Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer at JoVE.com

Wir sind allen Mitgliedern des Department of Surgery, dem Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center an der Johns Hopkins University School of Medicine, für nützliche Diskussionen und technische Unterstützung besonders dankbar. Wir danken auch Kristen Rodgers für die großzügige technische Anleitung zu den Verfahren für die Bisulfitbehandlung und qMSP.

Alle verfahren entsprachen den ethischen Standards der Ethikkommission für Humanforschung der Institutionen. Die Studie wurde vom Institutional Review Board am Juntendo University Shizuoka Hospital genehmigt, und die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage wurde aufgrund des retrospektiven Entwurfs aufgehoben.
1. Waschen der Rutschen
<ol><li>Bereiten Sie 10 m ungefärbte formalinfixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Abschnitte vor.</li>
	<li>Gleitfolien in einen Glasschiebehalter legen: Verwenden Sie etwa 3–5 größte Querschnittsfolien, es sei denn, das Gewebe ist minimal, und es werden weitere Folien benötigt.</li>
	<li>Füllen Sie den Diahalter mit Xylol, und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe auf der Folie untergetaucht ist. 15 min sitzen lassen.</li>
	<li>Nach 15 min das Xylol mit den mit einer Pipettenspitze gehaltenen Dias ausgießen, damit die Dias nicht herausfallen.</li>
	<li>Gießen Sie mehr Xylol auf das gleiche Niveau wie zuvor. Lassen Sie für weitere 15 min sitzen.</li>
	<li>Nach 15 min das Xylol wieder ausgießen.</li>
	<li>Füllen Sie den Schiebehalter mit 100% Ethanol (EtOH), und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe auf dem Dia vollständig untergetaucht ist. 3 min sitzen lassen.</li>
	<li>Gießen Sie den EtOH ab, während Sie die Dias vorsichtig halten. Nachfüllen auf dem gleichen Niveau mit mehr EtOH. 2 min sitzen lassen.</li>
	<li>Gießen Sie den EtOH erneut ab und entfernen Sie die Folie. Legen Sie sie vorsichtig nach oben auf ein sauberes Papiertuch zum Trocknen. 10 min sitzen lassen.</li>
</ol>2. Abkratzen der Dias
<ol><li>Bereiten Sie Verdauungs-/Lysepuffer mit 650 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser, 100 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 ml Trishydrochlorid (Tris-HCL) 2 Mio. pH 8,8 und 200 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) vor (siehe Tabelle).</li>
	<li>Füllen Sie ein 1,5 ml Einweg-Polypropylenrohr mit 80 l Verdauungs-/Lysepuffer (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie eine saubere Pipettenspitze in den Puffer.</li>
	<li>Identifizieren Sie Krebsgewebe des Tumorbereichs, der am besten für die Makrodissektion geeignet ist, entsprechend dem entsprechenden H&E-Gefärbtenabschnitt. HINWEIS: Der Tumorbereich für Makrodissektion sollte vorzugsweise von zwei qualifizierten Pathologen identifiziert werden.</li>
	<li>Makrodissekte-Krebsgewebe basierend auf dem markierten H&E-Gefärbtenabschnitt.<ol>
<li>Nehmen Sie eine saubere Rasierklinge und kratzen Sie das Krebsgewebe vorsichtig von der Rutsche, versuchen, es in einem Stück zu halten, so dass es einfacher ist, mit zu arbeiten.</li>
		<li>Nehmen Sie die Pipettenspitze aus einem Einweg-Polypropylenrohr mit Puffer und übertragen Sie es, um das verschrottete Gewebe in die Pufferdurchstechflasche zu übertragen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die nasse Spitze sollte das Gewebe anziehen, was den Transfer erleichtert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5 mit den restlichen Folien.</li>
	<li>Nachdem das Gewebe in einem Einweg-Polypropylenrohr ist, verwenden Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und nicht an der Wand des Rohres klebt.</li>
	<li>Fügen Sie 20 L einer subtilisinen Serin-Protease in die Durchstechflasche und streichen Sie sanft zum Mischen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die Durchstechflasche mindestens 4 h oder über Nacht in einen 55 °C-Wärmeblock geben. Achten Sie darauf, nach 2 h leicht wirbeln.</li>
</ol>3. Bisulfitbehandlung
