Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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우리는 특히 외과학과의 모든 구성원, 유용한 토론과 기술 지원을 위한 존스 홉킨스 대학 의과 대학에 시드니 킴멜 포괄적인 암 센터에 감사드립니다. 우리는 또한 양성화 치료 및 qMSP에 대한 절차에 관대 한 기술 지침을 크리스틴 로저스 감사합니다.

그 에 따른 모든 절차는 기관의 인간 연구 윤리위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다. 이 연구는 준텐도 대학 시즈오카 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며, 회고적 설계로 인해 서면 동의가 면제되었습니다.
1. 슬라이드 세척
<ol><li>스테인드 포머린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 섹션의 10 μm을 준비합니다.</li>
	<li>슬라이드를 유리 슬라이드 홀더에 배치: 조직이 최소화되지 않는 한 약 3-5개의 가장 큰 단면 슬라이드를 사용하고 더 많은 슬라이드가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>슬라이드 홀더에 자일렌을 채우고 슬라이드의 모든 조직이 침수되었는지 확인합니다. 15분 동안 앉습니다.</li>
	<li>15분 후, 슬라이드가 떨어지지 않도록 피펫 팁으로 슬라이드를 들고 자일렌을 부수십시오.</li>
	<li>이전과 같은 수준으로 더 많은 자일렌을 붓습니다. 15분 동안 앉습니다.</li>
	<li>15분 후, 다시 자일렌을 붓습니다.</li>
	<li>슬라이드 홀더를 100% 에탄올(EtOH)으로 채우고 슬라이드의 모든 조직이 완전히 침수되었는지 확인합니다. 3 분 동안 앉도록 허용하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 슬라이드를 들고있는 동안 EtOH를 부어. EtOH를 더 많이 사용하여 동일한 수준으로 리필하십시오. 2 분 동안 앉습니다.</li>
	<li>EtOH를 다시 붓고 슬라이드를 제거합니다. 조심스럽게 깨끗한 종이 타월에 얼굴을 올려 놓고 건조시다. 10 분 동안 앉습니다.</li>
</ol>2. 슬라이드 를 긁어
<ol><li>650mL의 디틸피로카보네이트(DEPC)-처리수, 에틸렌디아미네트라아세아제산 100mL(EDTA), 트리스 염산염 50ml(Tris-HCL) 2M pH 8.8, 200mL의 100mL(100mL)의 소화/용액 완충제를 준비한다. </li>
	<li>소화/용해 버퍼 의 80 μL1.5 mL 일회용 폴리 프로필렌 튜브를 채웁니다 (재료의 표참조).</li>
	<li>버퍼에 깨끗한 파이펫 팁을 넣습니다.</li>
	<li>적절한 H&E 염색 섹션에 따라 거시 절제술에 가장 적합한 종양 영역의 암 조직을 식별합니다. 참고: 거시절제술을 위한 종양 지역은 바람직하게는 2명의 자격을 갖춘 병리학자에 의해 확인되어야 합니다.</li>
	<li>표시된 H&E 염색 단면을 기반으로 한 거시적 암 조직.<ol>
<li>깨끗한 면도날을 가지고 부드럽게 슬라이드에서 암 조직을 긁어, 그것은 쉽게 작업 할 수 있도록 한 조각으로 유지하려고.</li>
		<li>파이펫 팁을 버퍼를 함유한 일회용 폴리프로필렌 튜브에서 꺼내 폐기된 조직을 완충 유리병으로 옮기는 데 사용합니다(재료표참조). 참고 : 젖은 팁은 조직을 유치해야하므로 전달이 더 쉬워집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드의 나머지 부분과 함께 2.5 단계를 반복합니다.</li>
	<li>모든 조직이 일회용 폴리 프로필렌 튜브에 있는 후에, 조직이 완전히 잠기고 관의 벽에 붙어 있지 않다는 것을 확인하기 위하여 팁을 이용하십시오.</li>
	<li>바이알에 서브틸리신 관련 세린 프로테아제 20 μL을 넣고 부드럽게 섞어 주세요(재료표참조).</li>
	<li>바이알을 55°C 의 열 블록에 적어도 4시간 또는 하룻밤 동안 놓습니다. 2 시간 후에 약간 소용돌이해야합니다.</li>
</ol>3. 비설피테 트리트먼트
