Name: visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01 NS110727) til D.T.B.

1. Generasjon av transgene fluer
<ol><li>For å generere transgene fluer for dette eksperimentet, samle OK371-Gal425 jomfru kvinnelige fluer og menn av UAS-TDP-43M337V 26 (Figur 1A) ved bedøvende fluer med CO2 på en pute for å sortere.</li>
	<li>Sorter bedøvede fluer i hetteglass med standard Drosophila media for korset. Plasser merkede hetteglass ved 25 °C for neste generasjon å dukke opp. MERK: Fjern de voksne fra hetteglassene før avkomet kommer for å sikre riktig genotype.</li>
	<li>Når avkom dukker opp, samle transgene fluer i hetteglass og sortere etter kjønn for å begynne aldring for eksperimentelle forhold.</li>
	<li>Når fluer er samlet, overfør fluer til fersk mat hver 2 dager til fluene er 21 dager gamle.</li>
</ol>2. Disseksjon prep
<ol><li>For å forberede disseksjoner, oppnå romtemperaturfosfat bufret saltvann (1x PBS), en 10 cm disseksjonsfat belagt med en silikonelekter, rett kant dissekering saks, ett sett med stump disseksjon tang, en P200 pipette og pipette tips, 2,0 ml mikrocentrifuge rør, standard kontor saks, 70% etanol, en 6 cm Petri parabolen, og 32% formaldehyd fortynnet til 4% med 1x PBS.</li>
	<li>Etikettrør for hver genotype eller tilstand og tilsett 900 μL μL 1x PBS (romtemperatur) og 150 μL med 32 % formaldehyd i hvert rør. Bruk hansker og vernebriller når du forbereder 4% formaldehyd fikseringsmiddel.</li>
	<li>Bedøve 6\u201210 fluer per gruppe direkte fra hetteglasset med CO2 og senk fluer inn i en 6 cm petriskål med 70% etanol. Trykk fluer ned i etanol ved hjelp av en pensel for å sikre at prøvene er helt nedsenket. Dette vil fjerne oljelaget på den ytre skjellaget.</li>
</ol>3. Thorax isolasjon og fiksering
<ol><li>Før dissekering av hver prøve, tilsett ca. 7\u201210 ml 1x PBS til disseksjonsfatet belagt med silikonelikator. Dette volumet skal sikre at vevsprøvene er helt nedsenket.</li>
	<li>Overfør en flue til disseksjonsfatet fra 70% etanol ved hjelp av stump tang og gripe enten vingene eller bena.</li>
	<li>Fokuser prøven i disseksjonsfatet under et dissekeringsmikroskop. Deretter senker prøven i 1x PBS, og fjern forsiktig vingene ved hjelp av sløv Dumont #5 fine tang.</li>
	<li>Bruk Vannas rett kant vårdeksjon saks, fjerne bena ved å skape et lite snitt i ventral side av skjellaget. I trinn 3.8 vil dette snittet tillate formaldehyd å trenge inn i vevet.</li>
	<li>Ta saksen i den ene hånden og hold tangen i den andre for å plassere flyventralsiden opp. Mens du holder prøven på plass med de stumpe tangene, fjern hodet og magen med disseksjonssaksen.</li>
	<li>Overfør den isolerte thoraxen ved hjelp av den modifiserte pipettespissen til det merkede røret, fra trinn 3.2. MERK: Sett pipetten på 40 μL for å unngå å tilsette ekstra 1x PBS til fikseringen.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.2\u20123.6 ovenfor for hver prøve.</li>
	<li>Fiks prøver i 30 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern fiksen ved hjelp av en Pasteur pipette og kast den i riktig avfallsbeholder under røykhetten. Skyll prøvene tre ganger med 1,5 ml 1x PBS hver ved hjelp av en Pasteur pipette. Fullfør en fjerde skyll med bare 750 μL og la vev i 1x PBS. MERK: På dette tidspunktet kan vevsprøver forbli ved 4 °C i opptil 3 dager før de går videre til de neste trinnene.</li>
</ol>4. Flash frysing og thorax biseksjon
<ol><li>Før du begynner biseksjonene, fyll en Dewar-kolbe med flytende nitrogen iført riktige kryobeskyttende hansker og vernebriller. Få tak i en bladbryter, fjærblader, ett par fine tang, is, iskald 1x PBS og kryogene pinsett.</li>
	<li>Forbered en isbøtte for å holde 1x PBS iskald.</li>
	<li>Bruk bladbryteren til å ta tak i fjærbladet i en vinkel, og bøy bladet for å bryte av et lite stykke. Bladbryteren kan deretter låse bladet på plass for bruk som en liten skalpell. MERK: Ett blad skal vare i alle grupper. Bytt hvis bladet bryter eller blir kjedelig.</li>
	<li>Legg til en ren pipettespiss på P200 og fjern 1/5av spissen for å transportere prøver.</li>
	<li>Forbered et nytt mikrocentrifugerør for hver gruppe og tilsett 200 μL 1x PBS til hvert rør. Dette andre røret vil bli brukt til å samle de endelige DLM preps.</li>