<ol><li>Als Probe werden 45 l der verdauten Gewebelösung verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Bisulfitbehandlung mit Reagenzien in einem Bisulfit-Umwandlungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Fügen Sie der DNA-Probe 5 l Verdünnungspuffer hinzu und inkubieren Sie 15 min bei 37 °C (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Während der Inkubation der Proben bereiten Sie das Bisulfit-Umwandlungsreagenz vor, indem Sie 750 l dH2O und 210 l Verdünnungspuffer zu einem Röhrchen CT-Umwandlungsreagenz hinzufügen (siehe Materialtabelle). Mischen Sie die Rohre durch Wirbeln für 10 min.</li>
		<li>Nach der 15 min Inkubation 100 l des vorbereiteten CT-Umwandlungsreagenzes zu jeder Probe hinzufügen und durch Inversion mischen.</li>
		<li>Die Proben im Dunkeln bei 50 °C für 12 bis 16 h inkubieren.</li>
		<li>Nach der Inkubation die Proben entfernen und 10 min auf Eis legen.</li>
		<li>Fügen Sie 400 L Bindungspuffer hinzu und mischen Sie jede Probe, indem Sie nach oben und unten pipetieren (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie jede Probe in eine Spinspalte und platzieren Sie die Spalte in ein 2 ml Sammelrohr (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie jede Probe mit voller Geschwindigkeit (10.000 x g) für 1 min und entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Spalte 200 L Waschpuffer hinzu und drehen Sie mit voller Geschwindigkeit 1 min, wobei der Durchfluss verworfen wird (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Fügen Sie jeder Spalte 200 L Desulfonationspuffer hinzu und lassen Sie die Säule 15 min bei Raumtemperatur stehen (siehe Materialtabelle). Nach der Inkubation drehen Sie die Spalten mit voller Geschwindigkeit für 1 min und entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Spalte 200 L Waschpuffer hinzu und drehen Sie mit voller Geschwindigkeit 1 min (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Säule 46 l dH2O hinzu und legen Sie jede Säule in ein neues steriles 1,5 ml-Einweg-Polypropylenrohr (siehe Materialtabelle). Drehen Sie jede Röhre für 2 min, um die DNA zu elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie jede Spin-Säule aus dem Einweg-Polypropylenrohr und entsorgen Sie sie (siehe Materialtabelle). Die DNA ist nun für die Analyse bereit.</li>
</ol>4. Array-Plattform zur Auswertung der DNA-Methylierung an einem CpG-Lokus im menschlichen Genom
<ol><li>Bewerten Sie die Qualität der DNA (Qualitätsprüfung: QC) mit FFPE QC-Assay auf einem Echtzeit-PCR-Amplifikations- und Detektionsgerät, wobei die anschließende Datenanalyse gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt wird (siehe Tabelle der Materialien). HINWEIS: Proben mit ∆Cq-Werten kleiner als die empfohlene 5.0 werden weiterverarbeitet14.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben mit einer Array-Plattform für die komplexe Auswertung der DNA-Methylierung, um den Methylierungsstatus von >450.000 CpG-Standorten im Genom zu bewerten (siehe Tabelle der Materialien). Produktinformationsblatt, Datenblatt und Produktdateien für die Array-Plattform sind verfügbar15. HINWEIS: Der Test wird gemäß den Anweisungen des Herstellers für FFPE-Material14durchgeführt.</li>
	<li>Berechnen Sie die hohe und niedrige Lokusmethylierung in einem Datenanalysetool für eine Arrayplattform als β-Wert mit einem Bereich von 0 bis 1 (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie handelsübliche Software (siehe Materialtabelle), um einen β-Wert zu berechnen.</li>
	<li>Importieren Sie auf der Array-Plattform generierte Daten zur komplexen Auswertung der DNA-Methylierungsplattform in die R-Softwareumgebung (R v.2.15.1) und verarbeiten Sie diese mit einem Tool zur Analyse von Methylierungsarrays16,17. ANMERKUNG: Auf der Heatmap, die mit einem Datenanalysetool generiert wird, werden Spalten nach unbeaufsichtigtem Clustern sortiert, während die Reihenfolge der Zeilen auf der abnehmenden Bedeutung der t-Statistik für die Differentialmethylierung von oben nach unten basiert.</li>
	<li>Teilen Sie die Heatmap mithilfe des ersten Unterscheidungsmittels im unbeaufsichtigten Clustering in hohe und niedrige Methylierungsgruppen auf. ANMERKUNG: Für die Validierung mit quantitativer methylierungsspezifischer PCR (qMSP) wählen Sie Gene, die auf einem größeren β-Wert in Bezug auf CpG-Inseln in der Förderregion basieren, und aufgrund ihrer Eignung für Primer- und Sondendesign für qMSP.</li>