<ol><li>소화된 조직 용액의 45 μL을 샘플로 사용하십시오.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 양황피 변환 키트에서 시약을 사용하여 비설피트 처리를 수행하십시오(재료표참조).<ol>
<li>DNA 샘플에 희석 버퍼 5μL을 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다(재료 표참조).</li>
		<li>시료가 배양하는 동안, DH2O의 750 μL 및 210 μL의 희석 버퍼를 CT 변환 시약의 한 튜브에 추가하여 양성환 변환 시약을 준비합니다(재료표참조). 10 분 동안 소용돌이에 의해 튜브를 혼합.</li>
		<li>15분 인큐베이션 후, 준비된 CT 변환 시약의 100 μL을 각 샘플에 넣고 반전으로 섞는다.</li>
		<li>12 ~16h동안 50°C에서 어둠 속에서 샘플을 배양한다.</li>
		<li>인큐베이션 후 샘플을 제거하고 얼음 위에 10분 동안 놓습니다.</li>
		<li>바인딩 버퍼400 μL을 추가하고 위아래로 파이프팅하여 각 샘플을 혼합합니다(재료 표참조). 각 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다(재료 표참조).</li>
		<li>원심분리기는 각 샘플을 최고 속도(10,000 x g)로1분 동안 제거하고 유동을 폐기합니다.</li>
		<li>각 열에 200 μL의 워시 버퍼를 추가하고 최대 속도로 1분 동안 회전하여 유동을 버립니다(재료 표참조).</li>
		<li>각 열에 200 μL의 절황 버퍼를 추가하고 기둥이 실온에서 15분 동안 서 있도록 합니다(재료 표참조). 인큐베이션 후, 1 분 동안 최고 속도로 열을 회전하고 흐름을 폐기합니다.</li>
		<li>각 열에 200 μL의 워시 버퍼를 추가하고 1 분 동안 최고 속도로 회전합니다 (재료 표참조).</li>
		<li>이 단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
		<li>각 컬럼에 dH2O의 46 μL을 추가하고 각 컬럼을 새로운 멸균 1.5mL 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다(재료 표참조). 각 튜브를 2분 동안 회전하여 DNA를 엘로우시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일회용 폴리프로필렌 튜브에서 각 스핀 컬럼을 제거하고 폐기합니다(재료 표참조). DNA는 지금 분석을 위한 준비가 되었습니다.</li>
</ol>4. 인간 게놈의 CpG 궤적에서 DNA 메틸화 평가를 위한 어레이 플랫폼
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 후속 데이터 분석이 수행됨을 통해 실시간 PCR 증폭 및 검출 기기에서 FFPE QC 분석을 사용하여 DNA(품질 검사: QC)의 품질을 평가합니다(재료 표참조). 참고: 권장 5.0보다 ∆Cq 값이 적은 샘플은14로추가 처리됩니다.</li>
	<li>DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼으로 샘플을 분석하여 게놈내의 >450,000 CpG 부위의 메틸화 상태를 평가합니다(재료표참조). 어레이 플랫폼용 제품 정보 시트, 데이터 시트 및 제품 파일은15를사용할 수 있습니다. 참고 : 분석은 FFPE 재료(14)에대한 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.</li>
	<li>배열 플랫폼에 대한 데이터 분석 도구에서 높고 낮은 메틸화를 각각 0에서 1까지의 범위로 β 값으로 계산합니다(재료 표참조). 시판되는 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 β 값을 계산합니다.</li>
	<li>R 소프트웨어 환경(R v.2.15.1)으로 DNA 메틸화 플랫폼의 복잡한 평가를 위해 어레이 플랫폼에서 생성된 데이터를 가져오고 메틸화어레이(16,17)를분석하기 위한 도구를 사용하여 처리한다. 참고: 데이터 분석 도구를 사용하여 생성된 히트맵에서 열은 감독되지 않은 클러스터링에 의해 정렬되는 반면 행 순서는 위에서 아래로 차분 메틸화에 대한 t 통계의 중요성을 감소시키는 것입니다.</li>
