Name: visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01 NS110727) в D.T.B.

1. Поколение трансгенных мух
<ol><li>Для генерации трансгенных мух для этого эксперимента, собирать OK371-Gal425 девственных самок мух и самцов UAS-TDP-43M337V 26 (Рисунок 1A) путем обезболиив мух с CO2 на площадке для сортировки.</li>
	<li>Сортировать анестезированных мух во флаконы со стандартными Drosophila средств массовой информации для креста. Поместите помеченные флаконы при 25 градусов по Цельсию для следующего поколения, чтобы выйти. ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить взрослых от флаконов до потомства возникают для обеспечения надлежащего генотипа.</li>
	<li>Как только потомство появится, собирать трансгенных мух во флаконы и сортировать по полу, чтобы начать старение для экспериментальных условий.</li>
	<li>После того, как мухи собраны, передача мух на свежие продукты питания каждые 2 дня, пока мухи 21 дней.</li>
</ol>2. Подготовка к вскрытию
<ol><li>Чтобы подготовиться к вскрытиям, получить комнатную температуру фосфат буфера солевого раствора (1x PBS), 10 см рассечения блюдо покрыто силиконовым ерастомером, прямой край рассечения ножницы, один набор тупых миппов вскрытия, P200 пипетки и пипетки советы, 2,0 мл микроцентрифуг трубки, стандартные офисные ножницы, 70% этанола, 6 см Петри блюдо, и 32% формальдегида разбавленной до 4% с 1x PBS.</li>
	<li>Этикетка трубки для каждого генотипа или состояния и добавить 900 йл 1x PBS (комната темп) и 150 МКЛ 32% формальдегида для каждой трубки. Носите перчатки и защитные очки при подготовке 4% формальдегид фиксации.</li>
	<li>Обезболивать 6'u201210 мух на группу непосредственно из флакона с CO2 и погрузить мух в 6 см Петри блюдо с 70% этанола. Нажмите летит вниз в этанол с помощью кисти краски, чтобы убедиться, что образцы полностью погружены. Это позволит удалить слой масла на внешней кутикулы.</li>
</ol>3. Изоляция и фиксация торакса
<ol><li>Прежде чем вскрыть каждый экземпляр, добавьте приблизительно 7'u201210 мл 1x PBS к блюду для вскрытия, покрытому силиконовым еластомером. Этот объем должен гарантировать, что образцы тканей полностью погружены.</li>
	<li>Перенесите одну муху в блюдо для вскрытия из 70% этанола, используя тупые типсы и хватаясь за крылья или ноги.</li>
	<li>Сосредоточьте образец в рассечении под рассечением микроскопа. Затем погрузим образец в 1x PBS и аккуратно удалите крылья, используя тупые типсы dumont #5 тонкие миппы.</li>
	<li>Использование Vannas прямой край пружинного вскрытия ножницами, удалить ноги, создавая небольшой разрез в брюшной стороне кутикулы. В шаге 3.8, этот разрез позволит формальдегиду проникнуть в ткань.</li>
	<li>Возьмите ножницы в одной руке и держите типсы в другой, чтобы распоставить муху брюшной стороны вверх. Удерживая образец на месте тупыми типсами, снимите голову и живот ножницами для вскрытия.</li>
	<li>Перенесите изолированную грудную клетку с помощью модифицированного наконечника пипетки в помеченную трубку из шага 3.2. ПРИМЕЧАНИЕ: Установите пипетки до 40 МКЛ, чтобы избежать добавления дополнительных 1x PBS к фиксатору.</li>
	<li>Повторите шаги 3.2'u20123.6 выше для каждого образца.</li>
	<li>Исправить образцы в течение 30 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Удалите исправление с помощью трубы Pasteur и выбросить его в надлежащий контейнер отходов под капотом дыма. Промыть образцы три раза с 1,5 мл 1x PBS каждый с помощью трубы Pasteur. Завершите четвертое полоскание, используя только 750 МКЛ и оставьте ткани в 1x PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент образцы тканей могут оставаться на уровне 4 градусов по Цельсию в течение 3 дней, прежде чем приступить к следующим шагам.</li>
</ol>4. Вспышка замораживания и биекции грудной клетки
<ol><li>Перед началом раздвоения заполните колбу Dewar жидким азотом в надлежащих криозащитных перчатках и защитных очках. Получить лезвие выключатель, перо лезвия, одна пара тонких типсов, лед, ледяной 1x PBS, и криогенные пинцет.</li>
	<li>Подготовка льда ведро держать 1x PBS ледяной.</li>
	<li>Используйте выключатель лезвия, чтобы захватить перо лезвие под углом, и согнуть лезвие для того, чтобы разорвать небольшой кусок. Выключатель лезвия может зафиксировать лезвие в положении для использования в качестве небольшого скальпеля. ПРИМЕЧАНИЕ: Одно лезвие должно длиться для всех групп. Переключитесь, если лезвие ломается или становится скучным.</li>
	<li>Добавьте чистый наконечник пипетки в P200 и удалите1/5 тыс. наконечника для транспортировки образцов.</li>