</ol>5. Quantitative Methylierungsspezifische PCR (qMSP)
<ol><li>Verwenden Sie die bisulfitmodifizierte DNA aus Schritt 3.3 als Vorlage für fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR in qMSP, um die Methylierung der Promotorregion in jeder Genanalyse zu bewerten.</li>
	<li>Führen Sie qMSP mit einem 96-Well-Echtzeit-PCR-Instrument (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Prüfen Sie den Promotormethylierungsstatus des Zielgens auf der Bisulfit-modifizierten DNA mit 200 nM Vorwärtsprimer, 200 nM Reverse Primer und 80 nM Sonden. Bereiten Sie den Master-Mix mit 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 nM Fluorescein, 0,166 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats und 0,04 U/l DNA-Polymerase vor (siehe Tabelle der Materialien). Das endige Reaktionsvolumen in jedem Bohrwert für alle Assays beträgt 25 l.</li>
		<li>Führen Sie den Zyklus von qMSP wie folgt durch: 95 °C für 5 Min. gefolgt von 55 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 72 °C für 1 min. HINWEIS: Das Zielgen sollte auf der Grundlage der Kriterien ausgewählt werden, die mit größeren Beta-Werten zusammenhängen, mit CpG-Inseln in der Projektträgerregion in Verbindung stehen und für das Primer- und Sondendesign für qMSP geeignet sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie humangenombehandelt mit CpG-Methylase (M.SssI) als positive Methylierungskontrolle (siehe Tabelle der Materialien). ANMERKUNG: Die endgültige Quantifizierung der Methylierung wird als relativer Methylierungswert (RMV) definiert und für jede Methylierungsdetektionsreplikation mit 2–Ct berechnet, verglichen mit dem Mittelwert Ct für β-Actin (ACTB)18. Primer- und Sondensequenzen sind in Tabelle 1dargestellt. Für unentdeckte Replikationen wird eine Ct von 100 verwendet, was einen Wert von 2– Ct nahe Null ergibt. Es wird die folgende Formel verwendet: Mittelwert 2– Ct (RMV) = (2– - Ct_replicate_1 + 2 –Ct_replicate_2 + 2– Ct_replicate_3)/318.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+unfinished+symphony.">Epigenetics: unfinished symphony.</a> Nature. 441 (7090), 143-145 (2006).</li><li>Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+colorectal+cancer:+emerging+biomarkers.">Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers.</a> Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).</li><li>Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Es gibt drei kritische Schritte, um genaue Ergebnisse aus der DNA-Methylierungs-Genom-weiten Analyse zu erhalten. Die erste ist die Makrodissektion eines Tumorbereichs durch vorzugsweise zwei qualifizierte Pathologen, die auf repräsentativen H&E-Gefärbten abschnittsbasierten Abschnitten basieren. Ungenaue Makrodissektion kann zu einer Kontamination mit angrenzenden nicht-kanzerösen Geweben führen, was zu unzuverlässigen Ergebnissen führt; daher ist eine sorgfältige Makrodissektion erforderlich. Die zweite ist die Bewertung der DNA-Qualität (Qualitätsprüfung: QC). Stichproben, die das QC (∆Cq > 5.0) nicht enthalten, können Daten schlechter Qualität ergeben. Daher sollten Proben mit ∆Cq > 5.0 entfernt und andere verwendet werden. Der dritte Schritt ist die Berechnung des β-Wertes, der durch ein Datenanalysetool für die Arrayplattform-Software als methyliertes Signal / das Gesamtsignal (methyliert + unmethyliert)17bestimmt wird. Der β-Wert reicht von 0–1 (oder 0%–100%), was biologisch einfach zu interpretieren ist17. Das Hauptproblem bei diesem Wert sind seine schlechten statistischen Eigenschaften, da seine hohe Heteroskedastizität impliziert, dass die Varianz zwischen Proben bei Methylierungsbereichen extreme (β = 0 oder β = 1) stark reduziert ist17. Darüber hinaus weisen β-Werte aufgrund schlechter Probenqualität möglicherweise keine reproduzierbaren biphasischen Spitzen22auf, und Proben ohne solche Spitzen sollten von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen werden. Darüber hinaus sollte das Zielgen auf der Grundlage der Kriterien ausgewählt werden, die mit größeren Beta-Werten zusammenhängen, mit CpG-Inseln in der Projektträgerregion in Verbindung stehen und für das Primer- und Sondendesign für qMSP geeignet sind.
