Name: genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer
Uploaded: 2020-09-18T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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Estamos especialmente agradecidos a todos los miembros del Departamento de Cirugía, el Centro Integral de Cáncer Sidney Kimmel de la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins por sus discusiones útiles y apoyo técnico. También agradecemos a Kristen Rodgers por su generosa orientación técnica sobre los procedimientos para el tratamiento de bisulfito y qMSP.

Todos los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas del comité de ética de la investigación humana de las instituciones. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Shizuoka de la Universidad de Juntendo, y se renunció al consentimiento informado por escrito debido al diseño retrospectivo.
1. Lavar las diapositivas
<ol><li>Preparar 10 m de secciones de parafina fijada en formalina sin mancha (FFPE).</li>
	<li>Coloque las diapositivas en un portaobjetos de vidrio: utilice aproximadamente 3-5 diapositivas transversales más grandes a menos que el tejido sea mínimo y se necesiten más diapositivas.</li>
	<li>Llene el portaobjetos con xileno y asegúrese de que todo el tejido de la diapositiva esté sumergido. Dejar reposar durante 15 min.</li>
	<li>Después de 15 minutos, vierta el xileno con los portaobjetos sostenidos con una punta de pipeta para que los portaobjetos no se caigan.</li>
	<li>Vierta más xileno al mismo nivel que antes. Deje reposar otros 15 minutos.</li>
	<li>Después de 15 min, vierta el xileno de nuevo.</li>
	<li>Llene el portaobjetos con 100% etanol (EtOH) y asegúrese de que todo el tejido de la diapositiva esté completamente sumergido. Dejar reposar durante 3 min.</li>
	<li>Vierta el EtOH mientras sostiene cuidadosamente las diapositivas. Recarga al mismo nivel con más EtOH. Dejar reposar durante 2 min.</li>
	<li>Vierta el EtOH de nuevo y retire la diapositiva. Colóquelos cuidadosamente boca arriba sobre una toalla de papel limpia para secarlos. Dejar reposar durante 10 min.</li>
</ol>2. Raspando las diapositivas
<ol><li>Preparar el tampón de digestión/lelisis con 650 ml de agua tratada con dietilelpirocarbonato (DEPC), 100 ml de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 50 ml de clorhidrato de Tris (Tris-HCL) 2 M pH 8,8, y 200 ml de 10% de dodecil sulfato sódico (SDS) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Llene un tubo de polipropileno de un solo uso de 1,5 ml con 80 ml de tampón de digestión/lysis (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque una punta de pipeta limpia en el tampón.</li>
	<li>Identificar los tejidos cancerosos de la zona tumoral más adecuados para la macrodisección de acuerdo con la sección manchada de H&E adecuada. NOTA: El área tumoral para la macrodisección debe ser identificada por preferentemente dos patólogos calificados.</li>
	<li>Macrodissect tejido canceroso basado en la sección marcada H&E teñida.<ol>
<li>Tome una cuchilla de afeitar limpia y raspe suavemente el tejido canceroso de la diapositiva, tratando de mantenerlo en una sola pieza para que sea más fácil trabajar con él.</li>
		<li>Saque la punta de la pipeta del tubo de polipropileno de un solo uso que contenga tampón y utilelo para transferir el tejido desechado al vial tampón (ver Tabla de materiales). NOTA: La punta húmeda debe atraer el tejido, lo que facilita la transferencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el paso 2.5 con el resto de las diapositivas.</li>
	<li>Después de todo el tejido está en tubo de polipropileno de un solo uso, utilice la punta para asegurarse de que el tejido está completamente sumergido y no está pegado a la pared del tubo.</li>
	<li>Añadir 20 l de una proteasa de serina subtilisin al vial y deslizar suavemente para mezclar (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Colocar el vial en un bloque de calor de 55 oC durante al menos 4 horas o durante la noche. Asegúrese de dar un vórtice leve después de 2 h.</li>
</ol>3. Tratamiento con bisulfito
<ol><li>Utilice 45 l de la solución de tejido digerido como muestra.</li>
	<li>Realice el tratamiento con bisulfito utilizando reactivos en un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).<ol>
<li>Añadir 5 l de tampón de dilución a la muestra de ADN e incubar a 37oC durante 15 min (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Mientras las muestras están incubando, prepare el reactivo de conversión de bisulfito añadiendo 750 s de dH2O y 210 l de tampón de dilución a un tubo de reactivo de conversión por TC (ver Tabla de materiales). Mezclar los tubos por vórtice durante 10 min.</li>
