Name: visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 NS110727) till D.T.B.

1. Generation av transgena flugor
<ol><li>För att generera transgena flugor för detta experiment, samla OK371-Gal425 jungfruliga kvinnliga flugor och hanar av UAS-TDP-43M337V 26 (Figur 1A) genom att bedöva flugor med CO2 på en pad för att sortera.</li>
	<li>Sortera sövda flugor i injektionsflaska med standard Drosophila media för korset. Placera märkta injektionsflaska vid 25 °C för att nästa generation ska dyka upp. OBS: Rensa de vuxna från injektionsflaskan innan avkomman uppstår för att säkerställa rätt genotyp.</li>
	<li>När avkomman dyker upp, samla de transgena flugorna i injektionsflaska och sortera efter kön för att börja åldras för experimentella förhållanden.</li>
	<li>När flugor samlas, överför flugor till färsk mat var 2 dag tills flugorna är 21 dagar gamla.</li>
</ol>2. Dissekering prep
<ol><li>För att förbereda för dissektioner, erhålla rumstemperaturfosfatbuffrad koksaltlösning (1x PBS), en 10 cm dissektionsskål som är belagd med silikonelastomer, rak kant dissekera sax, en uppsättning av trubbiga dissekerings-forceps, en P200 pipetten och pipett tips, 2,0 mL microcentrifuge rör, standard kontor sax, 70% etanol, en 6 cm Petri-skålen, och 32% formaldehyd späds till 4% med 1x PBS.</li>
	<li>Etikettrör för varje genotyp eller tillstånd och tillsätt 900 μL av 1x PBS (rumstemp) och 150 μL av 32% formaldehyd till varje rör. Använd handskar och skyddsglasögon när du förbereder fixativet 4 % formaldehyd.</li>
	<li>Bedöva 6\u201210 flugor per grupp direkt från injektionsflaskan med CO2 och dränka flugor i en 6 cm Petriskål med 70% etanol. Tryck flyger ner i etanol med hjälp av en färgpensel för att säkerställa att exemplar är helt nedsänkt. Detta kommer att ta bort lagret av olja på den yttre nagelbanden.</li>
</ol>3. Bröstkorgens isolering och fixering
<ol><li>Innan varje preparat dissekeras, tillsätt ungefär 7\u201210 mL på 1x PBS till dissektionsskålen som är belagd med silikonelastomer. Denna volym bör säkerställa att vävnadsproverna är helt nedsänkta.</li>
	<li>Överför en fluga till dissektionsfatet från 70% etanol med hjälp av trubbiga tlysen och gripa tag antingen vingarna eller benen.</li>
	<li>Fokusera provet i dissektionsfatet under ett dissekerande mikroskop. Nästa dränka provet i 1x PBS, och försiktigt bort vingarna med hjälp av trubbiga Dumont #5 fina täntappar.</li>
	<li>Använda Vannas rak kant våren dissekering sax, ta bort benen genom att skapa ett litet snitt i den ventrala sidan av nagelbanden. I steg 3.8 kommer detta snitt att tillåta formaldehyden att penetrera vävnaden.</li>
	<li>Ta saxen i ena handen och håll tången i den andra för att placera den flug ventrala sidan uppåt. Medan du håller preparatet på plats med de trubbiga tedsarna, ta bort huvudet och buken med dissekeringssaxen.</li>
	<li>Överför den isolerade bröstkorgen med hjälp av den modifierade pipettspetsen i det märkta röret, från steg 3.2. OBS: Ställ pipetten på 40 μL för att undvika att extra 1x PBS tillsätts i fixativet.</li>
	<li>Upprepa steg 3.2\u20123.6 ovan för varje exemplar.</li>
	<li>Fix prover för 30 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort fix med hjälp av en Pasteur pipetten och kasta den i rätt avfall behållare under draghuven. Skölj prover tre gånger med 1,5 mL av 1x PBS vardera med hjälp av en Pasteur-pipett. Fyll i en fjärde sköljning med endast 750 μL och lämna vävnader i 1x PBS. OBS: I detta led kan vävnadsprover ligga kvar vid 4 °C i upp till 3 dagar innan de går vidare till nästa steg.</li>
</ol>4. Blixtfrysning och bröstkorg bisection
<ol><li>Innan bisections börjar, fyll en Dewar kolv med flytande kväve bär korrekt cryo-skyddande handskar och skyddsglasögon. Få en bladbrytare, fjäderblad, ett par fina pincett, is, iskall 1x PBS och kryogen pincett.</li>
	<li>Förbered en ishink för att hålla 1x PBS iskall.</li>
	<li>Använd bladbrytaren för att ta tag i fjäderbladet i en vinkel, och böj bladet för att bryta av en liten bit. Bladbrytaren kan sedan låsa bladet i läge för användning som en liten skalpell. OBS: Ett blad ska vara för alla grupper. Växla om blad går sönder eller blir slö.</li>
	<li>Lägg till en ren pipettspets till P200 och ta bort1/5 av spetsen för att transportera prover.</li>
	<li>Förbered ett nytt mikrocentrifugrör för varje grupp och tillsätt 200 μL på 1x PBS till varje rör. Denna andra röret kommer att användas för att samla den slutliga DLM preps.</li>
	<li>Ta bort alla 1x PBS från rör med hjälp av en Pasteur-pipett.</li>
