Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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हम विशेष रूप से सर्जरी विभाग के सभी सदस्यों के लिए आभारी हैं, सिडनी Kimmel व्यापक कैंसर केंद्र जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में उपयोगी चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए । हम क्रिस्टेन रोजर्स को बिसुल्फिट उपचार और क्यूएमएसपी के लिए प्रक्रियाओं पर उदार तकनीकी मार्गदर्शन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-capture+sequencing+vs.+Infinium+450K+methylation+array+for+methylome+analysis+in+clinical+samples.">Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples.</a> Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).</li><li>Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization,+annotation+and+innovative+use+of+Infinium+DNA+methylation+BeadChip+probes.">Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण से सटीक परिणाम प्राप्त करने में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं । पहला प्रतिनिधि एच एंड ई दाग वर्गों के आधार पर अधिमानतः दो योग्य रोगविज्ञानियों द्वारा ट्यूमर क्षेत्र का मैक्रोडिसेक्शन है। गलत मैक्रोडिसेक्शन आसन्न गैर-कैंसर ऊतकों के साथ संदूषण का कारण बन सकता है, जो अविश्वसनीय परिणाम पैदा करता है; इस प्रकार, सावधान मैक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता है। दूसरा डीएनए गुणवत्ता का आकलन है (गुणवत्ता की जांच: QC) । क्यूसी (∆सीक्यू और 5.0) को विफल करने वाले नमूने खराब गुणवत्ता वाले आंकड़े दे सकते हैं। इसलिए, ∆Cq और gt; 5.0 वाले नमूनों को हटाया जाना चाहिए और अन्य का उपयोग किया जाना चाहिए। तीसरा चरण β-मूल्य की गणना है, जो ऐरे प्लेटफॉर्म सॉफ्टवेयर के लिए एक डेटा विश्लेषण उपकरण द्वारा मेथिलेटेड सिग्नल/कुल (मिथाइलेटेड + अनमेथाइलेटेड) सिग्नल17के रूप में निर्धारित किया जाता है। β-मूल्य 0-1 (या 0%-100%) से होता है, जो जैविक रूप से17की व्याख्या करना सरल है। इस मूल्य के साथ मुख्य समस्या इसकी खराब सांख्यिकीय गुण है, क्योंकि इसकी उच्च विषमता का तात्पर्य है कि मिथाइलेशन रेंज चरम सीमा (β = 0 या β = 1) पर नमूनों में भिन्नता17को अत्यधिक कम कर दी गई है। इसके अलावा, खराब नमूना गुणवत्ता के कारण, β-मान प्रजनन योग्य बिफेसिक चोटियों22नहीं दिखा सकते हैं, और ऐसी चोटियों के बिना नमूनों को आगे के अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, बड़े बीटा मूल्यों होने, प्रमोटर क्षेत्र में सीपीजी द्वीपों से संबंधित होने और क्यूएमएसपी के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त होने के मापदंड के आधार पर लक्ष्य जीन चुना जाना चाहिए ।
मानव जीनोम में सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का मूल्यांकन माइक्रोएरी-आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके किया जाता है जिसमें विशिष्ट जीनोमिक लोकी का सर्वेक्षण करने के लिए जांच की एक निश्चित संख्या होती है। यह एपिगेनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (ईडब्ल्यूएएस) में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, इसकी कम लागत, डीएनए की छोटी मात्रा और स्पष्ट रूप से कम नमूना प्रसंस्करण समय के कारण, जो कई नैदानिक नमूनों23के उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण की अनुमति देता है। हालांकि, एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच एपिले आनुवंशिक रूप से परिवर्तित लोकी के लिए जांच की संख्या और विशिष्टता से सीमित है, जो कुछ जीनोमिक क्षेत्रों की खोज को रोकता है। डब्ल्यूजीबीएस को आम तौर पर जीनोमिक कवरेज10 , 11के व्यापक स्पेक्ट्रम के कारण सोने के मानक विधि के रूप मेंदेखा जाताहै । हालांकि, इस विधि में10 , 11नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और अपेक्षाकृत लंबी प्रसंस्करण समयहै। इस प्रकार, यह हमेशा संभव नहीं है। इसकी तुलना में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच लागत और जीनोमिक कवरेज के मामले में उपयोग के लिए उचित है। हाल ही में, नवीनतम उन्नत मनका चिप्स24का उपयोग करने के लिए तैयार हो गया है । ये परख हमें लगभग दोगुनी मापी गई सीपीजी साइटों का विश्लेषण करने में मदद कर सकती हैं, जो बड़े नमूना आबादी के लिए आदर्श जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (जीडब्ल्यूएएस) प्राप्त कर सकती हैं।