		<li>Después de la incubación de 15 minutos, añada 100 l del reactivo de conversión de TC preparado a cada muestra y mezcle por inversión.</li>
		<li>Incubar las muestras en la oscuridad a 50oC durante 12 a 16 h.</li>
		<li>Después de la incubación, retire las muestras y colóquelas sobre hielo durante 10 min.</li>
		<li>Agregue 400 l de búfer de unión y mezcle cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo (consulte Tabla de materiales). Cargue cada muestra en una columna de giro y coloque la columna en un tubo de recogida de 2 ml (consulte Tabla de materiales).</li>
		<li>Centrifugar cada muestra a toda velocidad (10.000 x g)durante 1 min y deseche el flujo a través.</li>
		<li>Añadir 200 l de tampón de lavado a cada columna y girar a toda velocidad durante 1 min, descartando el flujo (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Añadir 200 l de tampón de desulfonación a cada columna y permitir que la columna se quede a temperatura ambiente durante 15 minutos (ver Tabla de materiales). Después de la incubación, gire las columnas a toda velocidad durante 1 min y deseche el flujo a través.</li>
		<li>Añadir 200 l de tampón de lavado a cada columna y girar a toda velocidad durante 1 min (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Repita este paso una vez más.</li>
		<li>Añadir 46 l de dH2O a cada columna y colocar cada columna en un nuevo tubo de polipropileno estéril de 1,5 ml de un solo uso (ver Tabla de materiales). Gire cada tubo durante 2 minutos para eluir el ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire cada columna de centrifugado del tubo de polipropileno de un solo uso y deseche (consulte Tabla de materiales). El ADN ya está listo para el análisis.</li>
</ol>4. Plataforma de matriz para la evaluación de la metilación del ADN en un locus de CpG en el genoma humano
<ol><li>Evaluar la calidad del ADN (comprobación de calidad: QC) utilizando el ensayo FFPE QC en un instrumento de amplificación y detección de PCR en tiempo real, con el análisis de datos posterior realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). NOTA: Las muestras con valores ∆Cq inferiores a los 5.0 recomendados se procesan además14.</li>
	<li>Analizar muestras con una plataforma de matriz para una evaluación compleja de la metilación del ADN para evaluar el estado de metilación de >450.000 sitios de CpG en el genoma (ver Tabla de Materiales). La hoja de información del producto, la hoja de datos y los archivos de producto para la plataforma de arreglos de discos están disponibles15. NOTA: El ensayo se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el material FFPE14.</li>
	<li>Calcular la metilación de locus alta y baja en una herramienta de análisis de datos para una plataforma de matriz como un valor de β, con un rango de 0 a 1, respectivamente (consulte Tabla de materiales). Utilice software disponible comercialmente (consulte Tabla de materiales) para calcular un valor β.</li>
	<li>Importe los datos generados en la plataforma de arreglos de discos para una evaluación compleja de la plataforma de metilación de ADN en el entorno de software R (R v.2.15.1) y procárelos utilizando una herramienta para analizar matrices de metilación16,17. NOTA: En el mapa de calor, que se genera mediante una herramienta de análisis de datos, las columnas se ordenan mediante agrupaciones no supervisadas, mientras que el orden de las filas se basa en la importancia decreciente de la estadística t para la metilación diferencial de arriba a abajo.</li>
	<li>Divida el mapa de calor en grupos de metilación altos y bajos utilizando el primer diferenciador en el clustering no supervisado. NOTA: Para la validación con PCR específico de metilación cuantitativa (qMSP), elija genes basados en un valor β mayor en relación con las islas CpG en la región promotora, y debido a su idoneidad para el diseño de imprimación y sonda para qMSP.</li>
</ol>5. PCR quantitative Methylation-Specific (qMSP)
<ol><li>Utilice el ADN modificado por bisulfito del paso 3.3 como plantilla para PCR en tiempo real basado en fluorescencia en qMSP para evaluar la metilación de la región promotora en cada análisis genético.</li>
	<li>Realice qMSP utilizando un instrumento PCR en tiempo real de 96 pozos (consulte Tabla de materiales).<ol>
<li>Compruebe el estado de metilación del gen objetivo en el ADN modificado por bisulfito utilizando una imprimación directa de 200 nM, una imprimación inversa de 200 nM y sondas de 80 nM. Preparar la mezcla maestra con 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-mercaptoetanol, fluoresceína de 10 nM, 0,166 mM de cada trifosfato de denuxicleótido y 0,04 U/l de ADNsa (ver Materiales de tabla). El volumen de reacción final en cada pozo para todos los ensayos es de 25 l.</li>