	<li>Bär korrekt skyddsutrustning, dränka röret i vätskekvävkolven i 10 s med kryogen pincett. OBS: Rören bör stängas tätt för att hålla röret från att explodera.</li>
	<li>Ta ut röret från det flytande kvävet och tillsätt ungefär 300 μL iskall 1x PBS till proverna med en Pasteurpipett. Håll proverna på is.</li>
	<li>Tillsätt iskall 1x PBS till 10 cm dissektionsfaten som är belagd med silikonelastomer och dosera den första bröstkorgen med den modifierade 200 μL-pipetten.</li>
	<li>Placera bröstkorgen ventrala sidan upp. I ena handen använda en tråkig par tärna för att placera bröstkorgen och i den andra använda ett fint par tärna för att ta bort några av bröst ganglion att exponera mittlinjen av bröstkorgen.</li>
	<li>Använd bröstkorgens mittlinje som en guide för att göra ett grunt snitt genom 1/3rd av bröstkorgen med bladet.</li>
	<li>Ta bort bladet från bröstkorgen och placera bröstkorgen i 45° vinkel med de trubbiga töjningskrafterna. Sätt in bladet igen och skär rakt ner i bröstkorgens mittlinje. Detta kommer att resultera i två hemithoraces.</li>
	<li>Ta en hemithorax i taget och ta bort överskottet vävnad under DLM muskelfiber F (Figur 1B), den mest ventrala fiber. Använd bladet för att noggrant göra ett eller två skär för att avlägsna den överflödiga vävnaden utan att skada DLMs.</li>
	<li>När du har isolerat, överför hemithoraxen till rätt rör med 1x PBS.</li>
	<li>Upprepa steg 4.6\u20124.14 tills 10 dissekerade hemithoraces per grupp görs.</li>
</ol>5. Strukturell färgning
<ol><li>Efter att ha bisecting bröstkorgen proverna, placera vävnaden i blockerande buffert (1x PBS med 0,1% normal get serum, och 0,2% Triton X-100 vid pH 7.4) att permeabilisera vävnaden och förhindra icke-specifika färgning. Använd en Pasteur-pipett för att avlägsna överskott på 1x PBS och tillsätt 1,5 mL blockerande buffert till varje rör. Blockera vävnader i minst 1 h vid 4 °C.</li>
	<li>Förbered proverna för strukturell färgning med hjälp av en fluorescently konjugerad antikropp, pepparrotsperoxidas 488 (anti-HRP-488) vid en utspädning av 1:200 och Phalloidin-647 vid en utspädning av 1:1000 i blockerande buffert för att fläcka motoriska nervceller och muskelvävnad, respektive. Gör tillräckligt med fläck för att ha 150 μL per rör. Förvara fläcken vid 4 °C täckt i folie eller i en mörk låda tills den är klar för färgning.</li>
	<li>Efter blockering, ta bort överskottet blockerande buffert med ett glas Pasteur pipett.</li>
	<li>Innan du doserar den strukturella fläcken, vortexa fläcken. Tillsätt 150 μL av fläcken till varje rör. Placera proverna i en mörk låda på rotatorn i rumstemperatur i 2 h.</li>
	<li>Ta bort fläcken och tvätta vävnaderna fyra gånger i 1,5 mL rumstemp 1x PBS med 0,3% Triton X-100 i 5 min på rotatorn i en mörk låda. Proverna är nu klara att monteras på en glidbana.</li>
</ol>6. Montering av vävnad
<ol><li>Efter tvättprov i PBST, förbereda ett mikroskop glida för att montera vävnad för färgning. Förbered ytterligare tillförsel inklusive glass täcker snedsteg, en P200 pipett, 200 μL pipettspetsar, sax, klara förstärkningar, rak kant-tång, anti-fade fluorescerande monteringsmedia, nagellack, och en mörk låda för att täcka glidbanorna.</li>
	<li>Märk bilden för att identifiera proverna och rengör bilden med kimwipes för att säkerställa att det inte finns några fläckar.</li>
	<li>För att säkerställa att hemithoraxproverna inte skadas av täckslien, bygg en "bro" med hjälp av förstärkningsetiketter. Ta en förstärkningsetikett, skär den i hälften, och placera varje halv ungefär 15 mm från varandra. Detta avstånd måste vara mindre än täcksliltets bredd. Upprepa det här steget fyra gånger för att slutföra en "bro" som är 5 etiketter hög.</li>
	<li>Ta P200-pipetten och modifiera en spets genom att skära av1/5 av spetsen för att överföra proverna till bilden. Prover bör överföras på glid i mitten av bron.</li>
	<li>Ta kanten av ett labb torka och ta bort eventuella överskott PBST. Med hjälp av tåtor, ordna DLMs så att alla prover är inför muskel sida upp och nagelband sidan ner.</li>
	<li>Använd en vanlig P200-pipettspets, applicera 70 μL monteringsmedia på objektglaset, undvik luftbubblor. Dispensera media i ett cirkulärt mönster inuti förstärkningarna med början från utsidan in i mitten.</li>
	<li>Placera en täckslire över förstärkningarna.</li>
	<li>Använd nagellack för att belägga ytterkanterna runt omkretsen av täckskydd. Applicera generöst för att bilda en fullständig tätning av vävnaden.</li>
	<li>Placera bilden på en plan yta i mörker, så att minst 10 min att torka och förhindra foto-blekning eller förlust av fluorescens. Nu kan bilder användas för bildtagning omedelbart, eller på annat sätt lagras i en diamapp vid -20 °C för senare visning.</li>
