Name: visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 NS110727) til D.T.B.

1. Generering af transgene fluer
<ol><li>For at generere transgene fluer til dette eksperiment, indsamle OK371-Gal425 jomfru hunfluer og hanner af UAS-TDP-43M337V 26 (Figur 1A) ved at bedøve fluer med CO2 på en pad til at sortere.</li>
	<li>Sort bedøvet fluer i hætteglas med standard Drosophila medier til korset. Placer mærkede hætteglas ved 25 °C, så den næste generation kan dukke op. BEMÆRK: Ryd de voksne fra hætteglassene, før afkomset dukker op for at sikre den korrekte genotype.</li>
	<li>Når afkom dukke op, indsamle transgene fluer i hætteglas og sortere efter køn til at begynde aldring for eksperimentelle betingelser.</li>
	<li>Når fluerne er indsamlet, overføres fluer til frisk mad hver 2.</li>
</ol>2. Dissektion prep
<ol><li>For at forberede dissektionerne opnås saltlinet i stuetemperatur fosfat (1x PBS), en 10 cm dissektionsskål belagt med en silikoneelastomer, lige kant dissekere saks, et sæt stump dissektion saftængning, en P200 pipette og pipette tips, 2,0 ml mikrocentrifuge rør, standard kontor saks, 70% ethanol, en 6 cm petriskål, og 32% formaldehyd fortyndet til 4% med 1x PBS.</li>
	<li>Etiketrør for hver genotype eller tilstand og tilsættes 900 μL 1x PBS (rumtemperatur) og 150 μL μL af 32% formaldehyd til hvert rør. Bær handsker og sikkerhedsbriller, når du tilbereder 4% formaldehyd fiksativ.</li>
	<li>Bedøve 6\u201210 flyver pr. gruppe direkte fra hætteglasset med CO2 og nedsænkes flyver ind i en 6 cm petriskål med 70% ethanol. Tryk fluer ned i ethanolen med en pensel for at sikre, at prøverne er helt nedsænket. Dette vil fjerne laget af olie på den ydre neglebånd.</li>
</ol>3. Brystkasse isolation og fiksering
<ol><li>Før desker hver prøve, tilsættes ca. 7\u201210 ml 1x PBS til dissektionsskålen belagt med silikoneelastomer. Dette volumen skal sikre, at vævsprøverne er helt nedsænket.</li>
	<li>Overfør en flue til dissektion parabol fra 70% ethanol ved hjælp af stumpe snævring og gribe enten vingerne eller benene.</li>
	<li>Fokuser prøven i dissektionsskålen under et dissekerende mikroskop. Næste nedsænke prøven i 1x PBS, og forsigtigt fjerne vingerne ved hjælp af stumpe Dumont #5 fine stænt.</li>
	<li>Brug Vannas lige kant fjeder dissektion saks, fjerne benene ved at skabe et lille snit i ventrale side af neglebånd. I trin 3.8 vil dette snit gøre det muligt for formaldehyd at trænge ind i vævet.</li>
	<li>Tag saksen i den ene hånd og hold snævlene i den anden for at placere flue ventrale side op. Mens du holder prøven på plads med de stumpe fortriver, skal du fjerne hoved og mave med dissektionssaksen.</li>
	<li>Den isolerede brystkasse overføres ved hjælp af den modificerede pipettespids til det mærkede rør fra trin 3.2. BEMÆRK: Indstil pipetten til 40 μL for at undgå at tilsætte ekstra 1x PBS til fiksativet.</li>
	<li>Gentag trin 3.2\u20123.6 ovenfor for hver prøve.</li>
	<li>Fix prøver i 30 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjern rettelsen ved hjælp af en Pasteur pipette og kassér den i den korrekte affaldsbeholder under røghætten. Skyl prøverne tre gange med 1,5 ml 1x PBS hver ved hjælp af en Pasteur pipette. Gennemfør en fjerde skylning med kun 750 μL, og lad vævene blive i 1x PBS. BEMÆRK: På dette tidspunkt kan vævsprøver forblive ved 4 °C i op til 3 dage, før de næste trin går videre.</li>
</ol>4. Flash frysning og brystkasse bisection
<ol><li>Før bisections, fyldes en Dewar kolbe med flydende nitrogen iført ordentlig kryobeskyttende handsker og sikkerhedsbriller. Få en klingebryder, fjerblade, et par fine pincet, is, iskold 1x PBS og kryogene pincet.</li>
	<li>Forbered en isspand for at holde 1x PBS iskold.</li>
	<li>Brug klingebruddet til at gribe fjerbladet i en vinkel, og bøj klingen for at brække et lille stykke af. Klingebruddet kan derefter låse klingen på plads til brug som en lille skalpel. BEMÆRK: En klinge skal holde for alle grupper. Kontakt, hvis klingen går i stykker eller bliver sløv.</li>
	<li>Tilføj en ren pipettespids til P200 og fjern 1/5th af spidsen til transport prøver.</li>
	<li>Forbered et nyt mikrocentrifugerør til hver gruppe, og der tilsættes 200 μL 1x PBS til hvert rør. Dette andet rør vil blive brugt til at indsamle de endelige DLM preps.</li>