		<li>Realizar el ciclo de qMSP de la siguiente manera: 95 oC durante 5 minutos, seguido de 55 ciclos de 95 oC para 15 s, 60 oC durante 1 min, y 72 oC durante 1 min. NOTA: El gen objetivo debe elegirse en función de los criterios de tener valores beta más grandes, estar relacionado con las islas CpG en la región promotora y ser adecuado para el diseño de imprimación y sonda para qMSP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar genómica humana tratada con CpG Methylase (M.SssI) como control positivo de metilación (ver Tabla de Materiales). NOTA: La cuantificación final de la metilación se define como el valor relativo de metilación (RMV), y se calcula como 2–-T para cada réplica de detección de metilación en comparación con la ct media para β-Actin (ACTB)18. Las secuencias de imprimación y sonda se muestran en la Tabla 1. Un Ct de 100 se utiliza para las réplicas no detectadas, lo que da un valor de 2– -Ct cerca de cero. Se utiliza la siguiente fórmula: media 2–-T (RMV) á(2 –-Ct_replicate_1 + 2–-Ct_replicate_2 + 2–-Ct_replicate_3)/318.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+unfinished+symphony.">Epigenetics: unfinished symphony.</a> Nature. 441 (7090), 143-145 (2006).</li><li>Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+colorectal+cancer:+emerging+biomarkers.">Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers.</a> Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).</li><li>Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+the+p16INK4a+promoter+in+colectomy+specimens+of+patients+with+long-standing+and+extensive+ulcerative+colitis.">Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis.</a> Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).</li><li>Ushijima, T., Okochi-Takada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+methylations+in+cancer+cells:+where+do+they+come+from.">Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from.</a> Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).</li><li>Copped&#232;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+biomarkers+of+colorectal+cancer:+Focus+on+DNA+methylation.">Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation.</a> Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).</li><li>Vasilatou, D., Papageorgiou, S. 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A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association.</a> Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).</li><li>Eijsink, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-capture+sequencing+vs.+Infinium+450K+methylation+array+for+methylome+analysis+in+clinical+samples.">Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples.</a> Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).</li><li>Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization,+annotation+and+innovative+use+of+Infinium+DNA+methylation+BeadChip+probes.">Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay tres pasos críticos para obtener resultados precisos del análisis de metoma de metilación en todo el genoma. La primera es la macrodisección de un área tumoral por preferentemente dos patólogos calificados basados en secciones representativas de H&E manchadas. La macrodisección inexacta puede causar contaminación con tejidos no cancerosos adyacentes, lo que genera resultados poco fiables; por lo tanto, se requiere una macrodisección cuidadosa. La segunda es la evaluación de la calidad del ADN (comprobación de calidad: QC). Las muestras que fallan el QC (∆Cq > 5.0) pueden dar datos de mala calidad. Por lo tanto, las muestras con ∆Cq > 5.0 deben eliminarse y otras utilizadas. El tercer paso es el cálculo del valor β, que se determina mediante una herramienta de análisis de datos para el software de plataforma de matriz como la señal metilada / la señal total (metilada + sin metilo)17. El valor β oscila entre 0-1 (o 0%-100%), que es fácil de interpretar biológicamente17. El principal problema con este valor son sus malas propiedades estadísticas, ya que su alta heteroscedasticidad implica que la varianza entre las muestras en los extremos del rango de metilación (β 0 o β 1) es altamente reducida17. Además, debido a la mala calidad de la muestra, los valores de β pueden no mostrar picos bifásicos reproducibles22,y las muestras sin tales picos deben excluirse del estudio posterior. Además, el gen objetivo debe elegirse en función de los criterios de tener valores beta más grandes, estar relacionado con las islas CpG en la región promotora y ser adecuado para el diseño de imprimación y sonda para qMSP.