</ol>7. Alternativ: Färgning med primära antikroppar
OBS: Denna sektion är valfri och bör användas direkt mellan avsnitt 4 och 5 om så önskas.
<ol><li>För att fläcka vävnad med primära antikroppar, dränka vävnad i blockerande buffert i minst 1 h.</li>
	<li>Bered primär antikropp med korrekt utspädning i blockerande buffert. Åtminstone förbereda tillräckligt antikroppsblandning för att ha 150 μL per grupp. Observera att proverna hålls stilla. Förvaras i 4 °C tills den är klar för användning.</li>
	<li>Avlägsna överflödig blockerande buffert med en Pasteur-pipett. Kort virvel den primära antikroppen och tillsätt 150 μL av antikroppsblandning till varje grupp och placera prover vid 4 °C över natten.</li>
	<li>Nästa dag, ta bort primär antikropp och tvätta vävnad 4 gånger med PBST i 5 min vardera på en rotator.</li>
	<li>Förbered sekundär fläck i blockerande buffert. Lägg till den sekundära fläcken på provet och håll den sedan en rumstemperatur i 2 h i en mörk låda på rotatorn. OBS: Den sekundära färgningen kan även inkludera HRP och phalloidin.</li>
	<li>Efter inkubationen på 2 h, för att avlägsna den sekundära fläcktvättvävnaden 4 gånger i 5 min med PBST och fortsätta till montering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+failure:+focus+in+an+integrative+view+of+ALS.">Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS.</a> Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).</li><li>Lodato, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+neurodegeneration+are+associated+with+increased+mutations+in+single+human+neurons.">Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons.</a> Science. 359, 555-559 (2018).</li><li>L&#243;pez-Erauskin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-linked+mutation+in+FUS+suppresses+intra-axonal+protein+synthesis+and+drives+disease+without+nuclear+loss-of-function+of+FUS.">ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS.</a> Neuron. 100, 816-830 (2018).</li><li>Munsie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-dependent+neurotransmitter+receptor+trafficking+to+synapses+is+altered+by+the+Parkinson's+disease+VPS35+mutation+p.+D620N.">Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N.</a> Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-transgenic+model+of+Alzheimer's+disease+with+plaques+and+tangles:+intracellular+A&#946;+and+synaptic+dysfunction.">Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular A&#946; and synaptic dysfunction.</a> Neuron. 39, 409-421 (2003).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+is+a+synaptic+failure.">Alzheimer's disease is a synaptic failure.</a> Science. 298, 789-791 (2002).</li><li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).</li><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+indirect+flight+muscle+innervation+in+Drosophila+melanogaster.">The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 118, 215-227 (1993).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-muscle+interactions+during+flight+muscle+development+in+Drosophila.">Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila.</a> Development. 125, 1769-1779 (1998).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pruning+of+motor+neuron+branches+establishes+the+DLM+innervation+pattern+in+Drosophila.">Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Fas+II+in+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+during+pruning+in+Drosophila.">A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila.</a> Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).</li><li>Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+synapse+model+in+Drosophila.">A tripartite synapse model in Drosophila.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Hunt, L. C., Demontis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunostaining+of+Drosophila+skeletal+muscle.">Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle.</a> Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles.">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6, 184-196 (2013).</li><li>Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elevation+of+sphingosine+1-phosphate+suppresses+dystrophic+muscle+phenotypes+in+Drosophila.">Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila.</a> Development. 140, 136-146 (2013).</li><li>Schnorrer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+of+muscle+morphogenesis+and+function+in+Drosophila.">Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila.</a> Nature. 464, 287-291 (2010).</li><li>Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudo-acetylation+of+K326+and+K328+of+actin+disrupts+Drosophila+melanogaster+indirect+flight+muscle+structure+and+performance.">Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance.</a> Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).</li><li>Hebbar, S., Fernandes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+remodeling+during+metamorphosis+influences+the+stabilization+of+motor+neuron+branches+in+Drosophila.">Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila.</a> Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).</li><li>Ritson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mediates+degeneration+in+a+novel+Drosophila+model+of+disease+caused+by+mutations+in+VCP/p97.">TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Klagges, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+synapsins:+a+single+gene+codes+for+several+isoforms+in+Drosophila.">Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release.">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).</li><li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS.">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002 (2018).</li><li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li><li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation.">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li><li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight.">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Med hjälp av de metoder som beskrivs i detta protokoll, ger vi en okomplicerad metod för dissektion av DLM vävnaden och visa hur detta kan tillämpas för att bedöma synaptisk integritet genom strukturella färgning och synaptiska markörer i vuxna Drosophila. Ett kritiskt steg i protokollet som gör DLM-vävnaden lättare att dissekera är blixtfrysningen med flytande kväve. Utan detta steg är vävnaden mindre fast och svårare att skära just på det sätt som observerats i figur 3. Detta protokoll bygger på tidigare dissektion metoder för att möjliggöra bevarandet av både motoriska nervceller och muskelvävnad18,19,20,21,22,23. En begränsning av detta protokoll är att när man gör den skära ner mittlinjen för bisection, kan det vara svårt att få två rena preps per bröstkorg. Ett sätt att säkerställa minst en hemithorax per fluga, kan du avsiktligt skära av till ena sidan av bröstkorgen för att få en ren prep. Med denna modifiering kan man också behöva ta bort ytterligare överflödig vävnad från snittet för att rensa upp provet med bladbrytaren. För dem som är nya i denna teknik, med fortsatt praxis, kommer noggrannheten i bisection öka.
Den metod som beskrivs här gör det möjligt för forskare att enkelt bedöma strukturell integritet vuxna DLM NMJs när som helst under hela deras livslängd. En stor fördel med detta protokoll är möjligheten att komma åt synaptic integritet i neurodegenerativa sjukdomsmodeller genom att använda synaptiska markörer. Vi visar att denna ansökan kan hjälpa visualisera förändringar i brutto morfologi med strukturell färgning (Figur 1C\u2012H). Dessutom kan synaptisk integritet bedömas med färgning av presynaptiska markörer inklusive men inte begränsat till Synapsin28 (Bild 2A\u2012F), Syntaxin29 (Bild 2G\u2012L) och BRP30 (Bild 2M\u2012R). Den postynaptiska muskelvävnaden kan också bedömas med hjälp av glutamatreceptor III-subenhetens antikropp31 (Figur 2S\u2012X), som visar nyttan av detta protokoll.
Forskare kan också utnyttja denna dissekeringsmetod för att komplettera funktionella data för att omfattande undersöka den strukturella integriteten hos synapser i samband med en mängd olika sjukdomar. Dessa synapser möjliggör också för funktionell analys genom elektrofysiologiskainspelningar 32,33,34 och flyganalysen10. Detta protokoll kan också ge enkel tillgång till vävnaden för många tillämpningar och analyser. Framtida studier, till exempel, skulle kunna använda detta protokoll för att kvantifiera synaptiska förändringar genom kvantifiering av densiteten och antalet synapser15,16. Medan protokollet beskrivs här undersöker specifikt synaptisk integritet motoriska nervceller, kompletterande protokoll för bedömning av muskel cellförlust kan också utföras med denna dissekering med hjälp av TUNEL färgning35. För att undersöka neuronal förlust, dissekering av bröst ganglion36 kunde också användas med TUNEL färgning. Vi förväntar oss att dissekering som beskrivs här kommer att ha fler ansökningar till framtida studier bedöma åldersrelaterade patologier samt neurodegenerativa sjukdomar.

