH. Laisser reposer pendant 2 min.</li>
	<li>Versez l’EtOH à nouveau et retirez la lame. Placez-les soigneusement face vers le haut sur une serviette en papier propre pour sécher. Laisser reposer pendant 10 min.</li>
</ol>2. Racler les diapositives
<ol><li>Préparer le tampon digestion/lyse avec 650 mL d’eau traitée au déthylpyrocarbonate (DEPC), 100 ml d’acide éthylèneediaminetetraacetic (EDTA), 50 ml d’hydrochlorure de Tris (Tris-HCL) 2 M pH 8,8 et 200 ml de sulfate de dodédecyl de sodium (SDS) (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Remplissez un tube de polypropylène à usage unique de 1,5 mL avec 80 μL de tampon digestion/lyse (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Mettez une pointe de pipette propre dans le tampon.</li>
	<li>Identifiez les tissus cancéreux de la zone tumorale les plus appropriés pour la macrodissection selon la section tachée appropriée de H&E. NOTE : La zone de tumeur pour la macrodissection devrait être identifiée par de préférence deux pathologistes qualifiés.</li>
	<li>Macrodissect tissu cancéreux basé sur la section marquée H & E tachée.<ol>
<li>Retirez une lame de rasoir propre et grattez doucement le tissu cancéreux de la lame, en essayant de le garder en un seul morceau afin qu’il soit plus facile de travailler avec.</li>
		<li>Sortez la pointe pipette du tube de polypropylène à usage unique contenant du tampon et utilisez-le pour transférer le tissu mis au rebut dans le flacon tampon (voir tableau des matériaux). REMARQUE : La pointe humide devrait attirer le tissu, ce qui facilite le transfert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’étape 2.5 avec le reste des diapositives.</li>
	<li>Après que tout le tissu est dans le tube à usage unique de polypropylène, utilisez la pointe pour s’assurer que le tissu est complètement submergé et n’est pas collé à la paroi du tube.</li>
	<li>Ajouter 20 μL d’une protéase de sérine liée à la subtilisine au flacon et feuilleter doucement pour mélanger (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Placer le flacon dans un bloc thermique de 55 °C pendant au moins 4 h ou toute la nuit. Assurez-vous de vortex légèrement après 2 h.</li>
</ol>3. Traitement à la bisulfite
<ol><li>Utilisez 45 μL de la solution tissulaire digérée comme échantillon.</li>
	<li>Effectuer le traitement à la bisulfite à l’aide de réacoagants dans un kit de conversion de bisulfite selon les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Ajouter 5 μL de tampon de dilution à l’échantillon d’ADN et incuber à 37 °C pendant 15 min (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Pendant que les échantillons couvent, préparez le réagencé de conversion de bisulfite en ajoutant 750 μL de dH2O et 210 μL de tampon de dilution à un tube de réagencé de conversion CT (voir tableau des matériaux). Mélanger les tubes en tourbillonnant pendant 10 min.</li>
		<li>Après l’incubation de 15 min, ajouter 100 μL du réageni de conversion CT préparé à chaque échantillon et mélanger par inversion.</li>
		<li>Incuber les échantillons dans l’obscurité à 50 °C pendant 12 à 16 h.</li>
		<li>Après l’incubation, retirer les échantillons et les placer sur la glace pendant 10 minutes.</li>
		<li>Ajouter 400 μL de tampon de liaison et mélanger chaque échantillon en pipetting de haut en bas (voir tableau des matériaux). Chargez chaque échantillon dans une colonne de spin et placez la colonne dans un tube de collecte de 2 mL (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Centrifugeuse chaque échantillon à pleine vitesse (10.000 x g) pendant 1 min et jeter le flux à travers.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon de lavage à chaque colonne et tourner à pleine vitesse pendant 1 min, en jetant le flux à travers (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon de désulfonation à chaque colonne et permettre à la colonne de se tenir à température ambiante pendant 15 min (voir tableau des matériaux). Après l’incubation, faire tourner les colonnes à pleine vitesse pendant 1 min et jeter le flux à travers.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon de lavage à chaque colonne et tourner à pleine vitesse pendant 1 min (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Répétez cette étape une fois de plus.</li>