	<li>Fjern alle 1x PBS fra rør ved hjælp af en Pasteur pipette.</li>
	<li>Iført korrekt beskyttelsesudstyr nedsænkes røret i den flydende nitrogenkolbe i 10 s med kryogene pincet. BEMÆRK: Rørene skal lukkes tæt for at holde røret i at eksplodere.</li>
	<li>Fjern røret fra det flydende nitrogen og tilsæt ca. 300 μL iskold 1x PBS til prøverne med en Pasteur pipette. Hold prøverne på is.</li>
	<li>Der tilsættes iskold 1x PBS til den 10 cm dissektionsskål, der er belagt med silikoneelastomer, og den første brystkasse afspørges med den modificerede 200 μL pipette.</li>
	<li>Placer brystkassens ventrale side op. I den ene hånd bruge en kedelig par kraftvænsninger til at placere brystkassen og i den anden bruge en fin par kraftæceser til at fjerne nogle af de thorax ganglion at udsætte midterlinjen af brystkassen.</li>
	<li>Brug brystkassens midterlinje som vejledning til at lave et lavt snit gennem 1/3rd af brystkassen med klingen.</li>
	<li>Fjern klingen fra brystkassen, og anse brystkassen i en vinkel på 45° med de stumpe kraftbesplinger. Sæt klingen i igen og skær lige ned ad brystkassens midterlinje. Dette vil resultere i to hemithoraces.</li>
	<li>Tag en hemithorax ad gangen og fjerne det overskydende væv under DLM muskelfiber F (Figur 1B), den mest ventrale fiber. Brug klingen til forsigtigt at foretage et eller to snit for at fjerne det overskydende væv uden at beskadige DPL'erne.</li>
	<li>Når isoleret, overføre hemithorax til den korrekte rør med 1x PBS.</li>
	<li>Gentag trin 4.6\u20124.14 indtil 10 dissekerede hemithoraces pr gruppe er lavet.</li>
</ol>5. Strukturel farvning
<ol><li>Efter gennemskæring af brystkasseprøverne skal vævet i blokerende buffer (1x PBS med 0,1 % normalt gedeserum og 0,2 % Triton X-100 ved pH 7.4) permeabilisere vævet og forhindre ikke-specifik farvning. Brug en Pasteur pipette til at fjerne overskydende 1x PBS og tilsæt 1,5 ml blokerende buffer til hvert rør. Derblokkes væv i mindst 1 time ved 4 °C.</li>
	<li>Prøverne forberedes til strukturel farvning ved hjælp af et fluorescerende konjugeret antistof, peberrodsperoxidase 488 (anti-HRP-488) ved en fortynding på henholdsvis 1:200 og Phalloidin-647 ved en fortynding på henholdsvis 1:1000 i blokerende buffer til plettereamneuroner og muskelvæv. Lav nok plet til at have 150 μL pr. rør. Pletten opbevares ved 4 °C dækket i folie eller i en mørk kasse, indtil den er klar til farvning.</li>
	<li>Efter blokering skal du fjerne den overskydende blokeringsbuffer med en pasteurpipette af glas.</li>
	<li>Før dispensering den strukturelle plet, vortex pletten. Der tilsættes 150 μL af pletten til hvert rør. Prøverne sættes i en mørk kasse på rotatoren ved stuetemperatur i 2 timer.</li>
	<li>Fjern pletten og vask vævet fire gange i 1,5 ml rum temp 1x PBS med 0,3% Triton X-100 i 5 min på rotator i en mørk kasse. Prøverne er nu klar til at montere til et dias.</li>
</ol>6. Montering af væv
<ol><li>Efter vask prøver i PBST, forberede et mikroskop dias til at montere væv til farvning. Forbered yderligere forsyninger, herunder glasdækselssedler, en P200-pipette, 200 μL pipettespidser, saks, klare forstærkninger, lige kantforslag, anti-fade fluorescerende monteringsmedier, neglelak og en mørk boks til at dække objektglassene.</li>
	<li>Mærl diaset for at identificere prøverne, og rengør diaset med kimwipes for at sikre, at der ikke er nogen pletter.</li>
	<li>For at sikre hemithorax prøver ikke er beskadiget af dækslet slip, bygge en "bro" ved hjælp af forstærkning etiketter. Tag en forstærkning etiket, skær det i halve, og læg hver halvdel ca. 15 mm fra hinanden. Denne afstand skal være mindre end dækslets bredde. Gentag dette trin fire gange for at fuldføre en "bro", der er 5 etiketter høj.</li>
	<li>Tag P200-pipetten, og rediger en spids ved at afskære 1/5th af spidsen for at overføre prøverne til diaset. Prøver skal overføres til diaset i midten af broen.</li>
	<li>Tag kanten af en lab tørre og fjerne overskydende PBST. Brug af hændel, arrangere DLMs sådan, at alle prøver står muskel side op og neglebånd side ned.</li>