संक्षेप में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच के साथ डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में एपिजेनेटिक बायोमार्कर पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। WGBS के साथ तुलना में, यह विधि लागत प्रभावी है और नमूना प्रसंस्करण समय कम कर देता है । इसलिए, सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए इस विधि का व्यापक रूप से एपिजेनेटिक बायोमार्कर अनुसंधान में उपयोग किए जाने की संभावना है।

एपिजेनेटिक्स डीएनए1के अनुक्रम में परिवर्तन किए बिना जीन कार्य में वंशानुगत परिवर्तनों को संदर्भित करता है । इस तरह के बदलाव डीएनए मिथाइलेशन के कारण हो सकते हैं, जिसमें डीएनए बेस पर मिथाइल ग्रुप क्रोमेटिन पैकिंग में बदलाव के जरिए जीन एक्सप्रेशन को बदल सकते हैं । कैंसर का विकास और प्रगति हो सकती है यदि इस प्रभाव के परिणामस्वरूप ट्यूमर दबाने वाले जीन की अभिव्यक्ति बदल जाती है2. उम्र बढ़ने और पुरानी सूजन कैंसर के कारण हैं और मनुष्यों में डीएनए मिथाइलेशन में परिवर्तन के मुख्य कारणहैं 3,4,5. नतीजतन, यह कैंसर निदान में एक बायोमार्कर के रूप में डीएनए मिथाइलेशन के उपयोग की अनुमति देता है, और उपचार और रोकथाम के लिए एक लक्ष्य के रूप में। जल्दी पता लगाने और कैंसर रोग का निदान करने के लिए, डीएनए मिथाइलेशन ट्यूमर, रक्त, मूत्र, और मल के नमूनों में मापा जा रहा है6,जबकि demethylating एजेंटों अब इस तरह के myelodysplastic सिंड्रोम7के रूप में ल्यूकेमिया के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है ।
जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण मानव जीनोम में एक व्यक्ति सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच का उपयोग जीनोम डीएनए8,9में 450,000 से अधिक सीपीजी साइटों की मिथाइलेशन स्थिति की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो कैंसर एपिजेनेटिक्स की खोज की अनुमति देता है (सामग्री की तालिकादेखें)। संपूर्ण जीनोम बिसल्फी अनुक्रमण (डब्ल्यूजीबीएस) प्रौद्योगिकियों ने एपिजेनेटिक्स10,11के क्षेत्र में हमारे दृष्टिकोण को बदल दिया है। हालांकि,10,11नमूनों की एक बड़ी संख्या के एपीजेनेटिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और प्रसंस्करण समय के संदर्भ में प्रौद्योगिकियों के लिए कुछ नुकसान हैं। इसलिए, मानव जीनोम में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच अधिक व्यवहार्य है। जीनोम-व्यापी मिथाइलेशन विश्लेषणों के लिए दृष्टिकोणों की उपलब्धता में पिछले कुछ वर्षों में सुधार हुआ है और हमें अपने ज्ञान का विस्तार करने की अनुमति देता है कि डीएनए मिथाइलेशन कैंसर के विकास और प्रगति12में कैसे योगदान देता है । माइक्रोएरे-प्लेटफ़ॉर्म दृष्टिकोणों में हाल की प्रगति हमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर13में एक उपन्यास एपिजेनेटिक हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण का औचित्य प्रदान करती है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

डीएनए मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक परिवर्तन है जो जैविक रूप से सार्थक है और कैंसर अनुसंधान का लगातार ध्यान केंद्रित करता है। जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) घातक की मिथाइलेशन स्थिति का सटीक विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक उपयोगी उपाय है। डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण के कई संभावित अनुवादात्मक उपयोगों को देखते हुए, चिकित्सकों और डीएनए मिथाइलेशन अध्ययनों के लिए नए दूसरों का अभ्यास करने के लिए कदम से कदम समझने में सक्षम होने की जरूरत है कि कैसे इन जीनोम व्यापक विश्लेषण किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, हम तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं जो जीनोम-व्यापी विश्लेषण के दौरान सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। स्पष्ट रूप से और संक्षिप्त लिखा है, इन तीन तरीकों अक्सर कमी है और एपिजेनेटिक अध्ययन के लिए उन नए करने के लिए ध्यान देने योग्य नहीं हैं । हमने जीआई द्रोह (गैस्ट्रिक कैंसर) के 48 नमूनों का उपयोग व्यावहारिक रूप से उजागर करने के लिए किया कि जीआई घातक के लिए जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण कैसे किया जा सकता है।

प्रशिक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ 48 रोगियों की विशेषताएं इस प्रकार हैं(तालिका 2):रोगियों की औसत आयु 74 वर्ष (52-89 वर्ष) थी, और पलटन में 38 पुरुष (79.2%), और 10 महिलाएं (20.8%) शामिल थीं। 35 मरीज थे (72.9%) प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर के साथ और 13 रोगियों में (27.1%) अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर के साथ (प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर: पेट में एक गैर-मेटास्टेटिक द्रोह की पहली घटना; अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर: अवशेष पेट में कैंसर जो डिस्टल गैस्ट्रेक्टॉमी के बाद 5 साल से अधिक विकसित हुआ, मूल पुनर्सेक्शन19के कारण की परवाह किए बिना)। 23 मरीज थे (47.9%) लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और 25 रोगियों के साथ (52.1%) बिना। सबसे पहले, सभी ४८ नमूनों (प्रशिक्षण पलटन) outliers(चित्रा 1A)की पहचान के लिए लोड किए गए थे । दो नमूनों चोटियों कि दो मानक दूसरों से विस्थापित विचलन से अधिक थे दिया, और इन नमूनों को हटा दिया गया(चित्रा 1B)। इसलिए डीएनए प्रमोटर हाइपरमेथाइलेशन द्वारा 46 नमूनों को क्लस्टर किया गया। परिणामी हीटमैप को उच्च और निम्न मिथाइलेशन(चित्रा 2)के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया गया था। यह हीटमैप अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट (टीएसएस) के 1,500 बीपी के भीतर शीर्ष 50 जांच के दृश्य की अनुमति देता है। उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूह एक आक्रामक घातक फेनोटाइप से संबंधित चिकित्सकीय कारकों में भिन्न थे। यही है, कैंसर के प्रकार (प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर: पीजीसी) (पी = 0.01, बाधाओं अनुपात = 9.09 (1.67-50.00)) और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस की उपस्थिति (सकारात्मक) (पी = 0.03, बाधाओं अनुपात = 6.82 (1.16-40.08)) महत्वपूर्ण स्वतंत्र भविष्य कहनेवाला कारकों के रूप में उभरा जब चिकित्सकीय कारकों बहुविग्रहिक विश्लेषण(तालिका 3)में covariates के रूप में इस्तेमाल किया गया. अंत में, हमने माइक्रोएरे विश्लेषण में उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में प्रशिक्षण पलटन को संहिताबद्ध करने के लिए EPB41L3 जीन20,21 (टेबल 1में दिखाए गए प्राइमर और प्रोब सीक्वेंस) की पहचान की। क्यूएमएसपी का उपयोग करके, परीक्षण पलटन (126 नमूनों) में EPB41L3 के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामों को मान्य किया गया था। परीक्षण पलटन में रोगियों की विशेषताओं को तालिका 4में दिखाया गया है। पीजीसी ऊतकों में EPB41L3 के RMVs एकवायण विश्लेषण (पी = 0.01)(चित्रा 3A)में अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर (आरजीसी) में उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। इसी तरह, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस वाले नमूनों में आरएमवी लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (पी = 0.03)(चित्र 3बी)के बिना उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। इस तरह, डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण हमें जीआई घातक रोगियों में कुछ नैदानिक स्थिति की विशेषता के लिए विशिष्ट जीन की पहचान करने में मदद कर सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> चित्रा 1: 48 नमूनों (प्रशिक्षण