		<li>Ajouter 46 μL de dH2O à chaque colonne et placer chaque colonne dans un nouveau tube stérile de polypropylène à usage unique de 1,5 mL (voir tableau des matériaux). Faire tourner chaque tube pendant 2 min pour élucider l’ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez chaque colonne de spin du tube de polypropylène à usage unique et jetez-les (voir tableau des matériaux). L’ADN est maintenant prêt pour l’analyse.</li>
</ol>4. Plate-forme de tableau pour l’évaluation de la méthylation d’ADN à un locus de CpG dans le génome humain
<ol><li>Évaluer la qualité de l’ADN (vérification de la qualité : QC) à l’aide de l’analyse FFPE QC sur un instrument d’amplification et de détection pcr en temps réel, avec une analyse ultérieure des données effectuée selon les instructions des fabricants (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Les échantillons ∆Cq valeurs inférieures aux 5,0 recommandés sont traités14.</li>
	<li>Analyser les échantillons avec une plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN pour évaluer l’état de méthylation de >450.000 sites CpG dans le génome (voir tableau des matériaux). La fiche d’information sur les produits, la fiche de données et les fichiers produits de la plate-forme array sontdisponibles 15. REMARQUE : L’analyse est effectuée conformément aux instructions du fabricant pour le matériel FFPE14.</li>
	<li>Calculez la méthylation élevée et faible du locus dans un outil d’analyse de données pour une plate-forme de tableau en tant que β-valeur, avec une fourchette de 0 à 1, respectivement (voir tableau des matériaux). Utilisez un logiciel disponible dans le commerce (voir tableau desmatériaux) pour calculer β valeur ajoutée.</li>
	<li>Importer les données générées sur la plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la plate-forme de méthylation de l’ADN dans l’environnement logiciel R (R v.2.15.1) et les traiter à l’aide d’un outil d’analyse des tableaux de méthylation16,17. REMARQUE : Sur la carte thermique, qui est générée à l’aide d’un outil d’analyse de données, les colonnes sont commandées par clustering non supervisé, tandis que l’ordre des lignes est basé sur l’importance décroissante de la statistique t pour la méthylation différentielle de haut en bas.</li>
	<li>Divisez la carte thermique en groupes de méthylation élevés et bas à l’aide du premier différenciateur dans le clustering non supervisé. REMARQUE : Pour validation avec pcr quantitatif spécifique à la méthylation (qMSP), choisissez des gènes basés sur une plus grande valeur de β par rapport aux îles CpG dans la région promoteur, et en raison de leur aptitude pour la conception de l’amorce et de la sonde pour qMSP.</li>
</ol>5. PCR quantitatif spécifique à la méthylation (QMSP)
<ol><li>Utilisez l’ADN modifié par bisulfite à partir de l’étape 3.3 comme modèle pour pcr en temps réel basé sur la fluorescence dans qMSP pour évaluer la méthylation de la région promoteur dans chaque analyse génétique.</li>
	<li>Effectuez qMSP à l’aide d’un instrument PCR en temps réel de 96 puits (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Vérifiez l’état de méthylation promoteur du gène cible sur l’ADN modifié par bisulfite à l’aide d’amorce avant de 200 nM, d’une amorce inverse de 200 nM et de sondes de 80 nM. Préparer le master mix avec 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluorescéine, 0,166 mM de chaque triphosphate de désoxynucléotide et 0,04 U/μl de polymélase d’ADN (voir tableau des matériaux). Le volume de réaction final dans chaque puits pour tous les analyses est de 25 μL.</li>
		<li>Effectuez le cycle de qMSP comme suit : 95 °C pendant 5 minutes, suivi de 55 cycles de 95 °C pour 15 s, 60 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min. REMARQUE : Le gène cible doit être choisi en fonction des critères d’avoir de plus grandes valeurs bêta, d’être lié aux îles CpG dans la région promoteur et d’être adapté à la conception de l’amorce et de la sonde pour qMSP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser la génomique humaine traitée avec cpg méthylase (M.SssI) comme un contrôle positif de méthylation (voir tableau des matériaux). REMARQUE : La quantification finale de la méthylation est définie comme la valeur relative de méthylation (RMV), et calculée comme 2–ΔΔCt pour chaque réplique de détection de méthylation par rapport au Ct moyen pour β-Actin (ACTB)18. Les séquences d’amorce et de sonde sont affichées dans le tableau 1. Un Ct de 100 est utilisé pour les répliques non détectées, ce qui donne une valeur de 2-ΔΔCt proche de zéro. La formule suivante est utilisée : moyenne 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+unfinished+symphony.">Epigenetics: unfinished symphony.