	<li>히트맵을 감독되지 않은 클러스터링의 첫 번째 분화기로 높고 낮은 메틸화 그룹으로 나눕니다. 참고: 정량메틸화 특이PCR(qMSP)을 사용하여 유효성 검사를 위해, 프로모터 지역의 CpG 제도와 관련하여 더 큰 β 가치에 기초하여 유전자를 선택하고 qMSP에 대한 프라이머 및 프로브 설계에 대한 적합성으로 인해 유전자를 선택합니다.</li>
</ol>5. 정량적 메틸화-특정 PCR(qMSP)
<ol><li>각 유전자 분석에서 프로모터 영역의 메틸화를 평가하기 위해 qMSP에서 형광 계 실시간 PCR을 위한 템플릿으로서 3.3 단계에서 비설피테 변형 DNA를 사용한다.</li>
	<li>96웰 의 실시간 PCR 계측기를 사용하여 qMSP를 수행하십시오(재료 표참조).<ol>
<li>200nM 포워드 프라이머, 200nM 역프라이머 및 80nM 프로브를 사용하여 양성환 변형 DNA에 대한 표적 유전자의 프로모터 메틸화 상태를 확인한다. 마스터 믹스는 16.6 mM (NH4)2SO4,67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-메르카토에탄올, 10 nM 플루오레세인, 0.166 mM각 데옥시뉴타이드 트리포산염, 및 0.04 U/μl의 중합체 DNA(표 참조)로 마스터 믹스를 준비한다. 모든 에세이에 대한 각 음의 최종 반응 부피는 25 μL입니다.</li>
		<li>qMSP의 사이클링을 5분 동안 95°C, 15초 동안 95°C, 1분 동안 60°C, 72°C로 1분 동안 실시합니다. 참고: 표적 유전자는 더 큰 베타 값을 갖는 기준에 따라 선택되어야 하며, 프로모터 지역의 CpG 섬과 관련이 있으며, qMSP를 위한 프라이머 및 프로브 설계에 적합해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CpG 메틸라제(M.SssI)로 처리된 인간 게놈을 양성 메틸화 제어로 사용합니다(재료표참조). 참고: 메틸화의 최종 정량화는 상대 메틸화 값(RMV)으로 정의되고, 각 메틸화 검출 복제에 대해2-ΔΔCt로 계산되며, β-Actin(ACTB)18에대한 평균 Ct에 비해 복제된다. 프라이머 및 프로브 시퀀스는 표 1에표시됩니다. 100의 Ct는 탐지되지 않은 복제에 사용되며, 값은 2-ΔΔCt의 값을 0에 가깝게 제공합니다. 다음 수식은 사용됩니다: 평균 2-ΔΔCt (RMV) = =(2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2-ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.</li>
</ol>

<ol>
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DNA 메틸화 게놈 전체 분석에서 정확한 결과를 얻는 데는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 대표적인 H&E 염색 단면에 기초한 2명의 적격병리학자에 의하여 종양 영역의 거시적 절제이다. 부정확한 거시절제술은 신뢰할 수 없는 결과를 낳는 인접한 비암 조직으로 오염을 일으킬 수 있습니다. 따라서 신중한 거시적 절이 필요합니다. 두 번째는 DNA 품질 평가입니다 (품질 검사 : QC). QC(∆Cq > 5.0)에 실패한 샘플은 품질이 좋지 않은 데이터를 제공할 수 있습니다. 따라서 ∆Cq > 5.0을 사용한 샘플을 제거하고 다른 샘플을 사용해야 합니다. 제3단계는 어레이 플랫폼 소프트웨어에 대한 데이터 분석 도구에 의해 메틸화 신호/총(메틸화 + 미수정)신호(17)로결정되는 β 값의 계산이다. β 값은 0-1(또는 0%-100%)이며생물학적으로해석하기는 간단합니다. 이 값의 주요 문제는 높은 이종성 극한 (β = 0 또는 β = 1)에서 샘플에 걸쳐 분산이 매우감소17것을 의미하기 때문에, 그 가난한 통계 속성이다. 또한, 시료 품질 저하로 인해 β 값은 재현 가능한 biphasic피크(22)를나타내지 않을 수 있으며, 이러한 피크가 없는 샘플은 추가 연구에서 제외되어야 합니다. 또한, 표적 유전자는 더 큰 베타 값을 갖는 기준에 기초하여 선택되어야 하며, 프로모터 영역에서 CpG 섬과 관련이 있으며, qMSP를 위한 프라이머 및 프로브 설계에 적합해야 한다.