	<li>Brug en standard P200 pipettespids til at anvende 70 μL monteringsmedier på diaset, så luftboblerne undgås. Dispenser mediet i et cirkulært mønster inde i forstærkninger startende udefra ind i midten.</li>
	<li>Placer et dæksel slip over forstærkninger.</li>
	<li>Brug neglelak til pels de udvendige kanter omkring omkredsen af coverslip. Påfør generøst til at danne en komplet forsegling af vævet.</li>
	<li>Placer rutsjebanen på en flad overflade i mørke, så mindst 10 min tørre og forhindre foto-blegning eller tab af fluorescens. Slides kan nu bruges til billedbehandling med det samme eller på anden måde gemmes i en slidemappe ved -20 °C til senere visning.</li>
</ol>7. Alternativ: Farvning med primære antistoffer
BEMÆRK: Dette afsnit er valgfrit og bør anvendes direkte mellem afsnit 4 og 5, hvis det ønskes.
<ol><li>At plette væv med primære antistoffer, nedsænkes væv i blokering buffer i mindst 1 h.</li>
	<li>Forbered primær antistof med korrekt fortynding i blokerende buffer. Der skal mindst tilberedes tilstrækkelig antistofblanding til at have 150 μL pr. gruppe. Bemærk, at prøverne holdes stille. Opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til brug.</li>
	<li>Fjern overskydende blokeringsbuffer med en Pasteur-pipette. Vortex det primære antistof og tilsættes 150 μL antistofblanding til hver gruppe og afprøver ved 4 °C natten over.</li>
	<li>Den næste dag fjernes det primære antistof og vaskes væv 4 gange med PBST i 5 minutter hver på en rotator.</li>
	<li>Forbered sekundær plet i blokerende buffer. Tilsæt den sekundære plet til prøven og derefter holde det en rumtemperatur i 2 timer i en mørk boks på rotator. BEMÆRK: Den sekundære farvning kan også omfatte HRP og falloidin.</li>
	<li>Efter 2 timers inkubation, at fjerne den sekundære plet vaske væv 4 gange i 5 min med PBST og fortsætte til montering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+failure:+focus+in+an+integrative+view+of+ALS.">Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS.</a> Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).</li><li>Lodato, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+neurodegeneration+are+associated+with+increased+mutations+in+single+human+neurons.">Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons.</a> Science. 359, 555-559 (2018).</li><li>L&#243;pez-Erauskin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-linked+mutation+in+FUS+suppresses+intra-axonal+protein+synthesis+and+drives+disease+without+nuclear+loss-of-function+of+FUS.">ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS.</a> Neuron. 100, 816-830 (2018).</li><li>Munsie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-dependent+neurotransmitter+receptor+trafficking+to+synapses+is+altered+by+the+Parkinson's+disease+VPS35+mutation+p.+D620N.">Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N.</a> Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-transgenic+model+of+Alzheimer's+disease+with+plaques+and+tangles:+intracellular+A&#946;+and+synaptic+dysfunction.">Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular A&#946; and synaptic dysfunction.</a> Neuron. 39, 409-421 (2003).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+is+a+synaptic+failure.">Alzheimer's disease is a synaptic failure.</a> Science. 298, 789-791 (2002).</li><li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).</li><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+indirect+flight+muscle+innervation+in+Drosophila+melanogaster.">The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 118, 215-227 (1993).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-muscle+interactions+during+flight+muscle+development+in+Drosophila.">Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila.</a> Development. 125, 1769-1779 (1998).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pruning+of+motor+neuron+branches+establishes+the+DLM+innervation+pattern+in+Drosophila.">Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Fas+II+in+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+during+pruning+in+Drosophila.">A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila.</a> Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).</li><li>Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+synapse+model+in+Drosophila.">A tripartite synapse model in Drosophila.