	<li>Fjern alle 1x PBS fra rørene ved hjelp av en Pasteur pipette.</li>
	<li>Bruk riktig verneutstyr, senk røret ned i den flytende nitrogenkolben i 10 s med kryogene pinsett. MERK: Rørene skal lukkes tett for å hindre at røret eksploderer.</li>
	<li>Fjern røret fra det flytende nitrogenet og tilsett ca. 300 μL iskald 1x PBS til prøvene med en Pasteurpipette. Oppbevar prøvene på is.</li>
	<li>Tilsett iskald 1x PBS til 10 cm disseksjonsfatbelagt med silikonelikator og dispenser den første thoraxen med den modifiserte 200 μL pipetten.</li>
	<li>Plasser thorax ventralen med side opp. I den ene hånden bruker du et kjedelig par tang for å plassere thoraxen, og i den andre bruker du et fint par tang for å fjerne noe av thoraxganglionen for å avsløre midtlinjen av thoraxen.</li>
	<li>Bruk midtlinjen av thoraxen som en guide for å lage et grunt kutt gjennom 1/3rd av thoraxen med bladet.</li>
	<li>Fjern bladet fra thoraxen og plasser thoraxen i en 45° vinkel med de stumpe tangene. Sett inn bladet igjen og skjær rett ned midtlinjen på thoraxen. Dette vil resultere i to hemithoraces.</li>
	<li>Ta en hemithorax om gangen og fjern overflødig vev under DLM muskelfiber F (Figur 1B),den mest ventrale fiber. Bruk bladet til å nøye gjøre ett eller to kutt for å fjerne overflødig vev uten å skade DDLMs.</li>
	<li>Når den er isolert, overfører du hemithoraxen til riktig rør med 1x PBS.</li>
	<li>Gjenta trinn 4.6\u20124.14 til 10 dissekerte hemithoraces per gruppe er laget.</li>
</ol>5. Strukturell farging
<ol><li>Etter å ha bisecting thorax prøvene, plasser vevet i blokkerende buffer (1x PBS med 0,1% normal geit serum, og 0,2% Triton X-100 ved pH 7.4) for å gjennomsyre vevet og hindre ikke-spesifikk farging. Bruk en Pasteur pipette for å fjerne overflødig 1x PBS og legge til 1,5 ml blokkeringsbuffer til hvert rør. Blokkvev i minst 1 t ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered prøvene for strukturell farging ved hjelp av et fluorescerende konjugert antistoff, pepperrotperoksidase 488 (anti-HRP-488) ved en fortynning på henholdsvis 1:200 og Falloidin-647 ved en fortynning på 1:1000 i blokkerende buffer for å flekke motornevroner og muskelvev. Lag nok flekk til å ha 150 μL per rør. Oppbevar flekken ved 4 °C dekket av folie eller i en mørk boks til den er klar for farging.</li>
	<li>Etter blokkering, fjern overflødig blokkering buffer med et glass Pasteur pipette.</li>
	<li>Før du dispenserer den strukturelle flekken, virvler flekken. Tilsett 150 μL av flekken til hvert rør. Plasser prøvene i en mørk boks på rotatoren ved romtemperatur i 2 timer.</li>
	<li>Fjern flekken og vask vevet fire ganger i 1,5 ml romtemperatur 1x PBS med 0,3% Triton X-100 i 5 min på rotatoren i en mørk boks. Prøvene er nå klare til å monteres på et lysbilde.</li>
</ol>6. Montering vev
<ol><li>Etter å ha vasket prøver i PBST, forberede et mikroskop lysbilde for å montere vev for farging. Forbered ekstra forsyninger, inkludert glassdekselslips, en P200 pipette, 200 μL pipettespisser, saks, klare forsterkninger, rette kanttt tang, anti-fade fluorescerende monteringsmedier, neglelakk og en mørk boks for å dekke lysbildene.</li>
	<li>Merk lysbildet for å identifisere prøvene og rengjør lysbildet med kimwipes for å sikre at det ikke er flekker.</li>
	<li>For å sikre at hemithoraxprøvene ikke blir skadet av dekkslipp, bygg en "bro" ved hjelp av forsterkningsetiketter. Ta en forsterkningsetikett, kutt den i to, og legg hver halvdel ca. 15 mm fra hverandre. Denne avstanden må være mindre enn bredden på dekselet slip. Gjenta dette trinnet fire ganger for å fullføre en "bro" som er 5 etiketter høy.</li>
	<li>Ta P200-pipetten og modifiser en spiss ved å kutte av 1/5av spissen for å overføre prøvene til lysbildet. Prøver skal overføres til lysbildet i midten av broen.</li>
	<li>Ta kanten av en lab tørk og fjerne overflødig PBST. Ved hjelp av tang, ordne DLMs slik at alle prøver står overfor muskel side opp og cuticle side ned.</li>
	<li>Bruk en standard P200 pipettespiss til å bruke 70 μL monteringsmedier på lysbildet, og unngå luftbobler. Dispenser mediet i et sirkulært mønster inne i forsterkningene fra utsiden og inn i midten.</li>