पलटन) में बीटा मूल्य। सभी 48 नमूने (प्रशिक्षण पलटन) लोड किए गए थे और आउटलर्स की जांच की गई थी(ए)। दो नमूनों में चोटियां थीं जो आउटलर्स थीं, और इन्हें हटा दिया गया था(बी)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> चित्रा 2: परिणामी हीटमैप। शेष 46 नमूनों को डीएनए प्रमोटर हाइपरमेथाइलेशन द्वारा संकुल किया गया था। हीटमैप को उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में विभाजित किया गया था। यह हीटमैप अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट (टीएसएस) के 1,500 बीपी के भीतर शीर्ष 50 जांच के दृश्य की अनुमति देता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> चित्रा 3: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर (पीजीसी) बनाम अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर (आरजीसी) में EPB41L3 के लिए सापेक्ष मिथाइलेशन मूल्य (आरएमवी) और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस के साथ और बिना मामलों में। परीक्षण पलटन (126 नमूनों) में EPB41L3 के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामों को क्यूएमएसपी का उपयोग करके मान्य किया गया था। (क)एक्यूविलेट विश्लेषण में, पीजीसी ऊतकों में EPB41L3 के आरएमवी आरजीसी (पी = 0.01) की तुलना में काफी अधिक थे। (ख)इसी तरह, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस वाले नमूनों में आरएमवी लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (पी = 0.03) के बिना उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>जीन</td>
			<td>फॉरवर्ड 5 '- 3'</td>
			<td>रिवर्स 5 '- 3'</td>
			<td>जांच</td>
		</tr>
<tr>
<td>बी-ऐक्टिन</td>
			<td>टैग GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG टीटी</td>
			<td>एएसी एसीए सीएए टीएए सीएएए सीएए एटीटी सीएसी</td>
			<td>\ 56-FAM\ TGT GGG GTG \ ZEN \ GTG ATG GAG GAG GTT टैग \ 3IABkFQ \</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG C</td>
			<td>एटीए एएए एटीसी सीसीजी एसीजी एसीसी जीए</td>
			<td>एएए टीटीसी GAA एएए सीसीजी सीजीसी जीएसी जीसीसी गाया एसीसी ए</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: प्राइमर और जांच दृश्यों।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>क्लीनिकोपैथिक कारक</td>
			<td>चर</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>उम्र</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>लिंग</td>
			<td>पुरुष/महिला</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रकार</td>
			<td>पीजीसी/आरजीसी</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>लिम्फ नोड मेटास्टेसिस</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर, आरजीसी: अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* औसत (न्यूनतम-अधिकतम)</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: प्रशिक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ 48 रोगियों में विशेषताएं।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>पी-वैल्यू</td>
			<td>बाधाओं अनुपात</td>
			<td>95% आत्मविश्वास अंतराल</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रकार (पीजीसी)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">पीजीसी: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 3: उच्च मिथाइलेशन समूह (क्लस्टर बी) के लिए भविष्य कहनेवाला कारक।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>क्लीनिकोपैथिक कारक</td>
			<td>चर</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>उम्र</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>लिंग</td>
			<td>पुरुष/महिला</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रकार</td>
			<td>पीजीसी/आरजीसी</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>लिम्फ नोड मेटास्टेसिस</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर, आरजीसी: अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* औसत (न्यूनतम-अधिकतम)</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 4: परीक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ १२६ रोगियों में विशेषताओं।