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Hunt, L. C., Demontis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunostaining+of+Drosophila+skeletal+muscle.">Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle.</a> Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles.">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6, 184-196 (2013).</li><li>Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elevation+of+sphingosine+1-phosphate+suppresses+dystrophic+muscle+phenotypes+in+Drosophila.">Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila.</a> Development. 140, 136-146 (2013).</li><li>Schnorrer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+of+muscle+morphogenesis+and+function+in+Drosophila.">Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila.</a> Nature. 464, 287-291 (2010).</li><li>Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudo-acetylation+of+K326+and+K328+of+actin+disrupts+Drosophila+melanogaster+indirect+flight+muscle+structure+and+performance.">Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance.</a> Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+remodeling+during+metamorphosis+influences+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+in+Drosophila.">Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila.</a> Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).</li><li>Ritson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mediates+degeneration+in+a+novel+Drosophila+model+of+disease+caused+by+mutations+in+VCP/p97.">TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Klagges, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+synapsins:+a+single+gene+codes+for+several+isoforms+in+Drosophila.">Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release.">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).</li><li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS.">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002 (2018).</li><li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li><li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation.">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li><li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight.">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne protokol, giver vi en enkel tilgang til dissektion af DLM-vævet og demonstrerer, hvordan dette kan anvendes til at vurdere synaptisk integritet gennem strukturel farvning og synaptiske markører hos voksne Drosophila. Et kritisk skridt i protokollen, der gør DLM væv lettere at dissekere er flash frysning med flydende nitrogen. Uden dette trin er vævet mindre fast og vanskeligere at skære præcist som observeret i figur 3. Denne protokol bygger på tidligere dissektionsmetoder for at gøre det muligt at bevare både motoriske neuroner og muskelvæv18,19,20,21,22,23. En begrænsning af denne protokol er, at når du foretager skære ned midterlinjen for bsektion, kan det være svært at få to rene preps per brystkasse. En måde at sikre mindst én hemithorax per flue, kan du med vilje afskære til den ene side af brystkassen for at få en ren prep. Med denne modifikation kan det også være nødvendigt at fjerne yderligere overskydende væv fra snittet for at rydde op i prøven med klingebruddet. For dem nye til denne teknik, med fortsat praksis, nøjagtigheden af bisection vil stige.
Den metode, der er beskrevet her giver forskerne mulighed for nemt at vurdere den strukturelle integritet af voksne DLM NMJs til enhver tid i hele deres levetid. En stor fordel ved denne protokol er evnen til at få adgang til synaptisk integritet i neurodegenerative sygdomsmodeller ved hjælp af synaptiske markører. Vi viser, at denne ansøgning kan hjælpe med at visualisere ændringer i grov morfologi med strukturel farvning(Figur 1C\u2012H). Derudover kan synaptisk integritet vurderes med farvning af præsynaptiske markører, herunder, men ikke begrænset til, Synapsin28 (Figur 2A\u2012F), Syntaxin29 (Figur 2G\u2012L) og BRP30 (Figur 2M\u2012R). Det postsynaptiske muskelvæv kan også vurderes ved hjælp af glutamatreceptor III-underenhedens antistof31 (Figur 2S\u2012X), der demonstrerer nytten af denne protokol.