인간 게놈의 CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 평가는 특정 게놈 loci를 조사하기 위해 고정된 수의 프로브를 가진 마이크로어레이 기반 기술을 사용하여 수행됩니다. 그것은 많은 임상 샘플(23)의높은 처리량 처리를 허용하는 그것의 저비용, 소량의 DNA 요구되고 현저하게 더 짧은 견본 처리 시간으로 인해 후성 유전체 전체 협회 연구 (EWAS)에서 가장 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 개별 CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼은 일부 게놈 영역의 탐사를 방지하는 후생유전학적으로 변경된 loci에 대한 프로브의 수와 특이성에 의해 제한됩니다. WGBS는 일반적으로 게놈 커버리지10,11의넓은 스펙트럼으로 인해 금 표준 방법으로 간주됩니다. 그러나, 이 방법은 많은 수의샘플(10)및11을분석하기 위한 상당한 비용과 비교적 긴 처리 시간을 갖는다. 따라서 항상 가능한 것은 아닙니다. 이에 비해, 인간 게놈내의 개별 CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼은 비용 및 게놈 커버리지 측면에서 사용하기에 합리적이다. 최근 업그레이드 된 비드 칩은24를사용할 준비가되었습니다. 이 분석은 우리가 큰 견본 인구를 위한 이상적인 게놈 전체 협회 연구 결과 (GWAS)를 달성할 수 있는 거의 두 배 측정된 CpG 사이트를 분석하는 것을 도울 수 있습니다.
요약하면, 인간 게놈의 개별 CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼을 가진 DNA 메틸화 게놈 전체 분석은 위장암에 있는 후성유전학 바이오마커에 중요한 정보를 제공할 수 있다. WGBS와 비교하여 이 방법은 비용 효율적이며 샘플 처리 시간을 줄입니다. 따라서, CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 검출을 위한 이 방법은 후성 유전학 바이오마커 연구에서 널리 사용될 가능성이 높다.

후성유전학은 DNA1의서열을 변경하지 않고 유전자 기능에 있는 유전가능한 변경을 말합니다. 이러한 변화는 DNA 메틸화 때문일 수 있으며, DNA 기지에 메틸 군은 크로마티닌 포장의 변화를 통해 유전자 발현을 변경할 수 있다. 이러한 효과가 종양 억제유전자2의변경된 발현을 초래하는 경우 암 발달 및 진행이 발생할 수 있다. 노화와 만성 염증은 모두 암의 원인과 인간에서 DNA 메틸화의 변화에 대한 주된 이유입니다3,4,5. 따라서, 이것은 암 진단에 있는 biomarker로 DNA 메틸화를 이용하고, 처리 및 예방을 위한 표적으로 이용을 허용합니다. 조기 발견 및 암 예후를 위해, DNA 메틸화는 종양, 혈액, 소변 및 대변 샘플6에서측정되고 있으며, 탈질제는 현재 골수성 플라스틱 증후군7과같은 백혈병을 치료하는 데 사용되고 있다.