Die Auswertung der DNA-Methylierung an einem CpG-Lokus im menschlichen Genom wird mit Mikroarray-basierter Technologie mit einer festen Anzahl von Sonden durchgeführt, um spezifische genomische Loci zu untersuchen. Es ist die am weitesten verbreitete Methode in Epigenom-weiten Assoziationsstudien (EWAS) aufgrund seiner niedrigen Kosten, geringe Menge an DNA erforderlich, und deutlich kürzere Probenverarbeitungszeit, die hohe Durchsatzverarbeitung von vielen klinischen Probenermöglicht 23. Eine Array-Plattform für die komplexe Auswertung der DNA-Methylierung an einem einzelnen CpG-Lokus wird jedoch durch die Anzahl und Spezifität von Sonden für epigenetisch veränderte Loci begrenzt, was die Erforschung einiger genomischer Regionen verhindert. WGBS wird aufgrund seines breiteren Spektrums an genomischer Abdeckung im Allgemeinen als Goldstandard-Methode angesehen10,11. Diese Methode hat jedoch erhebliche Kosten und eine relativ lange Verarbeitungszeit für die Analyse einer großen Anzahl von Proben10,11. Es ist also nicht immer machbar. Im Vergleich dazu ist die Array-Plattform zur komplexen Auswertung der DNA-Methylierung an einem einzelnen CpG-Lokus im menschlichen Genom kosten- und genomisch fundiert. Kürzlich haben die neuesten aktualisierten Perlenchips bereit gemacht,24zu verwenden. Diese Assays können uns helfen, fast verdoppelte gemessene CpG-Standorte zu analysieren, die eine ideale genomweite Assoziationsstudie (GWAS) für große Probenpopulationen erreichen können.
Zusammenfassend kann die DNA-Methylierungs-Genom-weite Analyse mit der Array-Plattform zur komplexen Auswertung der DNA-Methylierung an einem einzelnen CpG-Lokus im menschlichen Genom wichtige Informationen über epigenetische Biomarker bei Magen-Darm-Krebs liefern. Im Vergleich zu WGBS ist diese Methode kostengünstig und verkürzt die Probenverarbeitungszeit. Daher ist diese Methode zum Nachweis der DNA-Methylierung an einem CpG-Lokus wahrscheinlich in der epigenetischen Biomarkerforschung weit verbreitet.

Epigenetik bezieht sich auf vererbbare Veränderungen der Genfunktion ohne Veränderung der Sequenz von DNA1. Solche Veränderungen können auf die DNA-Methylierung zurückzuführen sein, bei der Methylgruppen auf einer DNA-Basis die Genexpression durch Veränderungen in der Chromatinverpackung verändern können. Krebsentwicklung und -progression können auftreten, wenn dieser Effekt zu einer veränderten Expression der Tumorsuppressorgeneführt 2. Alterung und chronische Entzündung sind sowohl Ursachen von Krebs als auch die Hauptgründe für Veränderungen der DNA-Methylierung beim Menschen3,4,5. Dies ermöglicht somit die Verwendung der DNA-Methylierung als Biomarker in der Krebsdiagnose und als Ziel für Behandlung und Prävention. Zur Früherkennung und Krebsprognose wird die DNA-Methylierung in Tumor-, Blut-, Urin- und Stuhlproben6gemessen, während demethylierungsmittel nun zur Behandlung von Leukämien wie dem myelodysplastischen Syndrom7eingesetzt werden.