Forskere kan også bruge denne dissektion metode til at supplere funktionelle data til omfattende undersøge den strukturelle integritet synapser forbundet med en bred vifte af sygdomme. Disse synapser giver også mulighed for funktionel analyse gennem elektrofysiologiskeoptagelser 32,33,34 og flyanalyse10. Denne protokol kan også give nem adgang til vævet for mange applikationer og analyser. Fremtidige undersøgelser, for eksempel, kunne bruge denne protokol til at kvantificere synaptiske ændringer gennem kvantificering af tætheden og antallet af synapser15,16. Mens den protokol, der er beskrevet her specifikt undersøger synaptisk integritet af motoriske neuroner, supplerende protokoller til vurdering af muskel celletab kan også udføres med denne dissektion ved hjælp af TUNEL farvning35. At undersøge neuronal tab, dissektion af thorax ganglion36 kunne også anvendes med TUNEL farvning. Vi forventer, at den her beskrevne dissektion vil have flere ansøgninger til fremtidige undersøgelser, der vurderer aldersrelaterede patologier samt neurodegenerative sygdomme.

Synaptisk dysfunktion er blandt de tidligste kendte kendetegn ved de fleste større neurodegenerative sygdomme1,2,,3,4,5,6. Men, meget lidt er kendt med hensyn til, hvordan disse strukturelle og funktionelle funktionsnedsættelser vedrører senere stadier af sygdomsprogression. Drosophila har vist sig at være et nyttigt modelsystem til forståelse af synapsvækst og -udvikling ved hjælp af larve NMJs7,8,9. Men, den tredje larve instar fase varer kun et par dage, begrænse deres nytte i at studere progressiv, aldersafhængig neurodegeneration. Et alternativ til vurdering af larve NMJs er at undersøge synaptiske strukturer hos voksne Drosophila, såsom synapser dannet på dorsale langsgående muskler (DLD), der er nødvendige for flyvning10,11,12,13,14,15,16. Disse trepartssynapser er strukturelt organiseret på samme måde som pattedyr synapser17, hvilket giver en unik fordel for vurderingen af modeller af neurodegenerative sygdomme.
Her beskriver vi en enkel metode til at analysere den strukturelle integritet af voksne NMJs i en Drosophila model af neurodegeneration. Tidligere DLM dissektion metoder og undersøgelser har understreget betydningen af at bevare muskelvæv for en række forskellige anvendelser18,19,20,21,22,23. Vores protokol giver en omfattende metode til at bevare både neuronal og muskelvæv til at undersøge neurodegenerative sygdomme. En anden vigtig komponent i at studere disse sygdomme er evnen til at forstå neuronal tab i en aldersafhængig måde. Tidligere arbejde giver en kritisk og dybtgående forståelseaf,hvordan DLM NMJs dannes under metamorfose i den tidligevoksenalder 11,12,14,15,16,24. Vores protokol etablerer en metode til at bygge videre på dette arbejde for at undersøge DLM NMJs på en aldersafhængig måde i aldrende og neurodegenerative sygdomme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="724">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">32% Formaldehyde</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">15714</td>
			<td style="width:227px;">Tissue preservation</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti mouse</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11031</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti rabbit</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11036</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">anti- Bruchpilot (BRP) antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>NC82</td>
			<td style="width:227px;">Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:216px;">anti-GluRIII antibody</td>
			<td style="width:121px;">Gift from Aaron DiAntonio</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:227px;">Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">anti-Synapsin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">3C11</td>
			<td style="width:227px;">Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">anti-Syntaxin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">8C3</td>
			<td style="width:227px;">labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">BenchRocker</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">31-302</td>
			<td style="width:227px;">Rotating samples during staining</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:94px;width:216px;">Blade Breaker</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">10053-09</td>
			<td style="width:227px;">Used for holding feather blade</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">cover slips</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12548A</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic gloves</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>97008-198</td>
			<td style="width:227px;">protect hands from liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic tweezers</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>82027-432</td>
			<td style="width:227px;">Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">dewar flask-1900 mL</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td>5028M54</td>
			<td style="width:227px;">Hold liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Feather Blades</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72002-01</td>
			<td style="width:227px;">Scalpel Blades</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">Fine Forecps x 2</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11252-20</td>