La evaluación de la metilación del ADN en un locus de CpG en el genoma humano se realiza utilizando tecnología basada en microarray con un número fijo de sondas para examinar loci genómicos específicos. Es el método más utilizado en estudios de asociación de epigenome en todo el epigenomo (EWAS) debido a su bajo costo, pequeña cantidad de ADN requerido, y notablemente más corto tiempo de procesamiento de muestras, lo que permite un procesamiento de alto rendimiento de muchas muestras clínicas23. Sin embargo, una plataforma de arreglos para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual está limitada por el número y la especificidad de las sondas para loci alterados epigenéticamente, lo que impide la exploración de algunas regiones genómicas. WGBS es generalmente visto como el método estándar de oro debido a su espectro más amplio de cobertura genómica10,11. Sin embargo, este método tiene un costo sustancial y un tiempo de procesamiento relativamente largo para el análisis de un gran número de muestras10,11. Por lo tanto, no siempre es factible. En comparación, la plataforma de arreglos para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual en el genoma humano es razonable para su uso en términos de costo y cobertura genómica. Recientemente, las últimas fichas de cuentas mejoradas se han listo para usar24. Estos ensayos pueden ayudarnos a analizar sitios de CpG medidos casi duplicados, lo que puede lograr un estudio de asociación ideal para todo el genoma (GWAS, por sus") para grandes poblaciones de muestras.
En resumen, el análisis del genoma de la metilación del ADN con la plataforma array para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus de CpG individual en el genoma humano puede proporcionar información importante sobre los biomarcadores epigenéticos en el cáncer gastrointestinal. En comparación con WGBS, este método es rentable y reduce el tiempo de procesamiento de muestras. Por lo tanto, este método para la detección de metilación de ADN en un locus CpG es probable que sea ampliamente utilizado en la investigación de biomarcadores epigenéticos.

La epigenética se refiere a cambios hereditarios en la función génica sin alteración de la secuencia del ADN1. Tales cambios pueden deberse a la metilación del ADN, en la que los grupos metilo en una base de ADN pueden alterar la expresión génica a través de cambios en el empaque de cromatina. El desarrollo y la progresión del cáncer pueden ocurrir si este efecto da lugar a una expresión alterada de los genes supresores de tumores2. El envejecimiento y la inflamación crónica son las causas del cáncer y las principales razones de los cambios en la metilación del ADN en los seres humanos3,4,5. En consecuencia, esto permite la utilización de la metilación del ADN como biomarcador en el diagnóstico del cáncer, y como objetivo para el tratamiento y la prevención. Para la detección temprana y el pronóstico del cáncer, la metilación del ADN se está midiendo en muestras de tumores, sangre, orina y heces6, mientras que los agentes desmetiladores se utilizan ahora para tratar leucemias como el síndrome mielodisplásico7.