</a> Nature. 441 (7090), 143-145 (2006).</li><li>Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+colorectal+cancer:+emerging+biomarkers.">Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers.</a> Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).</li><li>Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il y a trois étapes critiques pour obtenir des résultats précis de l’analyse du génome de la méthylation de l’ADN. Le premier est la macrodissection d’une zone tumorale par de préférence deux pathologistes qualifiés basés sur des sections tachées représentatives de H&E. Une macrodissection inexacte peut causer une contamination par des tissus non cancéreux adjacents, ce qui engendre des résultats peu fiables; ainsi, la macrodissection soigneuse est exigée. Le second est l’évaluation de la qualité de l’ADN (contrôle de la qualité: QC). Les échantillons qui échouent le QC (∆Cq > 5.0) peuvent donner des données de mauvaise qualité. Par conséquent, les échantillons ∆Cq > 5.0 doivent être enlevés et d’autres utilisés. La troisième étape est le calcul de la valeur β, qui est déterminée par un outil d’analyse de données pour le logiciel de plate-forme de tableau comme le signal méthylé / le signal total (méthylé + nonméthylated)17. La β varie de 0 à 1 (ou 0 %-100 %), ce qui est simple à interpréterbiologiquement 17. Le principal problème avec cette valeur est ses mauvaises propriétés statistiques, puisque son hétéroscasticité élevée implique que la variance entre les échantillons à des extrémités de gamme de méthylation (β = 0 ou β = 1) est fortement réduite17. En outre, en raison de la mauvaise qualité de l’échantillon, les valeurs β peuvent ne pas montrer de pics biphasiques reproductibles22,et les échantillons sans ces pics devraient être exclus de l’étude plus approfondie. En outre, le gène cible devrait être choisi en fonction des critères d’avoir de plus grandes valeurs bêta, étant lié aux îles CpG dans la région promoteur, et étant adapté à la conception de l’amorce et de la sonde pour qMSP.
L’évaluation de la méthylation de l’ADN chez un locus CpG dans le génome humain est effectuée à l’aide d’une technologie basée sur le microrésaire avec un nombre fixe de sondes pour examiner des loci génomiques spécifiques. C’est la méthode la plus largement utilisée dans les études d’association à l’échelle de l’épigénome (EWAS) en raison de son faible coût, de sa petite quantité d’ADN requise et du temps de traitement nettement plus court de l’échantillon, ce qui permet le traitement à haut débit de nombreux échantillonscliniques 23. Cependant, une plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN à un locus cpg individuel est limitée par le nombre et la spécificité des sondes pour les loci épigénétiquement modifiés, ce qui empêche l’exploration de certaines régions génomiques. WGBS est généralement considéré comme la méthode de l’étalon-or en raison de son spectre plus large de couverturegénomique 10,11. Toutefois, cette méthode a un coût substantiel et un temps de traitement relativement long pour l’analyse d’un grandnombre d’échantillons 10,11. Ainsi, ce n’est pas toujours faisable. En comparaison, la plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN à un locus cpg individuel dans le génome humain est raisonnable pour une utilisation en termes de coût et de couverture génomique. Récemment, les dernières puces de perles améliorées se sont prêtes à utiliser24. Ces analyses peuvent nous aider à analyser des sites cpg mesurés presque doublés, ce qui peut donner lieu à une étude d’association idéale à l’échelle du génome (GWAS) pour les grandes populations d’échantillons.
En résumé, l’analyse du génome de la méthylation de l’ADN avec la plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN à un locus cpg individuel dans le génome humain peut fournir des informations importantes sur les biomarqueurs épigénétiques dans le cancer gastro-intestinal. Par rapport au WGBS, cette méthode est rentable et réduit le temps de traitement des échantillons. Par conséquent, cette méthode pour la détection de la méthylation de l’ADN à un locus CpG est susceptible d’être largement utilisée dans la recherche épigénétique biomarqueur.