	<li>Plasser en dekselslipp over forsterkningene.</li>
	<li>Bruk neglelakk til å belegge ytterkantene rundt omkretsen av dekkslippen. Påfør sjenerøst for å danne en fullstendig forsegling av vevet.</li>
	<li>Plasser lysbildet på en flat overflate i mørket, slik at minst 10 min tørker og forhindrer fotobleking eller tap av fluorescens. Lysbilder kan nå brukes til bildebehandling umiddelbart, eller på annen måte lagres i en lysbildemappe ved -20 °C for senere visning.</li>
</ol>7. Alternativ: Farging med primære antistoffer
MERK: Denne delen er valgfri og bør brukes direkte mellom avsnitt 4 og 5 hvis ønskelig.
<ol><li>Å flekke vev med primære antistoffer, senk vev i blokkeringsbuffer i minst 1 time.</li>
	<li>Forbered primært antistoff med riktig fortynning i blokkeringsbufferen. I det minste må du forberede nok antistoffblanding til å ha 150 μL per gruppe. Vær oppmerksom på at prøvene holdes stille. Oppbevares ved 4 °C til den er klar til bruk.</li>
	<li>Fjern overflødig blokkeringsbuffer med en Pasteurpipette. Virvle kort det primære antistoffet og tilsett 150 μL antistoffblanding til hver gruppe og plasser prøver ved 4 °C over natten.</li>
	<li>På neste dag fjerner du primært antistoff og vasker vev 4 ganger med PBST i 5 min hver på en rotator.</li>
	<li>Forbered sekundær flekk i blokkeringsbufferen. Tilsett den sekundære flekken i prøven og hold den deretter en romtemperatur i 2 timer i en mørk boks på rotatoren. MERK: Den sekundære fargingen kan også omfatte HRP og falloidin.</li>
	<li>Etter 2 t inkubasjon, for å fjerne sekundær flekkvaskvev 4 ganger i 5 min med PBST og fortsett til montering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+failure:+focus+in+an+integrative+view+of+ALS.">Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS.</a> Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).</li><li>Lodato, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+neurodegeneration+are+associated+with+increased+mutations+in+single+human+neurons.">Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons.</a> Science. 359, 555-559 (2018).</li><li>L&#243;pez-Erauskin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-linked+mutation+in+FUS+suppresses+intra-axonal+protein+synthesis+and+drives+disease+without+nuclear+loss-of-function+of+FUS.">ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS.</a> Neuron. 100, 816-830 (2018).</li><li>Munsie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-dependent+neurotransmitter+receptor+trafficking+to+synapses+is+altered+by+the+Parkinson's+disease+VPS35+mutation+p.+D620N.">Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N.</a> Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-transgenic+model+of+Alzheimer's+disease+with+plaques+and+tangles:+intracellular+A&#946;+and+synaptic+dysfunction.">Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular A&#946; and synaptic dysfunction.</a> Neuron. 39, 409-421 (2003).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+is+a+synaptic+failure.">Alzheimer's disease is a synaptic failure.</a> Science. 298, 789-791 (2002).</li><li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).</li><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+indirect+flight+muscle+innervation+in+Drosophila+melanogaster.">The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 118, 215-227 (1993).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-muscle+interactions+during+flight+muscle+development+in+Drosophila.">Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila.</a> Development. 125, 1769-1779 (1998).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pruning+of+motor+neuron+branches+establishes+the+DLM+innervation+pattern+in+Drosophila.">Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Fas+II+in+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+during+pruning+in+Drosophila.">A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila.</a> Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).</li><li>Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+synapse+model+in+Drosophila.">A tripartite synapse model in Drosophila.