El análisis de metilación del ADN en todo el genoma utilizando una plataforma de matriz para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual en el genoma humano se puede utilizar para examinar el estado de metilación de más de 450.000 sitios CpG en el ADN genómico8,9, que permite la exploración de la epigenética del cáncer (ver Tabla de Materiales). Las tecnologías de secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) han cambiado nuestros enfoques en el campo de la epigenética10,11. Sin embargo, hay algunas desventajas para las tecnologías en términos de un costo sustancial y tiempo de procesamiento para el análisis epigenético de un gran número de muestras10,11. Por lo tanto, la plataforma de matriz es más factible para la evaluación compleja de la metilación del ADN en el genoma humano. La disponibilidad de enfoques para los análisis de metilación en todo el genoma ha mejorado en los últimos años y nos permite ampliar nuestro conocimiento de cómo la metilación del ADN contribuye al desarrollo y progresión del cáncer12. Los avances recientes en los enfoques de la plataforma de microarray nos proporcionan la razón para el análisis de metilación en todo el genoma para identificar una nueva firma epigenética en cánceres gastrointestinales13. El objetivo de este protocolo es proporcionar una descripción detallada de cómo se utiliza este método para la identificación de biomarcadores en neoplasias malignas gastrointestinales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-032-721 EA</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24194</td>
			<td>Step 1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied BioSystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT conversion reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001-1</td>
			<td>Step 3.2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-018</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002</td>
			<td>Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1708780</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeStudio</td>
			<td>omicX</td>
			<td>OMICS_00854</td>
			<td>Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a &#946;-value, with a range from 0 to 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human genomic DNA</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>N4002S</td>
			<td>Step 5.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HD FFPE QC Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-321-1001</td>
			<td>Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinium HumanMethylation450 assay</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>WG-314</td>
			<td>Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of &#62;450,000 CpG sites in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>Step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Binding Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-3</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Desulphonation Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-5</td>
			<td>Step 3.2.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Dilution Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-2</td>
			<td>Step 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minfi package</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Wash Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5002-4</td>
			<td>Step 3.2.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10966-034</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Step 2.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene (Eppendorf) tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>24533495</td>
			<td>Step 2.5.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-092-101</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Spin 1 Column</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1003</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Step 5.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of dna methylation in gastrointestinal cancer

La metilación del ADN es un cambio epigenético importante que es biológicamente significativo y un enfoque frecuente de la investigación del cáncer. La metilación del ADN en todo el genoma es una medida útil para proporcionar un análisis preciso del estado de metilación de las neoplasias malignas gastrointestinales (GI). Dados los múltiples usos traslacionales potenciales del análisis de metilación del ADN, los médicos practicantes y otros nuevos estudios de metilación del ADN deben ser capaces de entender paso a paso cómo se realizan estos análisis de todo el genoma. El objetivo de este protocolo es proporcionar una descripción detallada de cómo se utiliza este método para la identificación del biomarcador en neoplasias malignas gastrointestinales. Es importante destacar que describimos tres pasos críticos que se necesitan para obtener resultados precisos durante el análisis de todo el genoma. Clara y concisa, estos tres métodos a menudo carecen y no se notan para los nuevos estudios epigenéticos. Utilizamos 48 muestras de una neoplasia maligna gastrointestinal (cáncer gástrico) para resaltar prácticamente cómo se puede realizar un análisis de metilación del ADN en todo el genoma para las neoplasias malignas gastrointestinales.