인간 게놈의 개별 CpG 궤적에서 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼을 이용한 게놈 전체 DNA 메틸화 분석은 유전체 DNA8,9에서450,000개 이상의 CpG 부위의 메틸화 상태를 검사하는 데 활용될 수 있으며, 이는 암 후성유전학의 탐사를 허용한다(재료의 표참조). 전체 게놈 편술피테 시퀀싱(WGBS) 기술은 후성유전학10,11분야에서 우리의 접근 방식을 변화시켰다. 그러나, 많은 수의시료(10,11)의후생유전학적 분석을 위한 상당한 비용 및 처리 시간의 관점에서 기술에 대한 몇 가지 단점이 있다. 따라서, 어레이 플랫폼은 인간 게놈에서 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위해 더 실현 가능하다. 게놈 전체 메틸화 분석을 위한 접근의 가용성은 지난 몇 년 동안 향상되었으며 DNA 메틸화가 암 발달 및 진행 에 어떻게 기여하는지에 대한 지식을 확장할 수 있게 합니다12. 마이크로어레이 플랫폼 접근법의 최근 진행은 위장관암13에서새로운 후생유전학적 시그니처를 식별하기 위한 게놈 전체 메틸화 분석의 근거를 제공한다. 이 프로토콜의 목표는 이 방법이 GI 악성종양에서 바이오마커 식별에 어떻게 사용되는지에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

DNA 메틸화는 생물학적으로 의미 있고 암 연구의 빈번한 초점인 중요한 후생유전학적 변화입니다. 게놈 전체 DNA 메틸화는 위장관(GI) 악성종양의 메틸화 상태를 정확하게 분석하는 유용한 척도이다. DNA 메틸화 분석의 여러 잠재적 번역 사용을 감안할 때, DNA 메틸화 연구에 새로운 임상의 및 그 외를 실행하는 것은 이 게놈 전체 분석이 어떻게 수행되는지 단계별로 이해할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜의 목표는 이 방법이 GI 악성종양에서 바이오마커 식별에 어떻게 사용되는지에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 중요한 것은 게놈 전체 분석 중에 정확한 결과를 얻는 데 필요한 세 가지 중요한 단계를 설명합니다. 명확하고 간결하게 쓰여진 이 세 가지 방법은 종종 부족하고 후성 유전학 연구에 새로운 사람들에게 눈에 띄지 않습니다. 우리는 GI 악성 종양 (위암)의 48 개의 샘플을 사용하여 게놈 전체 DNA 메틸화 분석이 GI 악성 종양을 위해 수행 될 수있는 방법을 실질적으로 강조했습니다.