	<li>Подготовьте новую трубку микроцентрифуга для каждой группы и добавьте 200 МКЛ 1x PBS к каждой трубке. Эта вторая трубка будет использоваться для сбора окончательных DLM preps.</li>
	<li>Удалите все 1x PBS из труб с помощью пипетки Pasteur.</li>
	<li>Нося надлежащее защитное оборудование, погружайте трубку в жидкую азотную колбу на 10 с криогенными пинцетами. ПРИМЕЧАНИЕ: Трубы должны быть плотно закрыты, чтобы держать трубку от взрыва.</li>
	<li>Снимите трубку с жидкого азота и добавьте около 300 МКЛ ледяной 1x PBS в образцы с пипеткой Pasteur. Храните образцы на льду.</li>
	<li>Добавьте ледяной 1x PBS к 10-сантиметровому рассечению тарелки, покрытой силиконовым елатомером, и раздайте первую грудную клетку с модифицированной трубкой 200 МКЛ.</li>
	<li>Поместите вентральную сторону грудной клетки вверх. В одной руке использовать скучную пару типсов для положения грудной клетки, а в другой использовать тонкую пару типсов, чтобы удалить некоторые из грудной ганглиона подвергать средней линии грудной клетки.</li>
	<li>Используйте середину грудной клетки в качестве руководства, чтобы сделать мелкий разрез через 1/3rd грудной клетки с лезвием.</li>
	<li>Снимите лезвие с грудной клетки и распоимить грудную клетку под углом 45 градусов тупыми типсами. Переустановьте лезвие и вырежьте прямо вниз по средней линии грудной клетки. Это приведет к двум гамиторам.</li>
	<li>Возьмите один гамиторакс за один раз и удалить избыток ткани под DLM мышечного волокна F (Рисунок 1B), наиболее брюшного волокна. Используйте лезвие, чтобы тщательно сделать один или два разреза, чтобы удалить избыток ткани, не повреждая DLMs.</li>
	<li>После изоляции перенесите гемиторакс в правильную трубку с помощью 1x PBS.</li>
	<li>Повторите шаги 4.6'u20124.14 до тех пор, пока не будет сделано 10 рассеченных гемитора на группу.</li>
</ol>5. Структурное окрашивание
<ol><li>После двухразделивания образцов грудной клетки поместите ткань в блокирующий буфер (1x PBS с 0,1% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Triton X-100 при рН 7.4) для пронизывания тканей и предотвращения неспецифического окрашивания. Используйте пипетку Pasteur, чтобы удалить избыток 1x PBS и добавить 1,5 мл блокирующего буфера к каждой трубке. Блок тканей, по крайней мере 1 ч при 4 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Подготовка образцов для структурного окрашивания с использованием флуоресцентно спряженных антител, пероксидазы хрена 488 (анти-HRP-488) при разбавлении 1:200 и фаллоидин-647 при разбавлении 1:1000 в блокировании буфера для окрашивания моторных нейронов и мышечной ткани, соответственно. Сделайте достаточно пятна, чтобы иметь 150 йл на трубку. Храните пятно при 4 градусах цельсия, покрытых фольгой или в темной коробке до готовности к окрашивания.</li>
	<li>После блокировки удалите избыточный блокирующий буфер стеклянной пипеткой Pasteur.</li>
	<li>Перед дозированием структурного пятна, вихрь пятно. Добавьте 150 мкл пятна в каждую трубку. Поместите образцы в темную коробку на ротатор при комнатной температуре 2 ч.</li>
	<li>Удалить пятно и мыть ткани четыре раза в 1,5 мл комнаты темп 1x PBS с 0,3% Triton X-100 в течение 5 минут на ротатор в темной коробке. Образцы теперь готовы к монтажу на слайде.</li>
</ol>6. Монтаж тканей
<ol><li>После мытья образцов в PBST, подготовить слайд микроскопа для установки ткани для окрашивания. Подготовьте дополнительные материалы, включая стеклянные крышки скользит, P200 пипетки, 200 йл пипетки советы, ножницы, четкие подкрепления, прямые миппы края, анти-fade флуоресцентные монтажные средства, лак для ногтей, и темная коробка для покрытия слайдов.</li>
	<li>Наклеьте этикетку слайд, чтобы определить образцы и очистить слайд с кимвипей, чтобы убедиться, что нет пятен.</li>
	<li>Чтобы убедиться, что образцы гамиторакса не повреждены крышкой скольжения, построить "мост" с использованием арматуры этикетки. Возьмите одну этикетку подкрепления, разрежьте ее пополам, и поместите каждую половину примерно на 15 мм друг от друга. Это расстояние должно быть меньше, чем ширина крышки скольжения. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы завершить "мост", который составляет 5 этикеток высотой.</li>
	<li>Возьмите P200 пипетку и изменить наконечник, отрезав1/5 тыс. наконечника для передачи образцов на слайд. Образцы должны быть перенесены на горку в центре моста.</li>
	<li>Возьмите край лаборатории протрите и удалите излишки PBST. Используя типсы, организовать DLMs таким образом, что все образцы сталкиваются мышечной стороне вверх и кутикулы вниз.</li>