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Hunt, L. C., Demontis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunostaining+of+Drosophila+skeletal+muscle.">Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle.</a> Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles.">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6, 184-196 (2013).</li><li>Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elevation+of+sphingosine+1-phosphate+suppresses+dystrophic+muscle+phenotypes+in+Drosophila.">Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila.</a> Development. 140, 136-146 (2013).</li><li>Schnorrer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+of+muscle+morphogenesis+and+function+in+Drosophila.">Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila.</a> Nature. 464, 287-291 (2010).</li><li>Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudo-acetylation+of+K326+and+K328+of+actin+disrupts+Drosophila+melanogaster+indirect+flight+muscle+structure+and+performance.">Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance.</a> Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+remodeling+during+metamorphosis+influences+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+in+Drosophila.">Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila.</a> Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).</li><li>Ritson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mediates+degeneration+in+a+novel+Drosophila+model+of+disease+caused+by+mutations+in+VCP/p97.">TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Klagges, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+synapsins:+a+single+gene+codes+for+several+isoforms+in+Drosophila.">Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release.">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).</li><li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS.">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002 (2018).</li><li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li><li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation.">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li><li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight.">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Ved hjelp av metodene som er beskrevet i denne protokollen, gir vi en enkel tilnærming for disseksjon av DLM-vevet og viser hvordan dette kan brukes til å vurdere synaptisk integritet gjennom strukturell farging og synaptiske markører hos voksne Drosophila. Et kritisk skritt i protokollen som gjør DLM-vevet lettere å dissekere er blitsen som fryser med flytende nitrogen. Uten dette trinnet er vevet mindre fast og vanskeligere å kutte nøyaktig som observert i figur 3. Denne protokollen bygger på tidligere disseksjonsmetoder for å tillate bevaring av både motornevroner og muskelvev18,19,20,21,22,23. En begrensning av denne protokollen er at når du gjør kuttet ned midtlinjen for biseksjonen, kan det være vanskelig å få to rene preps per thorax. En måte å sikre minst en hemithorax per fly, kan du med vilje kutte av til den ene siden av thoraxen for å få en ren prep. Med denne endringen kan man også måtte fjerne ekstra overflødig vev fra kuttet for å rydde opp prøven med bladbryteren. For de som er nye i denne teknikken, med fortsatt praksis, vil nøyaktigheten av biseksjonen øke.
Metoden som er beskrevet her gjør det mulig for forskere å enkelt vurdere strukturell integritet av voksne DLM NMJs når som helst gjennom hele levetiden. En stor fordel med denne protokollen er evnen til å få tilgang til synaptisk integritet i nevrodegenerative sykdomsmodeller ved hjelp av synaptiske markører. Vi viser at dette programmet kan bidra til å visualisere endringer i brutto morfologi med strukturell farging (Figur 1C \ u2012H). I tillegg kan synaptisk integritet vurderes med farging av presynaptiske markører, inkludert, men ikke begrenset til Synapsin28 (figur 2A\u2012F), Syntaxin29 (figur 2G\u2012L) og BRP30 (figur 2M\u2012R). Det postsynaptiske muskelvevet kan også vurderes ved hjelp av glutamatreseptor III subunit antistoff31 (Figur 2S\u2012X), som viser nytten av denne protokollen.