Synaptic dysfunktion är bland de tidigaste kända kännetecken för de flesta större neurodegenerativa sjukdomar1,2,3,4,5,6. Dock är mycket lite känt när det gäller hur dessa strukturella och funktionella nedskrivningar relatera till senare stadier av sjukdomsprogression. Drosophila har visat sig vara ett användbart modellsystem för att förstå synapstillväxt och utveckling med hjälp av larv-NMJs7,8,9. Den tredje larven instar-stadiet varar dock bara några dagar, vilket begränsar deras nytta i att studera progressiv, åldersberoende neurodegeneration. Ett alternativ till att bedöma larv-NMJs är att undersöka synaptiska strukturer hos vuxna Drosophila, såsom de synapser som bildas på dorsala longitudinella muskler (DLMs) som krävs för flygning10,11,12,13,14,15,16. Dessa trepartssynapser är strukturellt organiserade på ett liknande sätt som däggdjurssynapser17, vilket ger en unik fördel för att bedöma modeller av neurodegenerativa sjukdomar.
Här beskriver vi en okomplicerad metod för att analysera den strukturella integriteten hos vuxna NMJs i en Drosophila modell av neurodegeneration. Tidigare DLM dissekering metoder och studier har betonat vikten av att bevara muskelvävnad för en mängd olika tillämpningar18,19,20,21,22,23. Vårt protokoll ger en omfattande metod för att bevara både neuronal och muskelvävnad för att undersöka neurodegenerativa sjukdomar. En annan viktig komponent i att studera dessa sjukdomar är förmågan att förstå neuronal förlust i en ålder beroende sätt. Tidigare arbete ger en kritisk och djupgående förståelse för hur DLM NMJs bildas under metamorfos i tidig vuxenålder 11,12,14,15,16,24. Vårt protokoll fastställer en metod för att bygga vidare på detta arbete för att undersöka DLM NMJs på ett åldersberoende sätt i åldrande och neurodegenerativa sjukdomar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="724">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">32% Formaldehyde</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">15714</td>
			<td style="width:227px;">Tissue preservation</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti mouse</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11031</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">Alexa Fluor 568 goat anti rabbit</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A11036</td>
			<td style="width:227px;">Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">anti- Bruchpilot (BRP) antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>NC82</td>
			<td style="width:227px;">Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:216px;">anti-GluRIII antibody</td>
			<td style="width:121px;">Gift from Aaron DiAntonio</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:227px;">Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">anti-Synapsin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">3C11</td>
			<td style="width:227px;">Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">anti-Syntaxin antibody</td>
			<td style="width:121px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:161px;">8C3</td>
			<td style="width:227px;">labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">BenchRocker</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">31-302</td>
			<td style="width:227px;">Rotating samples during staining</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:94px;width:216px;">Blade Breaker</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">10053-09</td>
			<td style="width:227px;">Used for holding feather blade</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">cover slips</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12548A</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic gloves</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>97008-198</td>
			<td style="width:227px;">protect hands from liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">cryogenic tweezers</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td>82027-432</td>
			<td style="width:227px;">Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">dewar flask-1900 mL</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td>5028M54</td>
			<td style="width:227px;">Hold liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Feather Blades</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72002-01</td>
			<td style="width:227px;">Scalpel Blades</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">Fine Forecps x 2</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11252-20</td>
			<td style="width:227px;">One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:216px;">FITC-conjugated anti HRP</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:161px;">123-545-021</td>
			<td style="width:227px;">Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">freezer box (Black)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14100F</td>
			<td style="width:227px;">Protects samples from light</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14637-010</td>
