אז ניתוח גנום מתילציה DNA רחב עם פלטפורמת לוס אנג'לס עבור סטייה מורכבת של מתילציה DNA בגנום האנושי יכול לספק מידע חשוב של סמנים ביולוגיים אפיגנטיים בסרטן מערכת העיכול. למרות פלטפורמה זו לוס אנג'לס עבור סטייה מורכבת של מתילציה DNA בגנום האנושי, הוא אופטימלי במונחים של עלות כיסוי גנומי. אז הוכחת ההליך תהיה הירוטאקה ממוס, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, להכין 10 מיקרומטרים של קטעים מוטבעים פרפין קבוע פורמלין נגוע. מקם את השקופיות במחזיק שקופיות מזכוכית ומלא אותן בתמיסת מלח, ודא שכל הרקמה בשקופית שקועה. השאירו את השקופיות בקסילן למשך 15 דקות, ולאחר מכן שפכו את הקסילן תוך החזקת השקופיות עם קצה פיפטה כדי שלא ייפלו.
יוצקים עוד קסילן לאותה רמה כמו קודם וחוזרים על הדגירה. יוצקים את הקסילן וממלאים את מחזיק השקופית ב-100%אתנול, ומוודאים שכל הרקמה בשקופית שקועה לחלוטין. השאירו את השקופיות באתנול במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להחליף את האתנול עם אתנול טרי ולאפשר להם דגירה במשך שתי דקות נוספות.
יוצקים את האתנול ולהסיר את השקופיות. בזהירות מניחים אותם עם הפנים כלפי מעלה על מגבת נייר נקייה ולאפשר להם להתייבש במשך 10 דקות. מלא צינור פוליפרופילן חד-מיליליטר חד-מיליליטר ב-80 מיקרוליטר של מאגר תיזה והכנס קצה פיפטה נקי למאגר.
זהה רקמות סרטניות של אזור הגידול המתאים ביותר עבור macrodissection על פי החלק המוכתם H&E המתאים, ולאחר מכן macrodissect רקמת הסרטן מבוסס על החלק המסומן. קח סכין גילוח נקי בעדינות לגרד את רקמת הסרטן את השקופית מנסה לשמור אותו בחתיכה אחת. השתמש בקצה פיפטה כדי להעביר את הרקמה שרוט לתוך בקבוקון מאגר תיזה.
חזור על תהליך זה עם שאר השקופיות. אחרי כל הרקמה היא בצינור, להשתמש בקצה כדי לוודא את הרקמה היה שקוע לחלוטין ולא דבוק לקיר. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פרוטאז סרין הקשור לתת-טיליסין לבקבוקון והצלפו בעדינות כדי לערבב.
מניחים את הבקבוקון בבלוק חום של 55 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות או לילה לפחות, ומוודאים מערבולת קלה לאחר שעתיים. בצע את הטיפול bisulfite על 45 microliters של הרקמה מתעכל באמצעות ערכת המרה bisulfite על פי הוראות היצרן. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של חיץ דילול לדגימה ומדגרים אותה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
בינתיים, להכין את reagent המרה bisulfite על ידי הוספת 750 microliters של מים מזוקקים 210 microliters של חיץ דילול לצינור אחד של REAgent המרת CT. מערבבים את הצינורות על ידי מערבולת במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של reagent המרת CT מוכן לכל מדגם ומערבבים על ידי היפוך. דגירה הדגימות בחושך ב 50 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 16 שעות.
לאחר הדגירה, מניחים את הדגימות על קרח במשך 10 דקות. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מאגר מחייב ומערבבים כל דגימה על ידי צינור למעלה ולמטה. טען כל דגימה לתוך עמודת סיבוב והצב את העמודה בצינור איסוף של שני מיליליטר.
צנטריפוגה הדגימות במלוא המהירות למשך דקה אחת ולהשליך את הזרימה דרך. הוסף 200 microliters של חיץ לשטוף לכל עמודה ולסובב במלוא המהירות במשך דקה אחת, ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר desulphonation לכל עמודה ולאפשר לעמודים לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, סובבו את העמודים במלוא המהירות למשך דקה אחת והשליכו את הזרימה. לשטוף את הטור פעמיים עם 200 microliters של צנטריפוגות חיץ לשטוף במשך דקה אחת במלוא המהירות לאחר כל לשטוף. הוסיפו 46 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לכל עמוד והצבו אותו בצינור פוליפרופילן סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר חד-מיליליטר.
לסובב את הצינורות במשך שתי דקות כדי לחמק מהדנ"א ולהשליך את העמודה. הדנ"א מוכן כעת לניתוח. השתמש בדנ"א שעבר שינוי ביסולפי כתבנית עבור PCR ספציפי מתילציה כמותית כדי להעריך מתילציה של אזור האמרגן בכל ניתוח גנים.
שלב את הריג'נטים כמתואר בכתב היד של הטקסט ולהשתמש בכלי PCR בזמן אמת של 96 באר כדי להפעיל את פרוטוקול האופניים תרמו. המאפיינים של 48 חולים עם סרטן קיבה בקבוצה אימון מוצגים כאן. הגיל החציוני של החולים היה 74 שנים והקבוצה כללה 38 גברים ו -10 נקבות.
ראשית, כל 48 הדגימות הועמסו לזיהוי חריגים. שתי דגימות נתנו פסגות שהיו גדולות משתי סטיות תקן שנעקרו מהאחרות ודגימות אלה הוסרו. מפת החום שנוצרה חולקה לשתי קבוצות המבוססות על מתילציה גבוהה ונמוכה.
מפת חום זו מאפשרת הדמיה של 50 הבדיקות המובילות בתוך 1, 500 זוגות בסיס של אתר ההתחלה של שעתוק בניתוח מתילציה דיפרנציאלית. סוג הסרטן והנוכחות של גרורות בלוטות הלימפה התגלו כגורי חיזוי עצמאיים משמעותיים כאשר הגורמים הפתולוגיים הקליניים שימשו כקובאריאטים בניתוח רב-תכליתי. לבסוף, הגן EPB41L3 נמצא קשור מאוד עם קידוד קבוצת האימון לקבוצות מתילציה גבוהות ונמוכה בניתוח microarray.
התוצאות של ניתוח microarray עבור EPB41L3 בקבוצה הבדיקה אומתו עם PCR כמותי ספציפי מתילציה. RMVs של EPB41L3 ברקמות PGC היו גבוהים באופן משמעותי מאלה של סרטן קיבה קרן בניתוח univariate. באופן דומה, RMVs בדגימות עם גרורות בלוטות הלימפה היו גבוהים באופן משמעותי מאלה ללא גרורות בלוטות הלימפה.
אז זיהוי על רקמת סרטן המתאים ביותר עבור macrodissection על פי החלק המוכתם H&E המתאים נדרש לבצע בהצלחה פרוטוקול זה.