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

इसके साथ ही, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में डीएनए मिथाइलेशन के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। प्रक्रिया अध्ययन के लिए प्रासंगिकता की है कि जीन के मिथाइलेशन पैटर्न और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में कैंसरजनन के लिए योगदान कारकों के बीच संबंधों की जांच ।

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में डीएनए मिथाइलेशन का जीनोम-वाइड विश्लेषण

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

तो डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-मानव जीनोम में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल विचलन के लिए ला मंच के साथ व्यापक विश्लेषण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में एपिजेनेटिक बायोमार्कर की महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है । हालांकि मानव जीनोम में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल विचलन के लिए यह ला मंच, यह लागत और जीनोमिक कवरेज के मामले में इष्टतम है । तो प्रक्रिया का प्रदर्शन Hirotaka Momose, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा ।शुरू करने के लिए, अन दाग औपचारिक-निश्चित पैराफिन एम्बेडेड वर्गों के 10 माइक्रोमीटर तैयार करें। स्लाइड्स में एक ग्लास स्लाइड होल्डर को रखें और उसे नमकीन से भर दें, जिससे स्लाइड पर मौजूद सभी टिश्यू जलमग्न हो जाएं। स्लाइड्स में जाइलीन को 15 मिनट के लिए छोड़ दें, फिर स्लाइड्स को पिपेट टिप के साथ पकड़ते समय जाइलीन डाल दें ताकि वे बाहर न गिरें।पहले की तरह ही स्तर पर अधिक जाइलीन में डालो और इनक्यूबेशन दोहराएं। जाइलीन डालो और 100% इथेनॉल के साथ स्लाइड धारक को भरने, सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर सभी ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है। तीन मिनट के लिए इथेनॉल में स्लाइड छोड़ दें, फिर इथेनॉल को ताजा इथेनॉल से बदल दें और उन्हें दो मिनट और इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।इथेनॉल बंद डालो और स्लाइड्स हटा दें। ध्यान से उन्हें एक साफ कागज तौलिया पर चेहरा जगह है और उन्हें 10 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति देते हैं। लाइसिस बफर के 80 माइक्रोलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर सिंगल-यूज पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब भरें और बफर में एक साफ पिपेट टिप डालें।उपयुक्त एच एंड ई दाग अनुभाग के अनुसार मैक्रोडिसेक्शन के लिए सबसे उपयुक्त ट्यूमर क्षेत्र के कैंसर ऊतकों की पहचान करें, फिर चिह्नित अनुभाग के आधार पर कैंसर ऊतक को मैक्रोडिसेक्ट करें। एक साफ रेजर ब्लेड ले लो और धीरे से यह एक टुकड़ा में रखने की कोशिश कर स्लाइड के बंद कैंसर के ऊतकों परिमार्जन । स्क्रैप किए गए ऊतकों को लाइसिस बफर शीशी में स्थानांतरित करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें।इस प्रक्रिया को बाकी स्लाइड्स के साथ दोहराएं। सभी ऊतकों ट्यूब में है के बाद, टिप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हो गया था और दीवार के लिए अटक नहीं है । शीशी में सबटाइसिन से संबंधित सेरीन प्रोटीज के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे से झटका।शीशी को कम से कम चार घंटे या रात भर के लिए 55 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखें, जिससे दो घंटे के बाद थोड़ा भंवर होना सुनिश्चित हो जाए। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बिसुल्फिट रूपांतरण किट का उपयोग करके पचा ऊतक के 45 माइक्रोलीटर पर बिसुल्फिट उपचार करें। नमूने में कमजोर पड़ने वाले बफर के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इस बीच, सीटी कन्वर्जन रिएजेंट की एक ट्यूब में आसुत पानी के 750 माइक्रोलीटर और तनु पड़ने बफर के 210 माइक्रोलीटर जोड़कर बिस्लफिट कन्वर्जन रिएजेंट तैयार करें। 