	<li>Используя стандартный наконечник пипетки P200, нанесите на слайд 70 МКЛ монтажных средств массовой информации, избегая пузырьков воздуха. Распределять средства массовой информации по круговой схеме внутри подкрепления, начиная с внешней стороны в центр.</li>
	<li>Поместите крышку скольжения над подкреплением.</li>
	<li>Используйте лак для ногтей, чтобы покрыть внешние края по периметру крышки. Нанесите щедро, чтобы сформировать полную печать ткани.</li>
	<li>Поместите слайд на плоскую поверхность в темноте, что позволяет по крайней мере 10 минут, чтобы высохнуть и предотвратить фото-отбеливания или потери флуоресценции. Слайды теперь могут быть использованы для визуализации немедленно, или иным образом храниться в папке слайда при -20 градусов по Цельсию для более длительного просмотра.</li>
</ol>7. Альтернатива: Окрашивание первичными антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел является необязательным и должен использоваться непосредственно между разделами 4 и 5 при желании.
<ol><li>Чтобы окрашивать ткани первичными антителами, погрузите ткань в блокирующий буфер не менее 1 ч.</li>
	<li>Подготовье первичного антитела с надлежащим разбавлением в блокирующий буфер. Как минимум, подготовить достаточно смеси антител, чтобы иметь 150 йл в группе. Обратите внимание, что образцы хранятся на месте. Хранить при 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию.</li>
	<li>Удалите избыточный блокирующий буфер с помощью пипетки Pasteur. Кратко вихрь первичного антитела и добавить 150 ЗЛ смеси антител к каждой группе и место образцов на 4 градусов по Цельсию в одночасье.</li>
	<li>На следующий день, удалить первичные антитела и мыть ткани 4 раза с PBST в течение 5 минут каждый на ротатор.</li>
	<li>Подготовь вторичное пятно в блокируя буфере. Добавить вторичное пятно в образец, а затем держать его комнатной температуры в течение 2 ч в темной коробке на ротатор. ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное окрашивание может также включать HRP и фаллоидин.</li>
	<li>После 2 ч инкубации, чтобы удалить вторичное пятно мыть ткани 4 раза в течение 5 мин с PBST и приступить к монтажу.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+failure:+focus+in+an+integrative+view+of+ALS.">Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS.</a> Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).</li><li>Lodato, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+neurodegeneration+are+associated+with+increased+mutations+in+single+human+neurons.">Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons.</a> Science. 359, 555-559 (2018).</li><li>L&#243;pez-Erauskin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-linked+mutation+in+FUS+suppresses+intra-axonal+protein+synthesis+and+drives+disease+without+nuclear+loss-of-function+of+FUS.">ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS.</a> Neuron. 100, 816-830 (2018).</li><li>Munsie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-dependent+neurotransmitter+receptor+trafficking+to+synapses+is+altered+by+the+Parkinson's+disease+VPS35+mutation+p.+D620N.">Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N.</a> Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-transgenic+model+of+Alzheimer's+disease+with+plaques+and+tangles:+intracellular+A&#946;+and+synaptic+dysfunction.">Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular A&#946; and synaptic dysfunction.</a> Neuron. 39, 409-421 (2003).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+is+a+synaptic+failure.">Alzheimer's disease is a synaptic failure.</a> Science. 298, 789-791 (2002).</li><li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).</li><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+indirect+flight+muscle+innervation+in+Drosophila+melanogaster.">The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 118, 215-227 (1993).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-muscle+interactions+during+flight+muscle+development+in+Drosophila.">Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila.</a> Development. 125, 1769-1779 (1998).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pruning+of+motor+neuron+branches+establishes+the+DLM+innervation+pattern+in+Drosophila.">Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Fas+II+in+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+during+pruning+in+Drosophila.">A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila.</a> Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).</li><li>Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+synapse+model+in+Drosophila.">A tripartite synapse model in Drosophila.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Hunt, L. C., Demontis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunostaining+of+Drosophila+skeletal+muscle.">Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle.</a> Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles.">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6, 184-196 (2013).</li><li>Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elevation+of+sphingosine+1-phosphate+suppresses+dystrophic+muscle+phenotypes+in+Drosophila.">Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila.</a> Development. 140, 136-146 (2013).</li><li>Schnorrer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+of+muscle+morphogenesis+and+function+in+Drosophila.">Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila.</a> Nature. 464, 287-291 (2010).</li><li>Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudo-acetylation+of+K326+and+K328+of+actin+disrupts+Drosophila+melanogaster+indirect+flight+muscle+structure+and+performance.">Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance.</a> Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+remodeling+during+metamorphosis+influences+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+in+Drosophila.">Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila.</a> Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).</li><li>Ritson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mediates+degeneration+in+a+novel+Drosophila+model+of+disease+caused+by+mutations+in+VCP/p97.">TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Klagges, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+synapsins:+a+single+gene+codes+for+several+isoforms+in+Drosophila.">Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release.">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).</li><li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS.">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002 (2018).</li><li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li><li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation.">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li><li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight.">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Используя методы, описанные в этом протоколе, мы предоставляем простой подход для вскрытия ткани DLM и продемонстрировать, как это может быть применено для оценки синаптической целостности путем структурного окрашивания и синаптических маркеров у взрослых дрозофилы. Одним из важнейших шагов в протоколе, который делает DLM ткани легче вскрыть это вспышка замораживания с жидким азотом. Без этого шага, ткань является менее твердой и труднее сократить точно, как это наблюдается на рисунке 3. Этот протокол основывается на предыдущих методах вскрытия, позволяющих сохранить как моторные нейроны, так и мышечную ткань18,,19,,20,,21,,22,,23. Одним из ограничений этого протокола является то, что при сокращении средней линии для биекции, это может быть трудно получить два чистых preps на грудную клетку. Один из способов обеспечить по крайней мере один гамиторакс на лету, вы можете намеренно отрезать в одну сторону грудной клетки, чтобы получить один чистый подготовки. С помощью этой модификации, можно также необходимо удалить дополнительные избыточные ткани из разреза, чтобы очистить образец с лезвием выключатель. Для тех, кто нов к этому методу, с продолжением практики, точность bisection будет увеличиваться.
Описанный здесь метод позволяет исследователям легко оценить структурную целостность взрослых DLM NMJs в любое время на протяжении всей их жизни. Основным преимуществом этого протокола является возможность доступа к синаптической целостности в моделях нейродегенеративных заболеваний с помощью синаптических маркеров. Мы демонстрируем, что это приложение может помочь визуализировать изменения в валовой морфологии соструктурным окрашивание(рисунок 1C'u2012H). Кроме того, синаптической целостности могут быть оценены с окрашивание пресинаптических маркеров, включая, но не ограничиваясь Synapsin28 ( Рисунок2 A'u2012FA‒F), Синтаксин29 (Рисунок 2G'u2012L) и BRP30 (Рисунок 2 M'u2012RM‒R). Постсинаптической мышечной ткани также могут быть оценены с помощью глутамата Рецептор IIIсубъединит антитела 31 (Рисунок 2 S'u2012XS‒X), демонстрируя полезность этого протокола.