L’épigénétique se réfère à des changements héréditaires dans la fonction génétique sans altération de la séquence del’ADN 1. De tels changements peuvent être dus à la méthylation de l’ADN, dans laquelle les groupes méthyliques sur une base d’ADN peuvent modifier l’expression du gène par des changements dans l’emballage de la chromatine. Le développement et la progression de cancer peuvent se produire si cet effet a comme résultat l’expression altérée des gènes suppresseurs detumeur 2. Le vieillissement et l’inflammation chronique sont à la fois les causes du cancer et les principales raisons des changements dans la méthylation del’ADN chez l’homme 3,4,5. Par conséquent, cela permet l’utilisation de la méthylation de l’ADN comme biomarqueur dans le diagnostic du cancer, et comme une cible pour le traitement et la prévention. Pour la détection précoce et le pronostic de cancer, la méthylation d’ADN sont mesurées dans la tumeur, le sang, l’urine, et les échantillons deselles 6,alors que les agents déméthylation sont maintenant utilisés pour traiter les leucémies telles que le syndrome myélodysplastique7.
L’analyse de méthylation de l’ADN à l’échelle du génome à l’aide d’une plate-forme de tableau pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN à un locus cpg individuel dans le génome humain peut être utilisée pour examiner l’état de méthylation de plus de 450 000 sites cpg dans l’ADNgénomique 8,9, ce qui permet l’exploration de l’épigénétique du cancer (voir tableau des matériaux). Les technologies de séquençage de la bisulfite du génome entier (WGBS) ont changé nos approches dans le domaine del’épigénétique 10,11. Cependant, il y a quelques inconvénients aux technologies en termes de coût substantiel et de temps de traitement pour l’analyse épigénétique d’un grand nombred’échantillons 10,11. Par conséquent, la plate-forme de tableau est plus faisable pour l’évaluation complexe de la méthylation de l’ADN dans le génome humain. La disponibilité d’approches pour les analyses de méthylation à l’échelle du génome s’est améliorée au cours des dernières années et nous permet d’élargir nos connaissances sur la façon dont la méthylation de l’ADN contribue au développement et à la progression du cancer12. Les progrès récents dans les approches de microrésiteurs-plate-forme nous fournissent la justification pour l’analyse de méthylation à l’échelle du génome pour identifier une nouvelle signature épigénétique dans les cancersgastro-intestinaux 13. Le but de ce protocole est de fournir une description détaillée de la façon dont cette méthode est utilisée pour l’identification des biomarqueurs dans les malignités gastro-intestinales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

La méthylation de l’ADN est un changement épigénétique important qui est biologiquement significatif et un centre fréquent de recherche sur le cancer. La méthylation de l’ADN à l’échelle du génome est une mesure utile pour fournir une analyse précise de l’état de méthylation des malignités gastro-intestinales (IG). Compte tenu des multiples utilisations translationnelles potentielles de l’analyse de la méthylation de l’ADN, les cliniciens praticiens et d’autres nouveaux études sur la méthylation de l’ADN doivent être en mesure de comprendre étape par étape comment ces analyses à l’échelle du génome sont effectuées. Le but de ce protocole est de fournir une description détaillée de la façon dont cette méthode est utilisée pour l’identification des biomarqueurs dans les malignités gastro-intestinales. Fait important, nous décrivons trois étapes critiques qui sont nécessaires pour obtenir des résultats précis lors de l’analyse à l’échelle du génome. Clairement et concisement écrites, ces trois méthodes font souvent défaut et ne sont pas perceptibles à ceux qui sont nouveaux dans les études épigénétiques. Nous avons utilisé 48 échantillons d’une malignité gastro-intestinale (cancer gastrique) pour mettre en évidence pratiquement comment l’analyse de méthylation de l’ADN à l’échelle du génome peut être effectuée pour les malignités gastro-intestinales.