			<td style="width:227px;">Used to transfer samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">glass slides</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12550143</td>
			<td style="width:227px;">For mounting tissue</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:216px;">mounting media (vectashield) anti-fade</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">101098-042</td>
			<td style="width:227px;">Mounting media retains fluorescent signaling</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">72180</td>
			<td style="width:227px;">Seals microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">PCN5000</td>
			<td style="width:227px;">Prevents non-specific binding of antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">paint brush</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-204</td>
			<td style="width:227px;">Transferring flies</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-010-023</td>
			<td style="width:227px;">Saline solution for dissecting and staining</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phalloidin 647</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td>AB176759</td>
			<td style="width:227px;">Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">plastic petri dish (100 mm)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">25373-100</td>
			<td style="width:227px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:216px;">reinforcement labels</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>AVE05722</td>
			<td style="width:227px;">Provides support for glass coverslip over the mounted tissue</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">sharpening block</td>
			<td style="width:121px;">Grainger</td>
			<td style="width:161px;">1RDF5</td>
			<td style="width:227px;">Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">slide folder</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">10126-326</td>
			<td style="width:227px;">Sample storage</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">standard office scissors</td>
			<td style="width:121px;">W.B. Mason</td>
			<td>ACM40618</td>
			<td style="width:227px;">Cutting reinforcement labels</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">24236-10</td>
			<td style="width:227px;">Coating for dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">22140</td>
			<td style="width:227px;">Helps to permeabilize tissue</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:216px;">Vannas Disssection Sissors</td>
			<td style="width:121px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">1500-00</td>
			<td style="width:227px;">Ued for removing fly legs and making an incision on thorax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing synaptic degeneration in adult drosophila in association with neurodegeneration

Drosophila fungerar som en användbar modell för att bedöma synaptisk struktur och funktion i samband med neurodegenerativa sjukdomar. Medan mycket arbete har fokuserat på neuromuskulära korsningar (NMJs) i Drosophila larver, bedöma synaptisk integritet hos vuxna Drosophila har fått mycket mindre uppmärksamhet. Här ger vi en okomplicerad metod för dissektion av dorsala longitudinella muskler (DLMs), som krävs för flygförmåga. Förutom flygning som en beteendemässiga avläsning, möjliggör denna dissekering för både DLM synapser och muskelvävnad att vara mottagliga för strukturell analys med hjälp av fluorescently märkt antikroppar för synaptiska markörer eller proteiner av intresse. Detta protokoll möjliggör utvärdering av strukturella integriteten hos synapser i vuxna Drosophila under åldrandet att modellera den progressiva, åldersberoende karaktär mest neurodegenerativa sjukdomar.

Genereringen av transgena flugor som uttrycker humant Tar-Binding Protein på 43 kDa mutant (TDP-43M337V) representeras av det schematiska (Figur 1A). Detta visar tillämpningen av det binära Gal4/UAS-systemet i Drosophila27. Illustrationen föreställer en hemithorax med sex muskelfibrer, A\u2012F som går från den mest dorsala fibern A till den mest ventrala F (Bild 1B)11,12. För att bedöma synaptisk integritet, var NMJs färgas med HRP och Phalloidin (Bild 1C\u2012E). Motoriska nervceller i TDP-43M337V mutanter (Figur 1F) har liten till ingen HRP färgning av Dag 21, medan WT (Oregon-R) förblir intakt (Figur 1C). Det finns inga synliga skillnader i muskelfärgning (Figur 1D,G). Förändringarna i brutto morfologi observerats i TDP-43M337V mutanter visar hur synaptic integritet kan vara inblandad i en neurodegenerativa sjukdom modell av amyotrofisk laterala skleros (ALS) med hjälp av den vuxna DLM modell. Förutom strukturell färgning kan färgning av DLM NMJs också ge en bedömning av synaptisk integritet med presynaptic (Bild 2A\u2012R) och post synaptic (Figur 2S\u2012X) markörer. Tillsammans illustrerar dessa resultat hur detta dissekeringsprotokoll skulle kunna tillämpas på att studera DLM-vävnad i neurodegenerativa sjukdomar.