Исследователи могут также использовать этот метод вскрытия в дополнение к функциональным данным для всестороннего изучения структурной целостности синапсов, связанных с широким спектром заболеваний. Эти синапсы также позволяют для функционального анализа с помощьюэлектрофизиологических,записей 32 , 33,34 и полет анализа10. Этот протокол может также обеспечить легкий доступ к ткани для многих приложений и анализов. Будущие исследования, например, может использовать этот протокол для количественной оценки синаптических изменений путем количественной оценки плотности иколичества синапсов 15,16. Хотя протокол, описанный здесь конкретно рассматривает синаптической целостности моторных нейронов, дополнительные протоколы для оценки потери мышечных клеток также может быть выполнена с этим вскрытием с помощью TUNELокрашивания 35. Для изучения потери нейронов, вскрытие грудной ганглия36 также может быть использован с TUNEL окрашивания. Мы ожидаем, что описанное здесь вскрытие будет иметь больше применений к будущим исследованиям, оценивающих возрастные патологии, а также нейродегенеративные заболевания.

Синаптическая дисфункция является одним из самых ранних известных признаков большинства основных нейродегенеративных заболеваний1,,2,,3,,4,,5,,6. Тем не менее, очень мало известно о том, как эти структурные и функциональные нарушения относятся к более поздним стадиям прогрессирования заболевания. Drosophila зарекомендовала себя как полезная модельная система для понимания роста и развития синапса с использованием личинок NMJs7,,8,9. Тем не менее, третья личинотка instar этапе длится всего несколько дней, ограничивая их полезность в изучении прогрессивных, возрастных нейродегенерации. Альтернативой оценке личинок NMJ является изучение синаптических структур у взрослыхдрозофилы, таких как синапсы, образуюющиеся на продольных мышцах спинного мозга (DLM), которыенеобходимы для полета 10,,11,,12,,13,,14,,15,,16. Эти трехсторонние синапсы структурно организованы по аналогии с синапсамимлекопитающих 17,обеспечивая уникальное преимущество для оценки моделей нейродегенеративных заболеваний.
Здесь мы описываем простой метод для анализа структурной целостности взрослых NMJs в модели Drosophila нейродегенерации. Предыдущие методы и исследования DLM вскрытия подчеркнули важность сохранения мышечнойткани для различных применений 18,,19,,20,,21,,22,,23. Наш протокол предоставляет комплексный метод сохранения как нейронной, так и мышечной ткани для исследования нейродегенеративных заболеваний. Другим важным компонентом изучения этих заболеваний является способность понимать потерю нейронов в возрастной зависимости. Предыдущая работа обеспечивает критическое и глубокое понимание того, как DLM NMJs формируются во время метаморфозыв раннем взрослом возрасте 11,,12,,14,,15,,16,24. Наш протокол устанавливает метод, чтобы опираться на эту работу, чтобы исследовать DLM NMJs в возрастной зависимости от старения и нейродегенеративных заболеваний.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="724">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">32% Formaldehyde</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">15714</td>
			<td style="width:227px;">Tissue preservation</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti mouse</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11031</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti rabbit</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11036</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">anti- Bruchpilot (BRP) antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>NC82</td>
			<td style="width:227px;">Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:216px;">anti-GluRIII antibody</td>
			<td style="width:121px;">Gift from Aaron DiAntonio</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:227px;">Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">anti-Synapsin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">3C11</td>
			<td style="width:227px;">Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">anti-Syntaxin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">8C3</td>
			<td style="width:227px;">labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">BenchRocker</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">31-302</td>
			<td style="width:227px;">Rotating samples during staining</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:94px;width:216px;">Blade Breaker</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">10053-09</td>
			<td style="width:227px;">Used for holding feather blade</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">cover slips</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12548A</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic gloves</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>97008-198</td>
			<td style="width:227px;">protect hands from liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic tweezers</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>82027-432</td>
			<td style="width:227px;">Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">dewar flask-1900 mL</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td>5028M54</td>
			<td style="width:227px;">Hold liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Feather Blades</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72002-01</td>