Les caractéristiques de 48 patients atteints d’un cancer gastrique dans la cohorte de formation sont les suivantes (tableau 2) : l’âge médian des patients était de 74 ans (52 à 89 ans), et la cohorte comprenait 38 hommes (79,2 %) et 10 femmes (20,8 %). Il y avait 35 patients (72.9%) cancer gastrique primaire et chez 13 patients (27,1 %) avec le cancer gastrique résiduel (cancer gastrique primaire : première occurrence d’une malignité non métastatique dans l’estomac ; cancer gastrique de reste : cancer dans l’estomac de reste qui s’est développé plus de 5 ans après gastrectomy distal, indépendamment de la raison pour la résection originale19). Il y avait 23 patients (47.9%) métastase des ganglions lymphatiques et 25 patients (52,1 %) Sans. Premièrement, les 48 échantillons (la cohorte de formation) ont été chargés pour l’identification des valeurs aberrantes (figure 1A). Deux échantillons ont donné des pics supérieurs à deux écarts types déplacés par rapport aux autres, et ces échantillons ont été prélevés (figure 1B). Par conséquent, 46 échantillons ont été regroupés par hyperméthylation de promoteur d’ADN. La carte thermique qui en a résulte a été divisée en deux groupes en fonction de la méthylation élevée et basse( figure 2). Cette carte thermique permet la visualisation des 50 meilleures sondes à moins de 1 500 pb du site de démarrage transcriptionnel (TSS) dans l’analyse différentielle de méthylation. Les groupes élevés et bas de méthylation ont différé dans les facteurs clinicopathological liés à un phénotype malin agressif. C’est-à-dire le type de cancer (cancer gastrique primaire : PGC) (p = 0,01, le rapport de cote = 9,09 (1,67-50,00)) et la présence de métastases des ganglions lymphatiques (positif) (p = 0,03, rapport de cotes = 6,82 (1,16-40,08)) sont apparus comme des facteurs prédictifs indépendants importants lorsque les facteurs clinicopathologiques ont été utilisés comme covariates dans l’analyse multivariate (tableau 3). Enfin, nous avons identifié le gène EPB41L320,21 (séquences d’amorce et de sonde montrées dans le tableau 1)comme étant fortement associé à la codification de la cohorte d’entraînement en groupes de méthylation élevés et faibles dans l’analyse du microréseau. À l’aide de qMSP, les résultats de l’analyse du microrése pour EPB41L3 dans la cohorte d’essai (126 échantillons) ont été validés. Les caractéristiques des patients de la cohorte d’essai sont indiquées dans le tableau 4. Les RMV d’EPB41L3 dans les tissus de PGC étaient sensiblement plus élevés que ceux dans le cancer gastrique de reste (RGC) dans l’analyse univariate (p = 0.01) (figure 3A). De même, les RMVs dans les échantillons avec la métastase de ganglion lymphatique étaient sensiblement plus élevés que ceux sans métastase de ganglion lymphatique (p = 0.03) (figure 3B). De cette façon, l’analyse du génome de méthylation de l’ADN peut nous aider à identifier des gènes spécifiques pour caractériser certains statuts cliniques chez les patients atteints de malignité gastro-intestinale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> Figure 1 : Valeurs bêta dans 48 échantillons (cohorte de formation). Les 48 échantillons (cohorte de formation) ont été chargés et des valeurs aberrantes ont été examinées( A). Deux échantillons avaient des pics qui étaient aberrants, et ceux-ci ont été enlevés (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> Figure 2 : La carte thermique qui en résulte. Les 46 échantillons restants ont été groupés par hyperméthylation de promoteur d’ADN. La carte thermique a été divisée en groupes de méthylation élevés et bas. Cette carte thermique permet la visualisation des 50 meilleures sondes à moins de 1 500 pb du site de démarrage transcriptionnel (TSS) dans l’analyse différentielle de méthylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> Figure 3 : Valeurs relatives de méthylation (RMVs) pour EPB41L3 dans le cancer gastrique primaire (PGC) contre le cancer gastrique résiduel (RGC), et dans les cas avec et sans métastase de ganglion lymphatique. Les résultats de l’analyse de microrésais pour EPB41L3 dans la cohorte d’essai (126 échantillons) ont été validés à l’aide de qMSP. (A) Dans l’analyse univariate, RMVs d’EPB41L3 dans les tissus de PGC étaient sensiblement plus élevés que ceux dans RGC (p = 0.01). (B) De même, rmvs dans les échantillons avec la métastase de ganglion lymphatique étaient sensiblement plus élevés que dans ceux sans métastase de ganglion lymphatique (p = 0.03). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gène</td>
			<td>Attaquant 5' - 3'</td>
			<td>Revers 5' - 3'</td>
			<td>Sonde</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-ACTIN</td>
			<td>TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT</td>