Las características de 48 pacientes con cáncer gástrico en la cohorte de entrenamiento son las siguientes(Tabla 2):la mediana de edad de los pacientes fue de 74 años (52-89 años), y la cohorte incluyó 38 hombres (79,2%) y 10 mujeres (20,8%). Hubo 35 pacientes (72,9%) con cáncer gástrico primario y en 13 pacientes (27,1%) con cáncer gástrico remanente (cáncer gástrico primario: primera aparición de una neoplasia maligna no metastásica en el estómago; cáncer gástrico remanente: cáncer en el estómago remanente que se desarrolló más de 5 años después de la gastrectomía distal, independientemente de la razón de la resección original19). Hubo 23 pacientes (47,9%) con metástasis de ganglios linfáticos y 25 pacientes (52,1%) Sin. En primer lugar, se cargaron las 48 muestras (la cohorte de entrenamiento) para la identificación de valores atípicos (Figura 1A). Dos muestras dieron picos que eran mayores que dos desviaciones estándar desplazadas de las otras, y estas muestras fueron eliminadas (Figura 1B). Por lo tanto, 46 muestras fueron agrupadas por hipermetilación promotora del ADN. El mapa térmico resultante se dividió en dos grupos basados en la metilación alta y baja(Figura 2). Este mapa térmico permite visualizar las 50 sondas superiores dentro de 1.500 bp del sitio de inicio transcripcional (TSS) en el análisis diferencial de metilación. Los grupos de metilación alta y baja diferían en factores clinicopatológicos relacionados con un fenotipo maligno agresivo. Es decir, el tipo de cáncer (cáncer gástrico primario: PGC) (p. 0,01, la relación de probabilidades 9,09 (1,67–50,00)) y la presencia de metástasis de los ganglios linfáticos (positiva) (p a 0,03, relación de probabilidades a 6,82 (1,16–40,08)) surgieron como factores predictivos independientes significativos cuando los factores clínicos se utilizaron como covariables en el análisis multivariado(Tabla 3). Por último, identificamos que el gen EPB41L320,21 (secuencias de imprimación y sonda que se muestran en la Tabla 1)se asociara fuertemente con la codificación de la cohorte de entrenamiento en grupos de metilación altos y bajos en el análisis de microarray. Utilizando qMSP, se validaron los resultados del análisis de microarray para EPB41L3 en la cohorte de pruebas (126 muestras). Las características de los pacientes de la cohorte de pruebas se muestran en la Tabla 4. Los RMV de EPB41L3 en los tejidos PGC fueron significativamente más altos que los del cáncer gástrico remanente (RGC) en el análisis univariado (p a 0,01)(Figura 3A). Del mismo modo, los RMVs en muestras con metástasis de ganglios linfáticos fueron significativamente más altos que aquellos sin metástasis de ganglios linfáticos (p a 0,03) (Figura 3B). De esta manera, el análisis de estemo de metilación del ADN puede ayudarnos a identificar genes específicos para caracterizar cierto estado clínico en pacientes con neoplasias malignas gastrointestinales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig01.jpg"> Figura 1: Valores beta en 48 muestras (cohorte de entrenamiento). Se cargaron las 48 muestras (cohorte de entrenamiento) y se examinaron los valores atípicos (A). Dos muestras tenían picos que eran valores atípicos, y estos fueron eliminados (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig02.jpg"> Figura 2: El mapa de calor resultante. Las 46 muestras restantes fueron agrupadas por hipermetilación promotora del ADN. El mapa de calor se dividió en grupos de metilación altos y bajos. Este mapa térmico permite visualizar las 50 sondas superiores dentro de 1.500 bp del sitio de inicio transcripcional (TSS) en el análisis diferencial de metilación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61355/61355fig03.jpg"> Figura 3: Valores relativos de metilación (RMV) para EPB41L3 en cáncer gástrico primario (PGC) frente al cáncer gástrico remanente (RGC), y en casos con y sin metástasis de ganglios linfáticos. Los resultados del análisis de microarray para EPB41L3 en la cohorte de pruebas (126 muestras) se validaron utilizando qMSP. (A) En el análisis univariar, los RMV de EPB41L3 en tejidos PGC fueron significativamente más altos que los de RGC (p a 0,01). (B) Del mismo modo, los RMVs en muestras con metástasis de ganglios linfáticos fueron significativamente más altos que en aquellos sin metástasis de los ganglios linfáticos (p a 0,03). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61355/61355fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gene</td>
			<td>Adelante 5' - 3'</td>
			<td>Invertir 5' - 3'</td>
			<td>Sonda</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-ACTIN</td>
			<td>ETIQUETA GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT</td>
			<td>AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC</td>
			<td>56-FAM- TGT GGG GTG -ZEN- GTG ATG GAG GAG GTT TAG ?3IABkFQ?</td>
		</tr>
<tr>
<td>EPB41L3</td>
			<td>GGG ATA GTG GGG TTG ACG C</td>