			<td style="width:227px;">Scalpel Blades</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">Fine Forecps x 2</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11252-20</td>
			<td style="width:227px;">One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:216px;">FITC-conjugated anti HRP</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:161px;">123-545-021</td>
			<td style="width:227px;">Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">freezer box (Black)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14100F</td>
			<td style="width:227px;">Protects samples from light</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14637-010</td>
			<td style="width:227px;">Used to transfer samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">glass slides</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12550143</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">mounting media (vectashield) anti-fade</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">101098-042</td>
			<td style="width:227px;">Mounting media retains fluorescent signaling</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72180</td>
			<td style="width:227px;">Seals microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">PCN5000</td>
			<td style="width:227px;">Prevents non-specific binding of antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">paint brush</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-204</td>
			<td style="width:227px;">Transferring flies</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-010-023</td>
			<td style="width:227px;">Saline solution for dissecting and staining</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phalloidin 647</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td>AB176759</td>
			<td style="width:227px;">Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">plastic petri dish (100 mm)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">25373-100</td>
			<td style="width:227px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:216px;">reinforcement labels</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>AVE05722</td>
			<td style="width:227px;">Provides support for glass coverslip over the mounted tissue</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">sharpening block</td>
			<td style="width:121px;">Grainger</td>
			<td style="width:161px;">1RDF5</td>
			<td style="width:227px;">Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">slide folder</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">10126-326</td>
			<td style="width:227px;">Sample storage</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">standard office scissors</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>ACM40618</td>
			<td style="width:227px;">Cutting reinforcement labels</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">24236-10</td>
			<td style="width:227px;">Coating for dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">22140</td>
			<td style="width:227px;">Helps to permeabilize tissue</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Vannas Disssection Sissors</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">1500-00</td>
			<td style="width:227px;">Ued for removing fly legs and making an incision on thorax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration

Дрозофила служит полезной моделью для оценки синаптической структуры и функции, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Хотя большая работа была сосредоточена на нервно-мышечных соединений (NMJs) в личинках дрозофилы, оценки синаптической целостности у взрослых Drosophila получил гораздо меньше внимания. Здесь мы предоставляем простой метод для вскрытия спинных продольных мышц (DLMs), которые необходимы для полета способности. В дополнение к полету в качестве поведенческого считывания, это вскрытие позволяет как DLM синапсов и мышечной ткани, чтобы быть податренным для структурного анализа с использованием флуоресцентно помечены антитела для синаптических маркеров или белков, представляющих интерес. Этот протокол позволяет для оценки структурной целостности синапсов у взрослых Drosophila во время старения для моделирования прогрессивной, возрастной зависимости от большинства нейродегенеративных заболеваний.

Поколение трансгенных мух, выражаюющих человеческий tar-Binding Protein 43 kDa mutant (TDP-43M337V), представлено схемой(рисунок 1A). Это демонстрирует применение двоичной системы Gal4/UAS в Drosophila27. На иллюстрации изображен гемиторакс с шестью мышечными волокнами, A'u2012F переход от самого спинного волокна А к самому брюшной F (Рисунок 1B)11,12. Для оценки синаптической целостности, NMJs были окрашены HRP и фаллоидин(рисунок 1C'u2012E). Моторные нейроны в TDP-43M337V мутантов (Рисунок 1F) имеют практически нет HRP окрашивания на день 21, в то время как WT (Орегон-R) остается нетронутым (Рисунок 1C). Есть никаких видимых различий в окрашивание мышц(рисунок 1D,G). Изменения в валовой морфологии наблюдается в TDP-43M337V мутантов показывает, как синаптической целостности могут быть вовлечены в нейродегенеративных заболеваний модели бокового амиотрофического склероза (ALS) с помощью модели DLM взрослых. В дополнение к структурному окрашивания, окрашивание DLM NMJs может также обеспечить оценку синаптической целостности с пресинаптическими(рисунок 2A'u2012R) и после синаптических (Рисунок 2 S'u2012XS‒X) маркеров. Вместе эти результаты иллюстрируют, как этот протокол вскрытия может быть применен к изучению ткани DLM при нейродегенеративных заболеваниях.