			<td>AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC</td>
			<td>\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG CCG</td>
			<td>ATA AAA ATC GCC ACG AAC GA</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Séquences d’amorce et de sonde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Facteurs clinicopathologiques</td>
			<td>Variables</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Âge</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sexe</td>
			<td>Homme / Femme</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Métastase des ganglions lymphatiques</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Cancer gastrique primaire, RGC: Cancer gastrique résiduel</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Médiane (minimum maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Les caractéristiques de 48 patients atteints d’un cancer gastrique dans la cohorte de formation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Valeur P</td>
			<td>Rapport de cotes</td>
			<td>Intervalle de confiance de 95 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type (PGC)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Métastase des ganglions lymphatiques (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC: Cancer gastrique primaire</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Facteurs prédictifs pour le groupe de méthylation élevé (groupe B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Facteurs clinicopathologiques</td>
			<td>Variables</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Âge</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sexe</td>
			<td>Homme / Femme</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Métastase des ganglions lymphatiques</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Cancer gastrique primaire, RGC: Cancer gastrique résiduel</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Médiane (minimum maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Les caractéristiques de 126 patients atteints d’un cancer gastrique dans la cohorte d’essai.

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Ici, nous décrivons une procédure pour l’analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans les cancers gastro-intestinaux. La procédure est pertinente pour les études qui étudient les relations entre les modèles de méthylation des gènes et les facteurs contribuant à la carcinogenèse dans les cancers gastro-intestinaux.

Analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans le cancer gastro-intestinal

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Ainsi, l’analyse du génome de méthylation de l’ADN avec la plate-forme de Los Angeles pour l’aberration complexe de la méthylation de l’ADN dans le génome humain peut fournir des informations importantes sur les biomarqueurs épigénétiques dans le cancer gastro-intestinal. Bien que cette plate-forme de Los Angeles pour l’aberration complexe de la méthylation de l’ADN dans le génome humain, il est optimal en termes de coût et de couverture génomique. Hirotaka Momose, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera donc la procédure.Pour commencer, préparez 10 micromètres de sections intégrées à la paraffine non tachée de formaline fixe. Placez les glissières dans un support de glissière en verre et remplissez-les de solution saline, en vous assurant que tous les tissus de la glissière sont submergés. Laissez les glissières en xylène pendant 15 minutes, puis versez le xylène tout en tenant les glissières avec une pointe de pipette afin qu’elles ne tombent pas.Verser plus de xylène au même niveau qu’avant et répéter l’incubation. Versez le xylène et remplissez le support de la glissière avec 100% d’éthanol, en s’assurant que tout le tissu sur la lame est complètement submergé. Laissez les diapositives dans l’éthanol pendant trois minutes, puis remplacez l’éthanol par de l’éthanol frais et laissez-les incuber pendant deux minutes de plus.Verser l’éthanol et retirer les glissières. Placez-les délicatement face contre terre sur une serviette en papier propre et laissez-les sécher pendant 10 minutes. Remplissez un tube de polypropylène à usage unique de 1,5 millilitre avec 80 microlitres de tampon de lyse et mettez une pointe de pipette propre dans le tampon.Identifiez les tissus cancéreux de la zone tumorale les plus appropriés pour la macrodissection selon la section tachée appropriée de H&E, puis macrodissect le tissu de cancer basé sur la section marquée. Prenez une lame de rasoir propre et grattez doucement le tissu cancéreux de la lame en essayant de le garder en un seul morceau. Utilisez la pointe pipette pour transférer le tissu gratté dans le flacon tampon de lyse.Répétez ce processus avec le reste des diapositives. Après tout le tissu