En viktig aspekt av denna dissekering är tillämpningen av flytande kväve för att blinka frysa vävnaden för att göra bisekt lättare. Nyttan av det flytande kvävet demonstreras i WT-flugor med flytande kväve där muskelvävnad inte har någon skada eller snodd fibrer (Figur 3A\u2012C). Utan flytande kväve kan vävnaden vara svårare att dissekera. Till exempel, efter detta protokoll och hoppa över den flytande kväveblixten frysning steg gör att vävnaden att vara mer mottagliga för skador från dissekeringsverktyg såsom skadade nervceller (Figur 3D) eller skadade muskelfibrer (Figur 3E). Appliceringen av flytande kväve bidrar till att förhindra vävnadsskador som skulle kunna uppstå vid arbete med DLM-vävnad oavsett preparatets genotyp (Figur 3C och 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figur 1: Progressiv denervation av DLM-synapser i en Drosophila-modell av ALS. (A) Den generation av ALS-transgena flugor som uttrycker en human mutantform av Tar-Binding Protein på 43 kDa (TDP-43) visas i det schematiska. (B) Illustrationen skildrar formen och orienteringen av en hemithorax hos en vuxen Drosophila. Med hjälp av protokollet, kan vi observera den progressiva förlusten av synaptisk integritet DLM NMJ synapser genom strukturella färgning av motor nervceller med HRP (grön) och muskelvävnad med Phalloidin (magenta). Vår modell skildrar förlusten av synaptisk integritet i en vuxen modell av ALS genom generering av vuxna flugor som uttrycker en mutant från av mänskliga TDP-43M337V i motoriska nervceller (Figur 1F\u2012H) i jämförelse med WT (Figur 1C\u2012E) flugor i muskelfiber C. Pilar markera exempel på en WT synapse (Figur 1C) och ett exempel på förlust av synaptisk integritet. Skala bar =20 μm vid 63x förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Bild 2: Bedömning av synaptisk integritet med hjälp av presynaptiska markörer vid vuxna NMJs. Synaptic integritet kan också bedömas med hjälp av presynaptiska och postsynaptiska markörer i WT flugor som är 14 dagar gamla i muskel fiber C. De presynaptiska markörerna Synapsin (B), Syntaxin (H), och Bruchpilot (BRP) (N) samfärgas med HRP (A, G, M). Färgningen föreställer lokaliseringen av dessa markörer till de presynaptiska terminalerna (C, I, O). Vid högre förstoring illustrerar bilderna lokaliseringen av Synapsin (E), Syntaxin (K) och BRP (Q) med HRP (D, J, och P) mer detaljerat (Bild F, Loch R). Vi visar också en postsynaptic markör Glutamat Receptor III (GluRIII) (T) co-färgade med HRP (S). Den co-färgning visar nyttan av dessa markörer (U). Vid högre förstoring exemplifierar de representativa bilderna lokaliseringen (X) av GluRIII (W) och HRP (V) till den postsynaptiska muskelvävnaden respektive de presynaptiska terminalerna. Skala bar för panelerna A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U representerar 20 μm vid 63x förstoring. Skalstång för panelerna D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R och 2V-2X representerar 10 μm vid 63x förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Bild 3: Nyttomedel för flytande kväve för DLM-dissektioner. För att visa nyttan av flytande kväve för DLM dissektioner, visar vi en jämförelse av dag 21 WT flugor med och utan flytande kväve från muskelfiber C. Med flytande kväve förblir Phalloidin (B) intakt och äventyrar inte HRP-färgningen (A, C). Utan flytande kväve blir muskelvävnaden trådig och svår att bisekta (E) och HRP-färgning (D, F) blir äventyras på grund av tekniskt fel. Vita pilar visar ett område med inga muskelskador i med flytande kväve (B) och skadad muskelvävnad (E). Skala bar = 20 μm vid 63x förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration at JoVE.com

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Målet med detta förfarande är att dissekera den dorsala längsmuskeln (DLM) vävnad för att bedöma den strukturella integriteten av DLM neuromuskulära korsningar (NMJs) i neurodegenerativa sjukdomsmodeller använder Drosophila melanogaster.