			<td style="width:227px;">One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:216px;">FITC-conjugated anti HRP</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:161px;">123-545-021</td>
			<td style="width:227px;">Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">freezer box (Black)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14100F</td>
			<td style="width:227px;">Protects samples from light</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14637-010</td>
			<td style="width:227px;">Used to transfer samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">glass slides</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12550143</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">mounting media (vectashield) anti-fade</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">101098-042</td>
			<td style="width:227px;">Mounting media retains fluorescent signaling</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72180</td>
			<td style="width:227px;">Seals microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">PCN5000</td>
			<td style="width:227px;">Prevents non-specific binding of antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">paint brush</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-204</td>
			<td style="width:227px;">Transferring flies</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-010-023</td>
			<td style="width:227px;">Saline solution for dissecting and staining</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phalloidin 647</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td>AB176759</td>
			<td style="width:227px;">Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">plastic petri dish (100 mm)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">25373-100</td>
			<td style="width:227px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:216px;">reinforcement labels</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>AVE05722</td>
			<td style="width:227px;">Provides support for glass coverslip over the mounted tissue</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">sharpening block</td>
			<td style="width:121px;">Grainger</td>
			<td style="width:161px;">1RDF5</td>
			<td style="width:227px;">Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">slide folder</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">10126-326</td>
			<td style="width:227px;">Sample storage</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">standard office scissors</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>ACM40618</td>
			<td style="width:227px;">Cutting reinforcement labels</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">24236-10</td>
			<td style="width:227px;">Coating for dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">22140</td>
			<td style="width:227px;">Helps to permeabilize tissue</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Vannas Disssection Sissors</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">1500-00</td>
			<td style="width:227px;">Ued for removing fly legs and making an incision on thorax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration

Drosophila fungerer som en nyttig model til vurdering af synaptisk struktur og funktion forbundet med neurodegenerative sygdomme. Mens meget arbejde har fokuseret på neuromuskulære vejkryds (NMJs) i Drosophila larver, vurdering synaptisk integritet hos voksne Drosophila har fået langt mindre opmærksomhed. Her giver vi en enkel metode til dissektion af de dorsale langsgående muskler (DLD'er), som er nødvendige for flyvning evne. Ud over flyvning som en adfærdsmæssig udlæsning, denne dissektion giver mulighed for både DLM synapser og muskelvæv at være modtagelige for strukturel analyse ved hjælp af fluorescerende mærket antistoffer til synaptiske markører eller proteiner af interesse. Denne protokol giver mulighed for evaluering af den strukturelle integritet synapser hos voksne Drosophila under aldring til model den progressive, aldersafhængige karakter af de fleste neurodegenerative sygdomme.

Generationen af transgene fluer, der udtrykker humant tjærebindende protein af 43 kDa mutant (TDP-43M337V), repræsenteres af skematisk (Figur 1A). Dette viser anvendelsen af det binære Gal4/UAS-system i Drosophila27. Illustrationen viser en hemithorax med seks muskelfibre, A\u2012F går fra de mest dorsale fiber A til den mest ventrale F (Figur 1B)11,12. For at vurdere synaptisk integritet blev NMJs plettet med HRP og Phalloidin (Figur 1C\u2012E). Motoriske neuroner i TDP-43M337V mutanter (Figur 1F) har lidt at ingen HRP farvning af dag 21, mens WT (Oregon-R) forbliver intakt (Figur 1C). Der er ingen synlige forskelle i muskelfarvning (Figur 1D, G). De ændringer i grov morfologi observeret i TDP-43M337V mutanter viser, hvordan synaptisk integritet kan impliceres i en neurodegenerativ sygdomsmodel af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) ved hjælp af den voksne DLM model. Ud over strukturel farvning, farvning af DLM NMJs kan også give en vurdering af synaptisk integritet med præsynaptiske (Figur 2A\u2012R) og post synaptic (Figur 2S \u2012X) markører. Tilsammen illustrerer disse resultater, hvordan denne dissektionsprotokol kan anvendes til at studere DLM-væv i neurodegenerative sygdomme.