est dans le tube, utilisez la pointe pour s’assurer que le tissu a été complètement submergé et n’est pas collé à la paroi. Ajouter 20 microlitres d’une protéase de sérine liée à la subtilisine au flacon et feuilleter doucement pour mélanger.Placez le flacon dans un bloc thermique de 55 degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit, en vous assurant de vortex légèrement après deux heures. Effectuer le traitement à la bisulfite sur 45 microlitres du tissu digéré à l’aide d’un kit de conversion de bisulfite selon les instructions du fabricant. Ajouter cinq microlitres de tampon de dilution à l’échantillon et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Pendant ce temps, préparer le réapprovisionnement de conversion de bisulfite en ajoutant 750 microlitres d’eau distillée et 210 microlitres de tampon de dilution à un tube de réapprovisionnement de conversion CT. Mélanger les tubes en vortexant pendant 10 minutes, puis ajouter 100 microlitres du réaccageur de conversion CT préparé à chaque échantillon et mélanger par inversion. Incuber les échantillons dans l’obscurité à 50 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures.Après l’incubation, placer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Ajouter 400 microlitres de tampon de liaison et mélanger chaque échantillon en pipetting de haut en bas. Chargez chaque échantillon dans une colonne de spin et placez la colonne dans un tube de collecte de deux millilitres.Centrifuger les échantillons à pleine vitesse pendant une minute et jeter le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de tampon de lavage à chaque colonne et tourner à pleine vitesse pendant une minute, puis jeter le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de tampon de desulphonation à chaque colonne et permettre aux colonnes de se tenir à température ambiante pendant 15 minutes.Après l’incubation, faire tourner les colonnes à pleine vitesse pendant une minute et jeter le flux à travers. Lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de centrifugeuse tampon de lavage pendant une minute à pleine vitesse après chaque lavage. Ajouter 46 microlitres d’eau distillée à chaque colonne et la placer dans un nouveau tube stérile de polypropylène à usage unique de 1,5 millilitre.Faites tourner les tubes pendant deux minutes pour élucider l’ADN et jeter la colonne. L’ADN est maintenant prêt pour l’analyse. Utilisez l’ADN modifié bisulfite comme modèle pour pcr quantitatif spécifique à la méthylation pour évaluer la méthylation de la région promoteur dans chaque analyse génétique.Combinez les reagents tels que décrits dans le manuscrit du texte et utilisez un instrument PCR en temps réel de 96 puits pour exécuter le protocole thermocyclique. Les caractéristiques de 48 patients atteints d’un cancer gastrique dans la cohorte de formation sont montrées ici. L’âge médian des patients était de 74 ans et la cohorte comprenait 38 hommes et 10 femmes.Premièrement, les 48 échantillons ont été chargés pour identification des valeurs aberrantes. Deux échantillons ont donné des pics supérieurs à deux écarts types déplacés par rapport aux autres et ces échantillons ont été prélevés. La carte thermique qui en a résulte a été divisée en deux groupes basés sur une méthylation élevée et faible.Cette carte thermique permet la visualisation des 50 meilleures sondes dans les 1500 paires de base du site de démarrage transcriptionnel dans l’analyse différentielle de méthylation. Le type de cancer et la présence de métastase des ganglions lymphatiques sont apparus comme des facteurs prédictifs indépendants significatifs lorsque les facteurs pathologiques cliniques ont été utilisés comme covariates dans l’analyse multivariate. Enfin, le gène EPB41L3 s’est révélé fortement associé à la codification de la cohorte de formation en groupes de méthylation élevés et faibles dans l’analyse du microrése.Les résultats de l’analyse de microréseau pour EPB41L3 dans la cohorte d’essai ont été validés avec pcr méthylation-spécifique quantitatif. RmVs d’EPB41L3 dans les tissus de PGC étaient sensiblement plus élevés que ceux dans le cancer gastrique de reste dans l’analyse univariate. De même, les RMVs dans les échantillons avec la métastase de ganglion lymphatique étaient sensiblement plus élevés que ceux sans métastase de ganglion lymphatique.Ainsi, l’identification sur le tissu cancéreux le plus approprié pour la macrodissection selon la section appropriée h & E tachée est nécessaire pour effectuer avec succès ce protocole.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-gratuit Analyse d&#39;intégrité de l&#39;ADN dans des échantillons d&#39;urine

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal sporadique

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