Die genomweite DNA-Methylierungsanalyse mit Hilfe einer Array-Plattform zur komplexen Auswertung der DNA-Methylierung an einem einzelnen CpG-Lokus im menschlichen Genom kann genutzt werden, um den Methylierungsstatus von mehr als 450.000 CpG-Standorten in der genomischen DNA8,9zu untersuchen, was die Erforschung der Krebs-Epigenetik ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien). Ganze Genombisulfit-Sequenzierung (WGBS) Technologien haben unsere Ansätze auf dem Gebiet der Epigenetikverändert 10,11. Es gibt jedoch einige Nachteile für die Technologien in Bezug auf erhebliche Kosten und Verarbeitungszeit für die epigenetische Analyse einer großen Anzahl von Proben10,11. Daher ist die Array-Plattform für eine komplexe Auswertung der DNA-Methylierung im menschlichen Genom machbarer. Die Verfügbarkeit von Ansätzen für genomweite Methylierungsanalysen hat sich in den letzten Jahren verbessert und ermöglicht es uns, unser Wissen darüber zu erweitern, wie DNA-Methylierung zur Krebsentwicklung und Progression beiträgt12. Jüngste Fortschritte in Mikroarray-Plattform-Ansätzen liefern uns die Begründung für eine genomweite Methylierungsanalyse, um eine neuartige epigenetische Signatur bei Magen-Darm-Krebs zu identifizieren13. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte Beschreibung zu liefern, wie diese Methode zur Biomarker-Identifikation bei GI-Malignomen verwendet wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

Die DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Veränderung, die biologisch sinnvoll ist und ein häufiger Schwerpunkt der Krebsforschung ist. Die genomweite DNA-Methylierung ist eine nützliche Maßnahme, um eine genaue Analyse des Methylierungsstatus von gastrointestinalen (GI) Malignitäten zu ermöglichen. Angesichts der vielfältigen möglichen translationalen Verwendungen der DNA-Methylierungsanalyse müssen praktizierende Kliniker und andere, die für DNA-Methylierungsstudien neu sind, in der Lage sein, Schritt für Schritt zu verstehen, wie diese genomweiten Analysen durchgeführt werden. Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte Beschreibung der Verwendung dieser Methode für die Biomarker-Identifikation bei GI-Malignomen zu liefern. Wichtig ist, dass wir drei kritische Schritte beschreiben, die erforderlich sind, um während der genomweiten Analyse genaue Ergebnisse zu erhalten. Klar und prägnant geschrieben, fehlen diese drei Methoden oft und sind für diejenigen, die in epigenetischen Studien neu sind, nicht spürbar. Wir verwendeten 48 Proben einer GI-Malignität (Magenkrebs), um praktisch hervorzuheben, wie genomweite DNA-Methylierungsanalysen bei GI-Malignomen durchgeführt werden können.