			<td>ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA</td>
			<td>AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de imprimación y sonda.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Factores clínicopatológicos</td>
			<td>Variables</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Edad</td>
			<td></td>
			<td>74 (52 - 89) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Género</td>
			<td>Hombre / Femenino</td>
			<td>38 (79.2%) / 10 (20.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>35 (72.9%) / 13 (27.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metástasis de los ganglios linfáticos</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>23 (47.9%) / 25 (52.1%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Cáncer gástrico primario, RGC: Cáncer gástrico remanente</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Mediana (mínimo-máximo)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Las características en 48 pacientes con cáncer gástrico en la cohorte de entrenamiento.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Valor P</td>
			<td>Relación de probabilidades</td>
			<td>95% Intervalo de confianza</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo (PGC)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>9.09</td>
			<td>1.67 – 50.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metástasis de ganglios linfáticos (+)</td>
			<td>0.03</td>
			<td>6.82</td>
			<td>1.16 – 40.08</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PGC: Cáncer gástrico primario</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Factores predictivos para el grupo de metilación alta (Cluster B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Factores clínicopatológicos</td>
			<td>Variables</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Edad</td>
			<td></td>
			<td>71 (33 - 86) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>Género</td>
			<td>Hombre / Femenino</td>
			<td>96 (76.2%) / 30 (23.8%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo</td>
			<td>PGC / RGC</td>
			<td>87 (69.0%) / 39 (31.0%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metástasis de los ganglios linfáticos</td>
			<td>(+) / (-)</td>
			<td>50 (39.7%) / 76 (60.3%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PGC: Cáncer gástrico primario, RGC: Cáncer gástrico remanente</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Mediana (mínimo-máximo)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Las características en 126 pacientes con cáncer gástrico en la cohorte de pruebas.

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Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Aquí, describimos un procedimiento para el análisis del genoma de la metilación del ADN en cánceres gastrointestinales. El procedimiento es relevante para los estudios que investigan las relaciones entre los patrones de metilación de los genes y los factores que contribuyen a la carcinogénesis en los cánceres gastrointestinales.

Análisis del genoma en general de la metilación del ADN en el cáncer gastrointestinal

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Por lo tanto, el análisis del genoma de la metilación del ADN con la plataforma LA para la aberración compleja de la metilación del ADN en el genoma humano puede proporcionar información importante de biomarcadores epigenéticos en el cáncer gastrointestinal. Aunque esta plataforma de LA para la aberración compleja de la metilación del ADN en el genoma humano, es óptima en términos de costo y cobertura genómica. Así que demostrar el procedimiento será Hirotaka Momose, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para empezar, prepare 10 micrómetros de secciones incrustadas de parafina fijada en formalina no manchada. Coloque las diapositivas en un portaobjetos de vidrio y llénelo con solución salina, asegurándose de que todo el tejido de la diapositiva esté sumergido. Deje los portaobjetos en xileno durante 15 minutos, luego vierta el xileno mientras sostiene los portaobjetos con una punta de pipeta para que no se caigan.Vierta más xileno al mismo nivel que antes y repita la incubación. Vierta el xileno y llene el portaobjetos con 100% etanol, asegurándose de que todo el tejido de la diapositiva esté completamente sumergido. Deje los portaobjetos en el etanol durante tres minutos, luego reemplace el etanol con etanol fresco y déjelos incubar durante dos minutos más.Vierta el etanol y retire las diapositivas. Colóquelos cuidadosamente boca arriba sobre una toalla de papel limpia y dérelos secar durante 10 minutos. Llene un tubo de polipropileno de un solo uso de 1,5 mililitros con 80 microlitros de tampón de lysis y coloque una punta de pipeta limpia en el tampón.Identificar los tejidos cancerosos de la zona tumoral más adecuada para la macrodisección de acuerdo con la sección adecuada