Forskere kan også benytte denne disseksjonsmetoden for å utfylle funksjonelle data for å undersøke synapsenes strukturelle integritet knyttet til et bredt spekter av sykdommer. Disse synapsene tillater også funksjonell analyse gjennom elektrofysiologiske opptak32,,33,,34 og flyanalysen10. Denne protokollen kan også gi enkel tilgang til vevet for mange applikasjoner og analyser. Fremtidige studier, for eksempel, kan bruke denne protokollen til å kvantifisere synaptiske endringer gjennom kvantifisering av tettheten og antall synapser15,16. Mens protokollen beskrevet her spesifikt undersøker synaptisk integritet av motoriske nevroner, komplementære protokoller for å vurdere muskelcelletap kan også utføres med denne disseksjonen ved hjelp av TUNEL farging35. For å undersøke nevronalt tap, kan disseksjon av thorax ganglion36 også brukes med TUNEL farging. Vi forventer at disseksjonen som er beskrevet her vil ha flere anvendelser på fremtidige studier som vurderer aldersrelaterte patologier samt nevrodegenerative sykdommer.

Synaptisk dysfunksjon er blant de tidligste kjente kjennetegnene på de fleste store nevrodegenerative sykdommer1,,2,,3,,4,,5,,6. Imidlertid er svært lite kjent om hvordan disse strukturelle og funksjonelle svekkelsene forholder seg til senere stadier av sykdomsprogresjon. Drosophila har vist seg å være et nyttig modellsystem for å forstå synapse vekst og utvikling ved hjelp av larval NMJs7,8,9. Imidlertid varer den tredje larval instar-fasen bare noen få dager, og begrenser deres nytte i å studere progressiv, aldersavhengig nevrodegenerasjon. Et alternativ til å vurdere larval NMJs er å undersøke synaptiske strukturer hos voksne Drosophila, for eksempel synapsene dannet på Dorsal Longitudinal Muscles (DDLMs) som kreves for flight10,11,12,13,14,15,16. Disse trepartssynapsene er strukturelt organisert på samme måte som pattedyrsynapser17, noe som gir en unik fordel for å vurdere modeller av nevrodegenerative sykdommer.
Her beskriver vi en enkel metode for å analysere den strukturelle integriteten til voksne NMJs i en Drosophila-modell av nevrodegenerasjon. Tidligere DLM disseksjon metoder og studier har understreket viktigheten av å bevare muskelvev for en rekke applikasjoner18,19,20,21,22,23. Vår protokoll gir en omfattende metode for å bevare både nevronale og muskelvev for å undersøke nevrodegenerative sykdommer. En annen viktig komponent i å studere disse sykdommene er evnen til å forstå nevronalt tap på en aldersavhengig måte. Tidligere arbeid gir en kritisk og grundig forståelse av hvordan DLM NMJs dannes under metamorfose i tidlig voksenalder 11,12,14,15,16,24. Vår protokoll etablerer en metode for å bygge videre på dette arbeidet for å undersøke DLM NMJs på en aldersavhengig måte i aldring og nevrodegenerative sykdommer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="724">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">32% Formaldehyde</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">15714</td>
			<td style="width:227px;">Tissue preservation</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti mouse</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11031</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti rabbit</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11036</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">anti- Bruchpilot (BRP) antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>NC82</td>
			<td style="width:227px;">Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:216px;">anti-GluRIII antibody</td>
			<td style="width:121px;">Gift from Aaron DiAntonio</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:227px;">Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">anti-Synapsin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">3C11</td>
			<td style="width:227px;">Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">anti-Syntaxin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">8C3</td>
			<td style="width:227px;">labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">BenchRocker</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">31-302</td>
			<td style="width:227px;">Rotating samples during staining</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:94px;width:216px;">Blade Breaker</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">10053-09</td>
			<td style="width:227px;">Used for holding feather blade</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">cover slips</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12548A</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic gloves</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>97008-198</td>
			<td style="width:227px;">protect hands from liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic tweezers</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>82027-432</td>
			<td style="width:227px;">Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">dewar flask-1900 mL</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td>5028M54</td>
			<td style="width:227px;">Hold liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Feather Blades</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72002-01</td>
			<td style="width:227px;">Scalpel Blades</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">Fine Forecps x 2</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11252-20</td>