Одним из ключевых аспектов этого вскрытия является применение жидкого азота для вспышки заморозить ткани, чтобы сделать бисекцию легче. Полезность жидкого азота продемонстрирована у мух WT с жидким азотом, где мышечная ткань не имеет повреждений или nicked волокон (рисунок 3A'u2012C).Figure 3 Без жидкого азота, ткань может быть более трудно вскрыть. Например, после этого протокола и пропуская жидкий азот флэш замораживания шаг позволяет ткани, чтобы быть более восприимчивыми к повреждению от вскрытия инструментов, таких как поврежденные нейроны (Рисунок 3D) или поврежденных мышечных волокон (Рисунок 3E). Применение жидкого азота помогает предотвратить повреждение тканей, которое может произойти при работе с тканью DLM независимо от генотипа образца(рисунок 3C и 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Рисунок 1: Прогрессивная денервация DLM синапсов в модели Drosophila ALS. (A)Поколение трансгенных мух ALS, выражаюх человеческую мутантную форму Tar-Binding Protein 43 kDa (TDP-43), показано в схеме. (B)Иллюстрация изображает форму и ориентацию гемиторакса у взрослого Дрозофилы. Используя протокол, мы можем наблюдать прогрессивную потерю синаптической целостности DLM NMJ синапсов через структурное окрашивание моторных нейронов с HRP (зеленый) и мышечной ткани с фаллоидином (пурпурный). Наша модель изображает потерю синаптической целостности во взрослой модели ALS через поколение взрослых мух, выражают мутанта из человека TDP-43M337V в моторных нейронах (Рисунок 1F'u2012H) по сравнению с WT (Рисунок 1C'u2012E) летит в мышечном волокне C. Стрелки выделить примеры Синапсе WT (Рисунок 1C) и пример потери синаптической целостности. Масштабная планка 20 мкм при увеличении в 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Рисунок 2: Оценка синаптической целостности с помощью пресинаптических маркеров у взрослых NMJ. Синаптическая целостность также может быть оценена с помощью пресинаптических и постсинаптических маркеров в WT мух, которые 14 дней в мышечных волокон С. Пресинаптические маркеры Synapsin(B), Синтаксин(H), и Bruchpilot (BRP)(N) являются совместно окрашенные с HRP (A, G, M). Окрашивание изображает локализацию этих маркеров на пресинаптических терминалах(C, I, O). При более высоком увеличении, изображения иллюстрируют локализацию Synapsin ( E ),Синтаксин(K), и BRP(q ) с HRP (D, J, и P) более подробно(рисунок F, L, и R). Мы также показываем постсинаптический маркер Glutamate Receptor III (GluRIII) (T) совместно окрашенные с HRP (S). Совместное окрашивание демонстрирует полезность этих маркеров (U). При более высоком увеличении репрезентативные изображения иллюстрируют локализацию(X) GluRIII (W )и HRP(V) к постсинаптической мышечной ткани и пресинаптических терминалов, соответственно. Масштабная планка для панелей A'u2012C, G-I, M'u2012O, S'u2012U представляет собой 20 мкм при увеличении в 63x. Шкала бар для панелей D'u2012F, 2J-2L, 2P-2R, и 2V-2X представляют собой 10 мкм при 63x увеличении. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Рисунок 3: Полезность жидкого азота для рассечений DLM. Чтобы продемонстрировать полезность жидкого азота для рассечений DLM, мы показываем сравнение 21-го дня ВТ мух с жидким азотом и без него из мышечного волокна С. С жидким азотом фаллоидин(B) остается нетронутым и не ставит под угрозу окрашивание HRP (A, C). Без жидкого азота, мышечная ткань становится тягучим и трудно раздектить (E) и HRP окрашивания (D, F) становится скомпрометирована из-за технической ошибки. Белые стрелки показывают область без повреждения мышц жидким азотом(В) и поврежденноймышечной тканью(E). Масштабная планка 20 мкм при увеличении в 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Цель этой процедуры состоит в том, чтобы вскрыть спинной продольной мышцы (DLM) ткани для оценки структурной целостности DLM нервно-мышечных соединений (NMJs) в моделях нейродегенеративных заболеваний с использованием Drosophila melanogaster.