de H&E teñida, luego macrodiseccionar el tejido canceroso basado en la sección marcada. Tome una cuchilla de afeitar limpia y raspe suavemente el tejido canceroso de la diapositiva tratando de mantenerlo en una sola pieza. Utilice la punta de la pipeta para transferir el tejido raspado al vial de tampón de lysis.Repita este proceso con el resto de las diapositivas. Después de todo el tejido está en el tubo, utilice la punta para asegurarse de que el tejido estaba completamente sumergido y no está pegado a la pared. Añadir 20 microlitros de una proteasa de serina subtilisin al vial y deslizar suavemente para mezclar.Coloque el vial en un bloque de calor celsius de 55 grados durante al menos cuatro horas o durante la noche, asegurándose de dar un poco de vórtice después de dos horas. Realizar el tratamiento con bisulfito en 45 microlitros del tejido digerido utilizando un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir cinco microlitros de tampón de dilución a la muestra e incubarlo a 37 grados Centígrados durante 15 minutos.Mientras tanto, prepare el reactivo de conversión de bisulfito añadiendo 750 microlitros de agua destilada y 210 microlitros de tampón de dilución a un tubo de reactivo de conversión por TC. Mezclar los tubos por vórtice durante 10 minutos, luego añadir 100 microlitros del reactivo de conversión de TC preparado a cada muestra y mezclar por inversión. Incubar las muestras en la oscuridad a 50 grados centígrados durante 12 a 16 horas.Después de la incubación, coloque las muestras sobre hielo durante 10 minutos. Agregue 400 microlitros de búfer de unión y mezcle cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue cada muestra en una columna de centrifugado y coloque la columna en un tubo de recolección de dos mililitros.Centrifugar las muestras a toda velocidad durante un minuto y desechar el flujo a través. Agregue 200 microlitros de tampón de lavado a cada columna y gire a toda velocidad durante un minuto, luego deseche el flujo a través. Agregue 200 microlitros de tampón de desulfonación a cada columna y permita que las columnas se pongan de pie a temperatura ambiente durante 15 minutos.Después de la incubación, gire las columnas a toda velocidad durante un minuto y deseche el flujo a través. Lave la columna dos veces con 200 microlitros de centrifugación de tampón de lavado durante un minuto a toda velocidad después de cada lavado. Agregue 46 microlitros de agua destilada a cada columna y colóquelo en un nuevo tubo de polipropileno estéril de 1,5 mililitros de un solo uso.Gire los tubos durante dos minutos para eluir el ADN y desechar la columna. El ADN ya está listo para el análisis. Utilice el ADN modificado de bisulfito como plantilla para pcR cuantitativo específico para la metilación para evaluar la metilación de la región promotora en cada análisis genético.Combine los reactivos como se describe en el manuscrito de texto y utilice un instrumento PCR en tiempo real de 96 pozos para ejecutar el protocolo de ciclo térmico. Las características de 48 pacientes con cáncer gástrico en la cohorte de entrenamiento se muestran aquí. La mediana de edad de los pacientes era de 74 años y la cohorte incluía 38 hombres y 10 mujeres.En primer lugar, las 48 muestras fueron cargadas para la identificación de valores atípicos. Dos muestras dieron picos que eran mayores que dos desviaciones estándar desplazadas de las otras y estas muestras fueron eliminadas. El mapa de calor resultante se dividió en dos grupos basados en la metilación alta y baja.Este mapa de calor permite visualizar las 50 sondas superiores dentro de 1.500 pares base del sitio de inicio transcripcional en el análisis de metilación diferencial. El tipo de cáncer y la presencia de metástasis de los ganglios linfáticos surgieron como factores predictivos independientes significativos cuando los factores patológicos clínicos se utilizaron como covariables en el análisis multivariado. Por último, se encontró que el gen EPB41L3 estaba fuertemente asociado con la codificación de la cohorte de entrenamiento en grupos de metilación altos y bajos en el análisis de microarray.Los resultados del análisis de microarray para EPB41L3 en la cohorte de pruebas se validaron con PCR cuantitativo específico para la metilación. Los RMV de EPB41L3 en los tejidos PGC fueron significativamente más altos que los del cáncer gástrico remanente en el análisis univariado. Del mismo modo, los RMVs en muestras con metástasis de ganglios linfáticos fueron significativamente más altos que aquellos sin metástasis de ganglios linfáticos.Por lo tanto, se requiere la identificación en el tejido canceroso más adecuado para la macrodisección de acuerdo con la sección manchada de H&E adecuada para realizar con éxito este protocolo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Investigación

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