			<td style="width:227px;">One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:216px;">FITC-conjugated anti HRP</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:161px;">123-545-021</td>
			<td style="width:227px;">Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">freezer box (Black)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14100F</td>
			<td style="width:227px;">Protects samples from light</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14637-010</td>
			<td style="width:227px;">Used to transfer samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">glass slides</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12550143</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">mounting media (vectashield) anti-fade</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">101098-042</td>
			<td style="width:227px;">Mounting media retains fluorescent signaling</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72180</td>
			<td style="width:227px;">Seals microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">PCN5000</td>
			<td style="width:227px;">Prevents non-specific binding of antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">paint brush</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-204</td>
			<td style="width:227px;">Transferring flies</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-010-023</td>
			<td style="width:227px;">Saline solution for dissecting and staining</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phalloidin 647</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td>AB176759</td>
			<td style="width:227px;">Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">plastic petri dish (100 mm)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">25373-100</td>
			<td style="width:227px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:216px;">reinforcement labels</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>AVE05722</td>
			<td style="width:227px;">Provides support for glass coverslip over the mounted tissue</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">sharpening block</td>
			<td style="width:121px;">Grainger</td>
			<td style="width:161px;">1RDF5</td>
			<td style="width:227px;">Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">slide folder</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">10126-326</td>
			<td style="width:227px;">Sample storage</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">standard office scissors</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>ACM40618</td>
			<td style="width:227px;">Cutting reinforcement labels</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">24236-10</td>
			<td style="width:227px;">Coating for dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">22140</td>
			<td style="width:227px;">Helps to permeabilize tissue</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Vannas Disssection Sissors</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">1500-00</td>
			<td style="width:227px;">Ued for removing fly legs and making an incision on thorax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration

Drosophila fungerer som en nyttig modell for å vurdere synaptisk struktur og funksjon forbundet med nevrodegenerative sykdommer. Mens mye arbeid har fokusert på nevromuskulære veikryss (NMJs) i Drosophila larver, har vurdering av synaptisk integritet hos voksne Drosophila fått mye mindre oppmerksomhet. Her gir vi en enkel metode for disseksjon av dorsal langsgående muskler (DDLMer), som kreves for flyevne. I tillegg til å fly som en atferdslesing, gjør denne disseksjonen at både DLM-synapser og muskelvev kan være mottagelig for strukturell analyse ved hjelp av fluorescerende merkede antistoffer for synaptiske markører eller proteiner av interesse. Denne protokollen gjør det mulig å evaluering av synapsers strukturelle integriteten til synapser hos voksne Drosophila under aldring for å modellere den progressive, aldersavhengige karakteren til de fleste nevrodegenerative sykdommer.

Genereringen av transgene fluer som uttrykker humant Tar-Binding Protein på 43 kDa mutant (TDP-43M337V) er representert ved skjematisk (figur 1A). Dette demonstrerer anvendelsen av binære Gal4 /UAS system i Drosophila27. Illustrasjonen viser en hemithorax med seks muskelfibre, A\u2012F går fra den mest dorsale fiber A til den mest ventrale F (Figur 1B)11,12. For å vurdere synaptisk integritet ble NMJs farget med HRP og Falloidin (figur 1C\u2012E). Motornevroner i TDP-43M337V mutanter(figur 1F)har liten eller ingen HRP-farging innen dag 21, mens WT (Oregon-R) forblir intakt (figur 1C). Det er ingen synlige forskjeller i muskelfarging (figur 1D, G). Endringene i grov morfologi observert i TDP-43M337V mutanter viser hvordan synaptisk integritet kan innblandet i en nevrodegenerativ sykdom modell av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) ved hjelp av den voksne DLM-modellen. I tillegg til strukturell farging kan farging av DLM NMJs også gi en vurdering av synaptisk integritet med presynaptiske (figur 2A \\ u2012R) og postsynaptiske ( figur2S \ u2012X) markører. Sammen illustrerer disse resultatene hvordan denne disseksjonsprotokollen kan brukes til å studere DLM-vev i nevrodegenerative sykdommer.