10 मिनट के लिए भंवर से ट्यूबों को मिलाएं, फिर तैयार सीटी रूपांतरण रिएजेंट के 100 माइक्रोलीटर को प्रत्येक नमूने में जोड़ें और उलटा करके मिलाएं। 12 से 16 घंटे तक अंधेरे में नमूनों को 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। बाइंडिंग बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रत्येक नमूने को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। प्रत्येक नमूने को स्पिन कॉलम में लोड करें और कॉलम को दो मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखें।एक मिनट के लिए पूरी गति से नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। प्रत्येक कॉलम में वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन करें, फिर प्रवाह के माध्यम से त्यागें। प्रत्येक कॉलम में डिफ्लोशन बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और कॉलम को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने की अनुमति दें।इनक्यूबेशन के बाद, कॉलम को एक मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। प्रत्येक धोने के बाद पूरी गति से एक मिनट के लिए वॉश बफर सेंट्रलाइजिंग के 200 माइक्रोलीटर के साथ कॉलम को दो बार धोएं। प्रत्येक कॉलम में आसुत पानी के 46 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे एक नए बाँझ 1.5 मिलीलीटर एकल-उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में रखें।डीएनए को elute और कॉलम त्यागने के लिए दो मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन । डीएनए अब विश्लेषण के लिए तैयार है । प्रत्येक जीन विश्लेषण में प्रमोटर क्षेत्र के मिथाइलेशन का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में बिसुलफाइल संशोधित डीएनए का उपयोग करें।पाठ पांडुलिपि में वर्णित अभिकर्णों को मिलाएं और थर्मो साइकिलिंग प्रोटोकॉल चलाने के लिए 96-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर उपकरण का उपयोग करें। प्रशिक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के 48 रोगियों की विशेषताओं को यहां दिखाया गया है। मरीजों की औसत उम्र ७४ साल थी और पलटन में ३८ पुरुष और 10 महिलाएं शामिल थीं ।सबसे पहले आउटलियर्स की पहचान के लिए सभी 48 सैंपल भरे गए थे। दो नमूनों चोटियों कि दो मानक दूसरों से विस्थापित विचलन से अधिक थे और इन नमूनों को हटा दिया गया । परिणामी गर्मी मानचित्र को उच्च और निम्न मिथाइलेशन के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया गया था।यह हीट मैप अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट के 1, 500 आधार जोड़े के भीतर शीर्ष 50 जांच के दृश्य की अनुमति देता है। कैंसर का प्रकार और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस की उपस्थिति महत्वपूर्ण स्वतंत्र भविष्य कहनेवाला कारकों के रूप में उभरी जब नैदानिक रोग कारकों को बहुविध विश्लेषण में सहवाद के रूप में उपयोग किया जाता था। अंत में, EPB41L3 जीन को माइक्रोएरे विश्लेषण में उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में प्रशिक्षण पलटन को संहिताबद्ध करने के साथ दृढ़ता से जुड़ा हुआ पाया गया ।परीक्षण पलटन में EPB41L3 के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामों को मात्रात्मक मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर के साथ मान्य किया गया था। पीजीसी ऊतकों में EPB41L3 के RMVs यूनिवेरिएट विश्लेषण में अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर में उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे । इसी तरह, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस वाले नमूनों में आरएमवी लिम्फ नोड मेटास्टेसिस के बिना उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे।तो कैंसर के ऊतकों पर पहचान सबसे उपयुक्त एच एंड ई दाग अनुभाग के अनुसार मैक्रोडिसेक्शन के लिए उपयुक्त इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने के लिए आवश्यक है।

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