Et centralt aspekt af denne dissektion er anvendelsen af flydende nitrogen til at blinke fryse vævet for at gøre bisection lettere. Nytten af det flydende kvælstof er påvist i WT flyver med flydende nitrogen, hvor muskelvæv har ingen skader eller hakkede fibre (Figur 3A\u2012C). Uden flydende nitrogen kan vævet være vanskeligere at dissekere. For eksempel, efter denne protokol og springe flydende nitrogen flash frysning skridt gør det muligt for vævet at være mere modtagelige for skader fra dissektion værktøjer såsom beskadigede neuroner(Figur 3D)eller beskadigede muskelfibre (Figur 3E). Påføring af flydende nitrogen hjælper med at forhindre vævsskader, der kan opstå, når der arbejdes med DLM-væv, uanset prøvens genotype (figur 3C og 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figur 1: Progressiv denervation af DLM synapser i en Drosophila model af ALS. a) Generationen af ALS-transgene fluer, der udtrykker en human mutant form for tjærebindende protein på 43 kDa (TDP-43), er vist i skemaet. (B) Illustrationen viser formen og orienteringen af en hemithorax i en voksen Drosophila. Ved hjælp af protokollen, kan vi observere den progressive tab af synaptisk integritet af DLM NMJ synapser gennem strukturel farvning af motoriske neuroner med HRP (grøn) og muskelvæv med Phalloidin (magenta). Vores model skildrer tabet af synaptisk integritet i en voksen model af ALS gennem generation af voksne fluer udtrykke en mutant fra human tdp-43M337V i motoriske neuroner (Figur 1F \u2012H) i forhold til WT (Figur 1C\u2012E) flyver i muskelfiber C. Pile fremhæver eksempler på en WT-synapse (Figur 1C) og et eksempel på tab af synaptisk integritet. Skalabar =20 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Figur 2: Vurdering af synaptisk integritet ved hjælp af præsynaptiske markører ved voksne NMJs. Synaptisk integritet kan også vurderes ved hjælp af præsynaptiske og postsynaptiske markører i WT fluer, der er 14 dage gamle i muskelfiber C. De præsynaptiske markører Synapsin (B), Syntaxin (H) og Bruchpilot (BRP) (N) farves sammen med HRP (A, G, M). Farvning skildrer lokaliseringen af disse markører til de præsynaptiske terminaler (C, I, O). Ved højere forstørrelse illustrerer billederne lokaliseringen af Synapsin (E), Syntaxin (K) og BRP (Q) med HRP (D, Jog P) mere detaljeret (Figur F, Log R). Vi viser også en postsynaptisk markør Glutamat Receptor III (GluRIII)(T)co-farves med HRP (S). Den co-farvning viser nytten af disse markører (U). Ved højere forstørrelse eksemplificerer de repræsentative billeder lokaliseringen (X) af GluRIII (W) og HRP (V) til henholdsvis det postsynaptiske muskelvæv og de præsynaptiske terminaler. Skalalinje til paneler A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U repræsenterer 20 μm ved 63x forstørrelse. Skalabjælke til paneler D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R og 2V-2X repræsenterer 10 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Figur 3: Nytte af flydende nitrogen til DLM-dissektioner. For at demonstrere nytten af flydende nitrogen til DLM dissektioner, viser vi en sammenligning af dag 21 WT flyver med og uden flydende kvælstof fra muskelfiber C. Med flydende nitrogen forbliver Phalloidin (B) intakt og kompromitterer ikke HRP-farvning (A, C). Uden flydende nitrogen, muskelvæv bliver trævle og vanskeligt at bisect (E) og HRP farvning (D, F) bliver kompromitteret på grund af tekniske fejl. Hvide pile viser et område uden muskelskader i med flydende nitrogen ( B )ogbeskadiget muskelvæv (E). Skalabar = 20 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Målet med denne procedure er at dissekere dorsal langsgående muskel (DLM) væv til at vurdere den strukturelle integritet DLM neuromuskulære kryds (NMJs) i neurodegenerative sygdom modeller ved hjælp af Drosophila melanogaster.