Визуализация синаптической дегенерации у взрослых дрозофилы в ассоциации с нейродегенерацией

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Протокол обеспечивает простую модель оценки синаптической целостности в возрастной зависимости. Таким образом, мы можем изучать нейродегенеративные заболевания в тканях, которые подразделяются как структурным, так и функциональным анализом. Этот метод облегчает сохранение как нейронной, так и мышечной ткани от спинного продольного мышечного нервно-мышечного соединения.Для всестороннего исследования синаптической функции с течением времени и тканей, которые трудно работать. Этот метод может быть применен к изучению нейродегенеративных заболеваний, включая ALS, Паркинсона, Хантингтона и болезни Альцгеймера. Перед началом вскрытия вырезать примерно 10 миллиметров от кончика 200 микролитров пипетки.После введения анестезии, играть от шести до 10 мух в шесть сантиметров Петри блюдо, содержащее 70% этанола и использовать кисть краски, чтобы мягко глоток объединить каждую муху. После одной-двух минут, использовать типсы для передачи одной мухи на ноги или крылья в силиконовой еластомер покрытием рассечение блюдо, содержащее от семи до 10 миллилитров PBS под рассечением микроскопа. С мухой погружен в PBS, используйте тупой Dumont номер пять найти тибры, чтобы тщательно удалить крылья и использовать охватывают прямой край пружины вскрытия ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в брюшной стороне кутикулы, чтобы удалить ноги.Держа ножницы для вскрытия в одной руке и тупые миппы в другой, распойте вентралюю сторону мухи вверх и удерживая образец на месте с помощью типсов, удалите ножницами голову и живот. Используйте 200 микролитровую пипетку, установленную на 40 микролитров, и модифицированный наконечник пипетки для сбора торообразных и поместить образцы изолированных тканей в соответствующую помеченную трубку, содержащую 900 микролитров PBS и 150 микролитров 32% формальдегида. После 30 минут при комнатной температуре, используйте пастер пипетку, чтобы удалить фиксатор и промыть plies три раза с 1,5 миллилитров PBS за стирку.Перед началом раздвоения Дон Крио защитные перчатки и защитные стаканы и заполнить тур колбу с жидким азотом. Используйте выключатель лезвия, чтобы захватить перо лезвие под углом и согнуть лезвие, чтобы разорвать небольшой кусок. Используйте выключатель лезвия, чтобы заблокировать лезвие в положении и использовать стеклянную пипетку Pasteur, чтобы удалить все PBS из пробных труб.Используйте криогенные пинцеты, чтобы погрузить трубки в колбу жидкого азота. Через 10 секунд, используйте пастер пипетку, чтобы добавить около 300 микролитров ледяного PBS к каждой трубке на льду, и поместите один бедный топор брюшной стороны вверх в 10 сантиметров силиконовой елатомера покрытием рассечение блюдо, содержащее ледяной PBS. Используйте тупую пару типсов, чтобы распоставить грудную клетку и найти пару типсов, чтобы удалить некоторые из грудных ганглиев, чтобы разоблачить середину грудной клетки.Используя середину грудной клетки в качестве руководства, используйте игру, чтобы сделать мелкий разрез через одну треть грудной клетки и использовать тупые типсы для позиционирования грудной клетки под углом 45 градусов. Используйте лезвие, чтобы сократить прямо вниз по средней линии грудной клетки, чтобы получить два hemithoraces и тщательно сделать один или два разреза, чтобы удалить избыток ткани, не повреждая спинной продольных мышц. Затем поместите образцы мышечной ткани в соответствующую помеченную трубку PBS.Когда все образцы грудной клетки были разделены на две части, пронизывают ткани в блокируя буфер, по крайней мере один час при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации вихрь свежеприготовленный структурный раствор пятна и добавить 150 микролитров пятна в каждый образец в течение двух часов инкубации на ротатор при комнатной температуре в темноте. После окрашивания мыть образцы в PBST, и место пять этикетки подкрепления сложены и разрезать пополам 15 миллиметров друг от друга на одном стеклянном слайде микроскопа.Используйте модифицированный микро пипетки отзыв для передачи Thoraces на каждом слайде и использовать лабораторные салфетки для удаления каких-либо избыточных PBST. Используйте типсы, чтобы организовать образцы таким образом, что Thoraces сталкиваются мышцы вверх. Когда образцы правильно ориентированы использовать 200 микролитров пипетки отзыв применять 70 микролитров монтажной среды для каждого слайда и покрыть каждый слайд с крышкой скольжения.Затем используйте лак для ногтей, чтобы щедро покрыть внешние края крышки скользит, чтобы получить полную печать вокруг каждой ткани. Оценить синаптической целостности. Нейромышечные соединения могут быть окрашены пероксидазом хрена и Floe tin Motor нейронов в смолы связывания белка 43 Kilodalton mutans практически нет хрена пероксидазы окрашивания на день 21, в то время как белок дикого типа остается нетронутым.Видимых различий в окрашиваниях мышц не наблюдается. В дополнение к структурной окрашивания спинной продольной мышцы нервно-мышечной маркировки соединения может также обеспечить оценку синаптической целостности с предварительной синаптической и пост синаптических маркеров. Обратите внимание, что замораживание вспышки жидкого азота облегчает успешную бисекцию, так как не flash замороженные ткани более восприимчивы к повреждениям во время вскрытия.После этой процедуры образцы консервации могут быть проанализированы с помощью конфокальные микроскопии для измерения конкретных аспектов синаптической структуры.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Опорно-двигательного опробование, обучение и память Дефицит Drosophila Модели нейродегенерации

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Масса гистологии к Количественно нейродегенерации<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...