훈련 코호트에서 위암을 가진 48명의 환자의 특성은 다음과 같습니다(표 2):환자의 평균 연령은 74 세 (52-89 세), 코호트는 38 명의 남성 (79.2%), 10 명의 여성 (20.8%)을 포함했다. 35명의 환자가 있었습니다 (72.9%) 1차 위암과 13명의 환자(27.1%)를 가진 환자 잔류 위암 (1 차 위암: 위장에 있는 비 전이성 악성 종양의 첫번째 발생; 잔재한 위암: 원래절제술에대한 이유에 관계없이, 해위 위절제술 후에 5 년 이상 발전한 남은 위장에 있는 암). 23명의 환자가 있었습니다 (47.9%) 림프절 전이와 25 명의 환자 (52.1 %)를 가진 없이. 첫째, 모든 48개의 샘플(트레이닝 코호트)은 이상치(도1A)의식별을 위해 로드되었다. 두 개의 샘플은 다른 샘플에서 변위된 두 개의 표준 편차보다 큰 피크를 주었고, 이러한 샘플은 제거되었다(그림1B). 따라서, 46개의 샘플은 DNA 프로모터 고메틸화에 의해 클러스터되었다. 결과 히트맵은 높고 낮은 메틸화(도2)를기준으로 두 그룹으로 나뉘었다. 이 히트맵을 사용하면 차동 메틸화 분석에서 전사 시작 부위(TSS)의 1,500bp 이내의 상위 50개의 프로브를 시각화할 수 있습니다. 높고 낮은 메틸화 그룹은 공격적인 악성 표현형과 관련된 임상 병리학 적 요인에서 달랐다. 즉, 암의 유형(1차 위암: PGC) (p = 0.01), 확률비율 = 9.09(1.67-50.00)와 림프절 전이(양성)의 존재(p = 0.03, 확률비율 = 6.82(1.16-40.08))는 임상병리학적 인자가 다변량 분석에서 코바리아테로 사용될 때 유의한 독립적인 예측 요인으로 나타났다. 마지막으로, EPB41L3유전자(20) 20,21(표 1에도시된 프라이머 및 프로브 서열)이 마이크로어레이 분석에서 높고 낮은 메틸화 그룹으로 훈련 코호트를 명문화하는 것과 강하게 연관되는 것을 확인하였다. qMSP를 사용하여, 시험 코호트(126개 샘플)에서 EPB41L3에 대한 마이크로어레이 분석의 결과가 검증되었다. 시험 코호트에서 환자의 특성은 표 4에도시된다. PGC 조직에서 EPB41L3의 RMV는 단변분석(p=0.01)에서 잔류위암(RGC)에 비해 현저히높았다(그림 3A). 유사하게, 림프절 전이를 가진 샘플에서 RMV는 림프절 전이가 없는 샘플(p = 0.03)(도 3B)보다상당히 높았다. 이런 식으로 DNA 메틸화 게놈 전체 분석은 GI 악성 종양환자를 가진 환자에서 특정 임상 상태를 특성화하기 위해 특정 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> 그림 1: 48개의 샘플(교육 코호트)의 베타 값입니다. 모든 48개의 샘플(훈련 코호트)이 적재되었고이상값을 검사하였다(A). 두 개의 샘플은 이상값인 피크를 가지고 있었고, 이들은 제거되었다(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> 그림 2: 결과 히트맵. 나머지 46개의 샘플은 DNA 프로모터 고메틸화에 의해 클러스터되었다. 히트맵은 높고 낮은 메틸화 그룹으로 나뉘었다. 이 히트맵을 사용하면 차동 메틸화 분석에서 전사 시작 부위(TSS)의 1,500bp 이내의 상위 50개의 프로브를 시각화할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> 그림 3: 1차 위암(PGC) 대 잔류위암(RGC)에서 EPB41L3에 대한 상대메틸화 값(RMV)과 림프절 전이의 유무에 관계없이. 시험 코호트(126개 샘플)에서 EPB41L3에 대한 마이크로어레이 분석 결과는 qMSP를 사용하여 검증되었다. (A)단일변변면 분석에서, PGC 조직에서 EPB41L3의 RMV는 RGC(p = 0.01)에 비해 상당히 높았다. (B)유사하게, 림프절 전이를 가진 샘플에서 RMV는 림프절 전이가 없는 샘플(p = 0.03)보다 상당히 높았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자</td>
			<td>포워드 5' - 3'</td>
			<td>리버스 5' - 3'</td>
			<td>프로브</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-액틴</td>
			<td>태그 GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT</td>
			<td>AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC</td>
			<td>\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG 개그 GTT 태그 \3IABkFQ\</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG C</td>
			<td>ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 프라이머 및 프로브 시퀀스.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>임상 병리학 적 요인</td>
			<td>변수</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>연령</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>성별</td>
			<td>남성 / 여성</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>형식</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>림프절 전이</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: 1차 위암, RGC: 잔재위암</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 중앙값(최소 최대값)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 훈련 코호트에서 위암 환자 48명의 특성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>P-값</td>
			<td>배당률</td>
			<td>95% 신뢰 구간</td>
		</tr>
<tr>
<td>유형(PGC)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>림프절 전이 (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC: 1차 위암</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 높은 메틸화 군(클러스터 B)에 대한 예측 인자.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>임상 병리학 적 요인</td>
			<td>변수</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>연령</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>성별</td>
			<td>남성 / 여성</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>형식</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>림프절 전이</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: 1차 위암, RGC: 잔재위암</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 중앙값(최소 최대값)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 시험 코호트에서 위암 환자 126명의 특성.