Et viktig aspekt ved denne disseksjonen er anvendelsen av flytende nitrogen for å blinke fryse vevet for å gjøre biseksjonen enklere. Nytten av flytende nitrogen er demonstrert i WT fluer med flytende nitrogen der muskelvev har ingen skade eller nicked fibre (Figur 3A \ u2012C). Uten flytende nitrogen kan vevet være vanskeligere å dissekere. For eksempel, etter denne protokollen og hoppe over flytende nitrogen flash frysing trinn gjør at vevet å være mer utsatt for skade fra disseksjon verktøy som skadede nevroner (Figur 3D) eller skadede muskelfibre (Figur 3E). Påføring av flytende nitrogen bidrar til å forhindre vevsskade som kan oppstå ved arbeid med DLM-vev uavhengig av genotypen på prøven (figur 3C og 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figur 1: Progressiv denervasjon av DLM synapser i en Drosophila modell av ALS. (A)Generasjonen av ALS transgene fluer som uttrykker en menneskelig mutant form for Tar-Binding Protein på 43 kDa (TDP-43) er vist i skjematisk. (B)Illustrasjonen viser formen og orienteringen til en hemithorax i en voksen Drosophila. Ved hjelp av protokollen kan vi observere det progressive tapet av synaptisk integritet av DLM NMJ synapser gjennom strukturell farging av motorneuroner med HRP (grønn) og muskelvev med Phalloidin (magenta). Vår modell viser tap av synaptisk integritet i en voksen modell av ALS gjennom generering av voksne fluer som uttrykker en mutant fra menneskelig TDP-43M337V i motoriske nevroner (Figur 1F \ u2012H) i forhold til WT (Figur 1C \ u2012E) flyr i muskelfiber C. Piler uthever eksempler på en WT-synapse (figur 1C) og et eksempel på tap av synaptisk integritet. Skaler bar = 20 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Figur 2: Vurdere synaptisk integritet ved hjelp av presynaptiske markører ved voksne NMJs. Synaptisk integritet kan også vurderes ved hjelp av presynaptiske og postsynaptiske markører i WT fluer som er 14 dager gamle i muskelfiber C. De presynaptiske markørene Synapsin (B), Syntaxin (H) og Bruchpilot (BRP) (N) er co-farget med HRP (A, G, M). Fargingen viser lokaliseringen av disse markørene til de presynaptiske terminalene (C, I, O). Ved høyere forstørrelse illustrerer bildene lokaliseringen av Synapsin (E), Syntaxin (K) og BRP (Q) med HRP (D, Jog P) mer detaljert (figur F, Log R). Vi viser også en postsynaptisk markør Glutamat Receptor III (GluRIII)(T) co-farget med HRP (S). Co-farging demonstrerer nytten av disse markørene (U). Ved høyere forstørrelse eksemplifiserer de representative bildene lokaliseringen (X) av GluRIII (W) og HRP (V) til postsynaptisk muskelvev og de presynaptiske terminalene. Skaleringslinjen for paneler A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U representerer 20 μm ved 63x forstørrelse. Skaleringslinjen for paneler D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R og 2V-2X representerer 10 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Figur 3: Nytte av flytende nitrogen for DLM-disseksjoner. For å demonstrere nytten av flytende nitrogen for DLM-disseksjonene, viser vi en sammenligning av dag 21 WT fluer med og uten flytende nitrogen fra muskelfiber C. Med flytende nitrogen forblir Falloidin (B) intakt og går ikke på akkord med HRP-fargingen (A, C). Uten flytende nitrogen blir muskelvev streng og vanskelig å bisect(E) og HRP farging (D, F) blir kompromittert på grunn av teknisk feil. Hvite piler viser et område uten muskelskade i med flytende nitrogen (B) og skadet muskelvev (E). Vektstangen = 20 μm ved 63x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Målet med denne prosedyren er å dissekere dorsal langsgående muskel (DLM) vev for å vurdere den strukturelle integriteten til DLM nevromuskulære veikryss (NMJs) i nevrodegenerative sykdom modeller ved hjelp av Drosophila melanogaster.