Die Merkmale von 48 Patienten mit Magenkrebs in der Trainingskohorte sind wie folgt(Tabelle 2): Das Mittlere Alter der Patienten betrug 74 Jahre (52–89 Jahre), und die Kohorte umfasste 38 Männer (79,2%) und 10 Frauen (20,8%). Es gab 35 Patienten (72,9%) bei primärem Magenkrebs und bei 13 Patienten (27,1%) mit Restmagenkrebs (Primärmagenkrebs: erstes Auftreten einer nicht-metastasierenden Malignität im Magen; Restmagenkrebs: Krebs im Restmagen, der sich mehr als 5 Jahre nach distaler Gastrektomie entwickelt hat, unabhängig vom Grund für die ursprüngliche Resektion19). Es gab 23 Patienten (47,9%) mit Lymphknotenmetastasierung und 25 Patienten (52,1%) Ohne. Zunächst wurden alle 48 Proben (die Ausbildungskohorte) zur Identifizierung von Ausreißern geladen (Abbildung 1A). Zwei Stichproben ergaben Spitzenwerte, die größer als zwei Standardabweichungen waren, die von den anderen verschoben wurden, und diese Proben wurden entfernt (Abbildung 1B). Daher wurden 46 Proben durch DNA-Promotor-Hypermethylierung gruppiert. Die resultierende Heatmap wurde auf der Grundlage hoher und niedriger Methylierung in zwei Gruppen unterteilt (Abbildung 2). Diese Heatmap ermöglicht die Visualisierung der Top 50 Sonden innerhalb von 1.500 bp der Transkriptionsstartstelle (TSS) in der Differentialmethylierungsanalyse. Die hohen und niedrigen Methylierungsgruppen unterschieden sich in klinikopathologischen Faktoren im Zusammenhang mit einem aggressiven bösartigen Phänotyp. Das heißt, die Krebsart (Primärmagenkrebs: PGC) (p = 0,01, Odds Ratio = 9,09 (1,67–50,00)) und Das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasierung (positiv) (p = 0,03, Odds Ratio = 6,82 (1,16–40,08)) traten als signifikante unabhängige Vorhersagefaktoren auf, als die klinischpathologischen Faktoren als Kovariate in der multivariaten Analyse verwendet wurden (Tabelle 3). Schließlich haben wir festgestellt, dass das EPB41L3-Gen20,21 (Primer- und Sondensequenzen in Tabelle 1) stark mit der Kodifizierung der Trainingskohorte in hoch- und niedrigmethylierungsgruppen in der Mikroarray-Analyse in Verbindung gebracht werden kann. Mit qMSP wurden die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse für EPB41L3 in der Testkohorte (126 Proben) validiert. Die Merkmale der Patienten in der Testkohorte sind in Tabelle 4dargestellt. RMVs von EPB41L3 in PGC-Geweben waren in der univariaten Analyse signifikant höher als bei Residan-Magenkrebs (RGC) (p = 0,01) (Abbildung 3A). In ähnlicher Weise waren RMVs in Proben mit Lymphknotenmetastasen signifikant höher als rmVs ohne Lymphknotenmetastasierung (p = 0,03) (Abbildung 3B). Auf diese Weise kann uns die GENOMweite Analyse der DNA-Methylierung dabei helfen, bestimmte Gene zu identifizieren, um bestimmten klinischen Status bei Patienten mit GI-Malignomen zu charakterisieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> Abbildung 1: Betawerte in 48 Proben (Trainingskohorte). Alle 48 Proben (Ausbildungskohorte) wurden geladen und Ausreißer untersucht (A). Zwei Proben hatten Spitzen, die Ausreißer waren, und diese wurden entfernt (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> Abbildung 2: Die resultierende Heatmap. Die restlichen 46 Proben wurden durch DNA-Promotor-Hypermethylierung gruppiert. Die Heatmap wurde in hohe und niedrige Methylierungsgruppen unterteilt. Diese Heatmap ermöglicht die Visualisierung der Top 50 Sonden innerhalb von 1.500 bp der Transkriptionsstartstelle (TSS) in der Differentialmethylierungsanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> Abbildung 3: Relative Methylierungswerte (RMVs) für EPB41L3 bei primärem Magenkrebs (PGC) vs. Restmagenkrebs (RGC) und in Fällen mit und ohne Lymphknotenmetastasierung. Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse für EPB41L3 in der Testkohorte (126 Proben) wurden mit qMSP validiert. (A) Bei der univariaten Analyse waren die RMVs von EPB41L3 in PGC-Geweben signifikant höher als in RGC (p = 0,01). (B) Ebenso waren RMVs in Proben mit Lymphknotenmetastasen signifikant höher als bei Patienten ohne Lymphknotenmetastasierung (p = 0,03). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gen</td>
			<td>Vorwärts 5' - 3'</td>
			<td>Rückwärts 5' - 3'</td>
			<td>Sonde</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-ACTIN</td>
			<td>TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT</td>
			<td>AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC</td>
			<td>TGT GGG GTG , GTG ATG GAG GAG GTT TAG, 3IABkFQ</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG C</td>
			<td>ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Primer- und Sondensequenzen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Klinikopathologische Faktoren</td>
			<td>Variablen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alter</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geschlecht</td>
			<td>Männlich / weiblich</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Typ</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymphknotenmetastasierung</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Primärer Magenkrebs, RGC: Überbleibsel Magenkrebs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Median (Minimum-Maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Die Merkmale von 48 Patienten mit Magenkrebs in der Trainingskohorte.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>P-Wert</td>
			<td>Odds Ratio</td>
			<td>95% Konfidenzintervall</td>
		</tr>
<tr>
<td>Typ (PGC)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymphknotenmetastasierung (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC: Primärer Magenkrebs</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Vorhersagefaktoren für die hohe Methylierungsgruppe (Cluster B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Klinikopathologische Faktoren</td>
			<td>Variablen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alter</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geschlecht</td>
			<td>Männlich / weiblich</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Typ</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lymphknotenmetastasierung</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Primärer Magenkrebs, RGC: Überbleibsel Magenkrebs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Median (Minimum-Maximum)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Die Merkmale bei 126 Patienten mit Magenkrebs in der Testkohorte.