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

본명, 위장관암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석을 위한 절차를 기술하고 있다. 절차는 유전자의 메틸화 패턴과 위장암에 있는 발암발생에 기여하는 요인 사이 관계를 조사하는 연구 결과에 관련성입니다.

위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

따라서 인간 게놈에서 DNA 메틸화의 복잡한 수차를 위한 LA 플랫폼을 가진 DNA 메틸화 게놈 전체 분석은 위장암에 있는 후생유전학 바이오마커의 중요한 정보를 제공할 수 있다. 인간 게놈에서 DNA 메틸화의 복잡한 수차를 위한 이 LA 플랫폼은, 비용 및 게놈 엄호의 관점에서 최적입니다. 그래서 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 히로타카 모모세 (Hirotaka Momose)가 될 것입니다.시작하려면, 스테인드 포름핀 고정 파라핀 임베디드 섹션의 10 마이크로 미터를 준비합니다. 슬라이드를 유리 슬라이드 홀더에 놓고 식염수로 채우면 슬라이드의 모든 조직이 침수되었는지 확인합니다. 15 분 동안 자일렌에 슬라이드를 두고, 그들이 빠지지 않도록 피펫 팁슬라이드를 들고 있는 동안 자일렌을 부어.이전과 같은 수준으로 더 많은 자일렌을 붓고 인큐베이션을 반복합니다. 자일렌을 붓고 슬라이드 홀더를 100% 에탄올로 채우고 슬라이드의 모든 조직이 완전히 침수되었는지 확인합니다. 슬라이드를 에탄올에 3분간 남긴 다음 에탄올을 신선한 에탄올로 교체하고 2분 더 배양할 수 있도록 합니다.에탄올을 붓고 슬라이드를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월에 조심스럽게 올려놓고 10분 동안 건조시키십시오. 1.5 밀리리터 일회용 폴리프로필렌 튜브에 80마이크로리터의 용해 버퍼를 채우고 깨끗한 파이펫 팁을 버퍼에 넣습니다.적절한 H&E 염색 섹션에 따라 거시분해에 가장 적합한 종양 영역의 암 조직을 확인한 다음 표시된 단면을 기반으로 암 조직을 거시화한다. 깨끗한 면도날을 가지고 부드럽게 한 조각으로 유지하려고 슬라이드에서 암 조직을 긁어. 파이펫 팁을 사용하여 긁힌 조직을 용해 완충병으로 옮길 수 있습니다.슬라이드의 나머지 부분과 함께 이 프로세스를 반복합니다. 모든 조직이 튜브에 있는 후에, 조직이 완전히 잠기고 벽에 붙어 있지 않다는 것을 확인하기 위하여 팁을 이용하십시오. 바이알에 서브틸리신 관련 세린 프로테아제 20 마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞어주세요.바이알을 섭씨 55도 의 열 블록에 적어도 4 시간 또는 하룻밤 동안 배치하여 2 시간 후에 약간 소용돌이해야합니다. 제조업체의 지시에 따라 비설피트 변환 키트를 사용하여 소화된 조직의 45 마이크로리터에서 비설피트 치료를 수행하십시오. 5마이크로리터의 희석 버퍼를 샘플에 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.한편, 증류수 750마이크로리터와 210마이크로리터의 희석 버퍼를 CT 변환 시약 의 한 튜브에 추가하여 양성환 변환 시약을 준비한다. 10 분 동안 소용돌이에 의해 튜브를 혼합 한 다음 각 샘플에 준비 된 CT 변환 시약의 100 마이크로 리터를 추가하고 반전으로 혼합합니다. 