Visualisera Synaptic Degeneration i Adult Drosophila i samband med Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Ett protokoll ger en okomplicerad modell för att bedöma synaptisk integritet på ett åldersberoende sätt. Så vi kan studera neurodegenerativa sjukdomar i vävnader som är mottagliga för både strukturell och funktionell analys. Denna teknik underlättar bevarandet av både neuronala och muskel vävnad från den dorsala längsgående muskeln neuromuskulära korsningar.Att omfattande undersöka synaptisk funktion över tid och vävnader som är svåra att arbeta med. Denna metod kan tillämpas på studiet av neurodegenerativa sjukdomar inklusive ALS, Parkinsons, Huntingtons och Alzheimers sjukdom. Innan du börjar dissekering skära cirka 10 millimeter från spetsen på en 200 microliter pipett.Efter att ha administrerat anestesi, spela sex till 10 flugor i en sex centimeter Petri-skålen som innehåller 70%etanol och använd en pensel för att försiktigt smutta samman varje fluga. Efter en till två minuter, använd tuppar för att överföra en fluga med benen eller vingarna till en silikon elastomer belagda dissekeringsfat som innehåller sju till 10 milliliter PBS under en dissekera mikroskop. Med flugan nedsänkt i PBS, använd trubbig Dumont nummer fem hitta tång för att försiktigt ta bort vingarna och använda spänner en rak kant våren dissekering sax för att göra ett litet snitt i den ventrala sidan av nagelbanden för att ta bort benen.Håll dissekeringssaxen i ena handen och trubbiga tång i den andra, placera den flugskrammarsida uppåt och håll preparatet på plats med tången, ta bort huvud och buk med saxen. Använd en 200 mikroliterpipett inställd på 40 mikroliter och den modifierade pipettspetsen för att samla in bröstkorgarna och placera de isolerade vävnadsproverna i ett lämpligt märkt rör som innehåller 900 mikroliter pbs och 150 mikroliter på 32%formaldehyd. Efter 30 minuter i rumstemperatur, använd en Pasteur pipetter för att ta bort fixativet och skölja pliesna tre gånger med 1,5 milliliter PBS per tvätt.Innan bisections Don cryo skyddshandskar och skyddsglasögon påbörjas och fyll en turkolv med flytande kväve. Använd en bladbrytare för att ta tag i ett fjäderblad i en vinkel och böj bladet för att bryta av en liten bit. Använd bladbrytaren för att låsa bladet i position och använd en pasteurpipett av glas för att ta bort alla PBS från provrören.Använd kryogen pincett för att dränka rören i kolven med flytande kväve. Efter 10 sekunder, använd en Pasteur pipetter för att lägga till cirka 300 mikroliter iskall PBS till varje rör på is, och placera en dålig Axe ventrala sida upp i en 10 centimeter silikon elastomer belagda dissektion skålen innehåller iskall PBS. Använd en tråkig par tyns för att placera bröstkorgen och att hitta par tyns, för att ta bort några av bröst ganglier att exponera mittlinjen i bröstkorgen.Använd bröstkorgens mittlinje som en guide, använd pjäsen för att göra ett grunt snitt genom en tredjedel av bröstkorgen och använd de trubbiga tylinterna för att placera bröstkorgen i 45 graders vinkel. Använd bladet för att skära rakt ner i bröstkorgens mittlinje för att få två hemithoraces och för att försiktigt göra en eller två nedskärningar för att avlägsna den överflödiga vävnaden utan att skada ryggmuskeln längsgående muskler. Placera sedan muskelvävnadsproverna i ett lämpligt märkt rör av PBS.När alla bröstkorgsprover har genommeemabilisera vävnaderna i blockerande buffert i minst en timme vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, virvel nyberedda strukturell fläcklösning och tillsätt 150 mikroliter av fläcken till varje prov för en två timmars inkubation på en rotator vid rumstemperatur i mörker. Efter färgning tvätta proverna i PBST, och placera fem förstärkningsetiketter staplade och skär i halv 15 millimeter isär på ett glas mikroskop bild.Använd en modifierad mikropipettsspets för att överföra Thoraces på varje objektglas och använd en laboratoriumisk torka för att ta bort eventuellt överskott av PBST. Använd forceps för att ordna proverna så att Thoraces är vänd muskel sida upp. När proverna är korrekt orienterade använda en 200 microliter pipett spets för att tillämpa 70 mikroliter av monteringsmedium till varje bild och täcka varje objektglas med en cover slip.Använd sedan nagellack för att generöst belägga täcklockets ytterkanter för att få en komplett tätning runt varje vävnad. För att bedöma den synaptiska integriteten. Neuromuskulära korsningar kan färgas med pepparrotsperoxidas och Floe tenn Motor nervceller i tar bindande protein av 43 Kilodalton mutans har liten eller ingen pepparrot peroxidas färgning av dag 21, medan den vilda typen protein förblir intakt.Inga synliga skillnader i muskelfärgning observeras. Förutom strukturella färgning dorsala längsgående muskel neuromuskulära korsningen märkning kan också ge en bedömning av synaptisk integritet med pre synaptic och post synaptic markörer. Observera att flytande kväve flash frysning underlättar en lyckad bisekt som icke flash fryst vävnad är mer mottagliga för skador under dissekering.Efter detta förfarande bevara prover kan analyseras genom confocal mikroskopi att mäta en specifik aspekter av synaptiska struktur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualisering av Synaptic Blåsor Inom Drosophila Larvernas segment Axoner

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Testmetoder motoriskt, inlärning och minne Brister i Drosophila Modeller för neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Mass histologi att kvantifiera neurodegeneration i<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...