Visualisering af synaptisk degeneration hos Adult Drosophila i samarbejde med neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

En protokol giver en enkel model til vurdering af synaptisk integritet på en aldersafhængig måde. Så vi kan studere neurodegenerative sygdomme i væv, der er modtagelige for både strukturelle og funktionelle analyse. Denne teknik letter bevarelsen af både neuronal og muskelvæv fra dorsale langsgående muskel neuromuskulære kryds.Til omfattende undersøge synaptisk funktion over tid og væv, der er vanskelige at arbejde med. Denne metode kan anvendes på studiet af neurodegenerative sygdomme, herunder ALS, Parkinsons, Huntingtons og Alzheimers sygdom. Før dissektionen blev skåret ca. 10 millimeter fra spidsen af en 200 mikroliterpipette.Efter administration af anæstesi, spille seks til 10 fluer i en seks centimeter petriskål, der indeholder 70% ethanol og bruge en pensel til forsigtigt at nippe fusionere hver flue. Efter et til to minutter anvendes vicess til at overføre en flue ved ben eller vinger til en silikoneelastomerbelagt dissektionsskål indeholdende syv til 10 milliliter PBS under et dissekerende mikroskop. Når fluen er nedsænket i PBS, skal du bruge stumpe Dumont nummer fem finde kraftang til forsigtigt at fjerne vingerne og bruge span en lige kant fjeder dissektion saks til at foretage et lille snit i ventrale side af neglebånd til at fjerne benene.Hold dissektionssaksen i den ene hånd og stumpe kraftang i den anden, placer flueudsugningssiden op og holder prøven på plads med fortrænten, fjern hoved og mave med saksen. Brug en 200 mikroliterpipette indstillet til 40 mikroliter og den modificerede pipettespids til at indsamle thoraces og anbringe de isolerede vævsprøver i et passende mærket rør, der indeholder 900 mikroliter PBS og 150 mikroliter af 32% formaldehyd. Efter 30 minutter ved stuetemperatur skal du bruge en Pasteur-pipette til at fjerne fiksativet og skylle lagerne tre gange med 1,5 milliliter PBS pr. vask.Før du begynder bisections Don kryo beskyttelseshandsker og sikkerhedsbriller og fyld en turkolbe med flydende nitrogen. Brug en klingebryder til at få fat i en fjerklinge i en vinkel og bøj klingen for at brække et lille stykke af. Brug klingeskrækkeren til at låse klingen på plads og bruge en Pasteur-glasspipette til at fjerne alle PBS fra prøverørene.Brug kryogene pincet til at nedsænke rørene i kolben af flydende nitrogen. Efter 10 sekunder, bruge en Pasteur pipette til at tilføje ca 300 mikroliter af iskold PBS til hvert rør på is, og placere en dårlig Axe ventrale side op i en 10 centimeter silikone elastomer belagt dissektion fad indeholder iskold PBS. Brug et kedeligt par kraftbefæstet til at placere brystkassen og finde et par kraftaffekt, for at fjerne nogle af de thorax ganglier at udsætte midterlinjen af brystkassen.Brug brystkassens midterlinje som vejledning ved at bruge spillet til at lave et lavt snit gennem en tredjedel af brystkassen og brug de stumpe kraftbelininger til at placere brystkassen i en vinkel på 45 grader. Brug bladet til at skære lige ned midterlinjen af brystkassen for at opnå to hemithoraces og til omhyggeligt at foretage en eller to nedskæringer for at fjerne det overskydende væv uden at beskadige ryglænedler i længderetningen. Derefter anbringes muskelvævsprøverne i et passende mærket rør af PBS.Når alle brystkasseprøverne er blevet gennemskåret permeabiliserer vævene ved blokerende buffer i mindst en time ved fire grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen, vortex frisk forberedt strukturel plet opløsning og tilsæt 150 mikroliter af pletten til hver prøve for en to timers inkubation på en rotator ved stuetemperatur i mørke. Efter farvning vaske prøverne i PBST, og sted fem forstærkning etiketter stablet og skåret i halve 15 millimeter fra hinanden på et glas mikroskop dias.Brug en modificeret mikropipettespids til at overføre thoraces på hvert dias og bruge en laboratorieserviet til at fjerne overskydende PBST. Brug hændemus til at arrangere prøverne, så thoraces vender muskelsiden opad. Når prøverne er korrekt orienteret bruge en 200 mikroliter pipette spids til at anvende 70 mikroliter montering medium til hvert dias og dække hvert dias med et dæksel slip.Brug derefter neglelak til generøst pels de udvendige kanter af dækslet glider for at opnå en komplet forsegling omkring hvert væv. For at vurdere den synaptiske integritet. Neuromuskulære kryds kan farves med peberrod peroxidase og Floe tin Motor neuroner i tjærebindende protein af 43 Kilodalton mutans har lidt at ingen peberrod peroxidase farvning af dag 21, mens den vilde type protein forbliver intakt.Ingen synlige forskelle i muskel farvning er observeret. Ud over strukturelle farvning dorsal langsgående muskel neuromuskulære kryds mærkning kan også give en vurdering af synaptisk integritet med præ synaptiske og post synaptiske markører. Bemærk, at flydende nitrogen flash frysning letter en vellykket brydning som ikke flash frosset væv er mere modtagelige for skader under dissektion.Efter denne procedure kan konserveringsprøverne analyseres ved konfokal mikroskopi for at måle et bestemt aspekter af synaptisk struktur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering af proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histologi at kvantificere neurodegeneration i<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...