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Hierin beschreiben wir ein Verfahren zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs. Das Verfahren ist von Bedeutung für Studien, die Zusammenhänge zwischen Methylierungsmustern von Genen und Faktoren untersuchen, die zur Karzinogenese bei Magen-Darm-Krebs beitragen.

Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

So kann die DNA-Methylierungs-Genom-weite Analyse mit der LA-Plattform für komplexe Aberration der DNA-Methylierung im menschlichen Genom wichtige Informationen über epigenetische Biomarker bei Magen-Darm-Krebs liefern. Obwohl diese LA-Plattform für komplexe Aberration der DNA-Methylierung im menschlichen Genom, ist es optimal in Bezug auf Kosten und genomische Abdeckung. Das Verfahren wird hirotaka Momose demonstrieren, ein Student aus meinem Labor.Bereiten Sie zunächst 10 Mikrometer ungefärbter formalinfixierter Paraffin-Eingebettete Abschnitte vor. Legen Sie die Dias in einen Glasschieberhalter und füllen Sie sie mit Einer Linie, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe auf der Folie untergetaucht ist. Lassen Sie die Dias 15 Minuten in Xylol, dann gießen Sie das Xylol aus, während Sie die Dias mit einer Pipettenspitze halten, damit sie nicht herausfallen.Gießen Sie mehr Xylol auf das gleiche Niveau wie zuvor und wiederholen Sie die Inkubation. Gießen Sie das Xylol aus und füllen Sie den Schiebehalter mit 100% Ethanol, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe auf der Folie vollständig untergetaucht ist. Lassen Sie die Rutschen im Ethanol für drei Minuten, dann ersetzen Sie das Ethanol mit frischem Ethanol und lassen Sie sie für zwei weitere Minuten inkubieren.Gießen Sie das Ethanol ab und entfernen Sie die Dias. Legen Sie sie vorsichtig nach oben auf ein sauberes Papiertuch und lassen Sie sie für 10 Minuten trocknen. Füllen Sie ein 1,5 Milliliter-Einweg-Polypropylenrohr mit 80 Mikroliter Lysepuffer und legen Sie eine saubere Pipettenspitze in den Puffer.Identifizieren Sie Krebsgewebe des Tumorbereichs, der am besten für die Makrodissektion geeignet ist, gemäß dem entsprechenden H&E-Gefärbtenabschnitt, und sezieren Sie dann das Krebsgewebe auf der Grundlage des markierten Abschnitts. Nehmen Sie eine saubere Rasierklinge und kratzen Sie das Krebsgewebe vorsichtig von der Rutsche, um es in einem Stück zu halten. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das abgekratzte Gewebe in die Lysepufferdurchstechsons zu übertragen.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Folien. Nachdem sich das Gewebe in der Röhre befindet, verwenden Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und nicht an der Wand klebt. Fügen Sie 20 Mikroliter einer subtilisinen-bezogenen Serin-Protease in die Durchstechflasche und flicken Sie sanft zum Mischen.Legen Sie die Durchstechflasche mindestens vier Stunden oder über Nacht in einen 55 Grad Celsius-Wärmeblock und sorgen Sie dafür, dass sie nach zwei Stunden leicht wirbelt. Führen Sie die Bisulfitbehandlung auf 45 Mikroliter des verdauten Gewebes mit einem Bisulfit-Umwandlungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Fügen Sie der Probe fünf Mikroliter Verdünnungspuffer hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.In der Zwischenzeit bereiten Sie das Bisulfit-Umwandlungsreagenz vor, indem Sie 750 Mikroliter destilliertes Wasser und 210 Mikroliter Verdünnungspuffer zu einem Röhrchen CT-Umwandlungsreagenz hinzufügen. Mischen Sie die Rohre durch Wirbeln für 10 Minuten, dann fügen Sie 100 Mikroliter des vorbereiteten CT-Umwandlungreagenz zu jeder Probe und mischen Sie durch Inversion. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 50 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden.Nach der Inkubation die Proben 10 Minuten auf Eis legen. Fügen Sie 400 Mikroliter Bindungspuffer hinzu und mischen Sie jede Probe, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Laden Sie jede Probe in eine Spin-Spalte und legen Sie die Spalte in ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr.Zentrifugieren Sie die Proben mit voller Geschwindigkeit für eine Minute und entsorgen Sie den Durchfluss. Fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu jeder Säule hinzu und drehen Sie mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Fügen Sie 200 Mikroliter Desulphonationspuffer zu jeder Säule hinzu und lassen Sie die Säulen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Drehen Sie die Spalten nach der Inkubation mit voller Geschwindigkeit für eine Minute und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule zweimal mit 200 Mikroliter Waschpufferzentrifugieren für eine Minute bei voller Geschwindigkeit nach jeder Wäsche. Fügen Sie 46 Mikroliter destilliertes Wasser in jede Säule und legen Sie es in eine neue sterile 1,5 Milliliter Einweg-Polypropylen-Röhre.Drehen Sie die Rohre für zwei Minuten, um die DNA zu löschen und die Spalte zu entsorgen. Die DNA ist nun für die Analyse bereit. Verwenden Sie die bisulfitmodifizierte DNA als Vorlage für quantitative methylierungsspezifische PCR, um die Methylierung der Promotorregion in jeder Genanalyse zu bewerten.Kombinieren Sie die Reagenzien, wie im Textmanuskript beschrieben, und verwenden Sie ein 96-Well-Echtzeit-PCR-Instrument, um das Thermo-Zyklus-Protokoll auszuführen. Die Merkmale von 48 Patienten mit Magenkrebs in der Trainingskohorte werden hier gezeigt. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 74 Jahre und die Kohorte umfasste 38 Männer und 10 Frauen.Zunächst wurden alle 48 Proben zur Identifizierung von Ausreißern geladen. Zwei Proben ergaben Spitzen, die größer als zwei Standardabweichungen waren, die von den anderen verschoben wurden, und diese Proben wurden entfernt. Die resultierende Wärmekarte wurde auf der Grundlage von hoher und niedriger Methylierung in zwei Gruppen eingeteilt.Diese Heatmap ermöglicht die Visualisierung der Top 50 Sonden innerhalb von 1. 500 Basispaaren des Transkriptionsstartplatzes in der Differentialmethylierungsanalyse. Die Art des Krebses und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen traten als signifikante unabhängige Vorhersagefaktoren auf, als die klinischen pathologischen Faktoren als Kovariate in der multivariaten Analyse verwendet wurden. Schließlich wurde festgestellt, dass das EPB41L3-Gen in der Mikroarray-Analyse stark mit der Kodifizierung der Trainingskohorte in hohe und niedrige Methylierungsgruppen in Verbindung gebracht wird.Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse für EPB41L3 in der Testkohorte wurden mit quantitativer methylierungsspezifischer PCR validiert. RMVs von EPB41L3 in PGC-Geweben waren in der univariaten Analyse signifikant höher als bei Magenkrebs. In ähnlicher Weise waren RMVs in Proben mit Lymphknotenmetastasen signifikant höher als rmVs ohne Lymphknotenmetastasierung.Daher ist eine Identifizierung auf Krebsgewebe erforderlich, das am besten für die Makrodissektion nach dem entsprechenden H&E-Gefärbtenabschnitt geeignet ist, um dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Forschung

Krebsforschung

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

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Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

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