12~16시간 동안 50도의 어둠 속에서 샘플을 배양합니다.인큐베이션 후 샘플을 얼음 위에 10분 간 놓습니다. 바인딩 버퍼의 400 마이크로 리터를 추가하고 위아래로 파이펫하여 각 샘플을 혼합합니다. 각 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 2밀리리터 수집 튜브에 넣습니다.샘플을 1분 동안 최고 속도로 원심분리하고 흐름을 폐기합니다. 각 컬럼에 200마이크로리터의 워시 버퍼를 추가하고 1분 동안 최고 속도로 회전한 다음 흐름을 폐기합니다. 각 열에 200 마이크로리터의 황하 버퍼를 추가하고 기둥이 실온에서 15분 동안 서 도록 합니다.인큐베이션 후 1분 동안 최고 속도로 열을 회전시키고 흐름을 폐기합니다. 매 세척 후 최대 속도로 1 분 동안 세척 버퍼 원심 분리200 마이크로 리터로 컬럼을 두 번 세척하십시오. 각 컬럼에 증류수 46마이크로리터를 넣고 새로운 멸균 1.5 밀리리터 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.2 분 동안 튜브를 회전하여 DNA를 엘로우고 컬럼을 폐기하십시오. DNA는 지금 분석을 위한 준비가 되었습니다. 각 유전자 분석에서 프로모터 영역의 메틸화를 평가하기 위해 정량적 메틸화 특이 PCR을 위한 템플릿으로서 비설피테 변형 DNA를 사용합니다.텍스트 원고에 설명된 대로 시약을 결합하고 96웰의 실시간 PCR 계측기를 사용하여 열 순환 프로토콜을 실행합니다. 훈련 코호트에서 위암 환자 48명의 특성이 여기에 나와 있다. 환자의 평균 연령은 74 세였고 코호트는 38 명의 남성과 10 명의 여성을 포함했습니다.첫째, 이상값을 식별하기 위해 48개의 샘플이 모두 로드되었습니다. 두 개의 샘플은 다른 샘플에서 변위된 두 개의 표준 편차보다 큰 피크를 주었고 이러한 샘플은 제거되었습니다. 결과 열지도는 높고 낮은 메틸화를 기반으로 두 그룹으로 나뉘었다.이 히트 맵을 사용하면 차동 메틸화 분석에서 전사 시작 부위의 1, 500개의 기본 쌍 내에서 상위 50개의 프로브를 시각화할 수 있습니다. 임상 병리학 적 인자가 다변량 분석에서 코바레로 사용될 때 암의 유형과 림프절 전이의 존재는 중요한 독립적 인 예측 요인으로 나타났다. 마지막으로, EPB41L3 유전자는 마이크로어레이 분석에서 훈련 코호트를 높고 낮은 메틸화 그룹으로 명문화하는 것과 강하게 연관된 것으로 나타났다.시험 코호트에서 EPB41L3에 대한 마이크로어레이 분석의 결과는 정량적 메틸화 특이PCR으로 검증되었다. PGC 조직에서 EPB41L3의 RMV는 단변면 분석에서 잔류 위암에 있는 그 보다는 상당히 높았습니다. 마찬가지로, 림프절 전이를 가진 샘플에서 RMV는 림프절 전이가없는 샘플보다 상당히 높았다.따라서 적절한 H&E 스테인드 섹션에 따라 거시분해에 가장 적합한 암 조직에 대한 식별이 이 프로토콜을 성공적으로 수행하기 위해서는 요구된다.

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An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

고해상도 초음파 모니터 종양 발병 및 성장 췌장암 유전자 조작된 모델에서을 활용 하 여

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...