Visualisere synaptisk degenerasjon hos voksne Drosophila i forbindelse med nevrodegenerasjon

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

En protokoll gir en enkel modell for vurdering av synaptisk integritet på en aldersavhengig måte. Så vi kan studere nevrodegenerative sykdommer i vev som er mottagelige for både strukturell og funksjonell analyse. Denne teknikken letter bevaring av både nevronale og muskelvev fra dorsal langsgående muskel nevromuskulære veikryss.Å omfattende undersøke synaptisk funksjon over tid og vev som er vanskelig å jobbe med. Denne metoden kan brukes på studiet av nevrodegenerative sykdommer, inkludert ALS, Parkinsons, Huntingtons og Alzheimers sykdom. Før du begynner disseksjon kuttet ca 10 millimeter fra spissen av en 200 mikroliter pipette.Etter administrering av anestesi, spille seks til 10 fluer i en seks centimeter Petri skål som inneholder 70% etanol og bruke en pensel til å forsiktig nippe slå sammen hver fly. Etter ett til to minutter, bruk tang til å overføre en flue av bena eller vingene til en silikon elastomer belagt disseksjonsfat som inneholder syv til 10 milliliter PBS under et dissekerende mikroskop. Med fluen nedsenket i PBS, bruk sløv Dumont nummer fem finne tang for å forsiktig fjerne vingene og bruke span en rett kant våren disseksjon saks for å gjøre et lite snitt i ventral side av skjellaget for å fjerne bena.Hold disseksjonssaksen i den ene hånden og stumpe tang i den andre, plasser flyventralsiden opp og hold prøven på plass med tangene, fjern hodet og magen med saksen. Bruk en 200 mikroliter pipette satt til 40 mikroliter og den modifiserte pipettespissen for å samle thoraxene og plassere de isolerte vevsprøvene i et passende merket rør som inneholder 900 mikroliter PBS og 150 mikroliter på 32% formaldehyd. Etter 30 minutter ved romtemperatur, bruk en Pasteur pipette for å fjerne fikseringsmiddelet og skyll plies tre ganger med 1,5 milliliter PBS per vask.Før du begynner biseksjonene Don cryo vernehansker og vernebriller og fylle en tur kolbe med flytende nitrogen. Bruk en bladbryter til å ta et fjærblad i en vinkel og bøy bladet for å bryte av et lite stykke. Bruk bladbryteren til å låse bladet på plass og bruk en pasteurpipette i glass til å fjerne alle PBS-ene fra prøverørene.Bruk kryogene pinsett for å senke rørene i kolben av flytende nitrogen. Etter 10 sekunder, bruk en Pasteur pipette for å legge til ca 300 mikroliter iskald PBS til hvert rør på is, og plasser en dårlig Axe ventral side opp i en 10 centimeter silikon elastomer belagt disseksjonsfat som inneholder iskald PBS. Bruk et kjedelig par tang for å plassere thoraxen og for å finne par tang, for å fjerne noen av thoraxgangliaene for å avsløre midtlinjen av thoraxen.Bruk midtlinjen av thoraxen som en guide, bruk stykket til å lage et grunt kutt gjennom en tredjedel av thoraxen og bruk de stumpe tangene til å plassere thoraxen i en 45 graders vinkel. Bruk bladet til å kutte rett ned midtlinjen av thoraxen for å oppnå to hemithoraces og å forsiktig gjøre ett eller to kutt for å fjerne overflødig vev uten å skade den dorsale langsgående muskler. Plasser deretter muskelvevsprøvene i et passende merket rør av PBS.Når alle thoraxprøvene har blitt bisected permeabiliserer vevet i blokkeringsbuffer i minst en time ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vortex nylaget strukturell flekkløsning og tilsett 150 mikroliter av flekken til hver prøve i en to timers inkubasjon på en rotator ved romtemperatur i mørket. Etter farging vask prøvene i PBST, og plasser fem forsterkningsetiketter stablet og kuttet i halvparten 15 millimeter fra hverandre på ett glassmikroskop lysbilde.Bruk en modifisert mikropipettespiss til å overføre Thoraces på hvert lysbilde og bruk en laboratorieserviett til å fjerne overflødig PBST. Bruk tang for å ordne prøvene slik at Thoraces står overfor muskelsiden opp. Når prøvene er riktig orientert, bruk en 200 mikroliters pipettespiss til å påføre 70 mikroliter monteringsmedium til hvert lysbilde og dekke hvert lysbilde med en dekselslipp.Bruk deretter neglelakk til sjenerøst belegge ytterkantene av dekselet slips for å få en fullstendig forsegling rundt hvert vev. For å vurdere den synaptiske integriteten. Neuromuscular veikryss kan farges med pepperrot peroxidase og Floe tinn Motor nevroner i tjære bindende protein av 43 Kilodalton mutans har liten eller ingen pepperrot peroxidase farging av dag 21, mens vill type protein forblir intakt.Ingen synlige forskjeller i muskelfarging observeres. I tillegg til strukturell farging dorsal langsgående muskel nevromuskulære knutepunkt merking kan også gi en vurdering av synaptisk integritet med pre synaptic og post synaptic markører. Legg merke til at flytende nitrogen flash frysing forenkler en vellykket biseksjon som ikke-flash frosset vev er mer utsatt for skade under disseksjon.Etter denne prosedyren kan bevaringsprøvene analyseres ved konfokal mikroskopi for å måle en bestemt aspekter ved synaptisk struktur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Utlede Tid Course of Glutamat Lagersalg med en deconvolution Analyse av astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histologi å kvantifisere Nevrodegenerasjon i<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...