Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Generelt: Forfatterne vil gerne takke efterforskerne af Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) for deres elskværdige støtte og rådgivning.
Finansiering: Støtten til dette arbejde blev ydet af NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under prisnummer U2CDK114886.
Data- og materialetilgængelighed: Data arkiveres i Gene Expression Omnibus (GEO # verserende)

Undersøgelsen blev godkendt til brug af Institutional Review Board (IRB) på Indiana University.
BEMÆRK: Brug denne protokol med nyrenephrectomy væv (op til 2 cm i både X- og Y-dimensionerne), der er bevaret i den optimale skæretemperaturforbindelse (OLT) og opbevaret ved -80 °C. Udfør alt arbejde på en måde, der begrænser RNA-forurening, brug rene engangshandsker og en ansigtsmaske. Sørg for renligheden af alle overflader. Det udstyr, som denne protokol blev optimeret til, er et l...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

LMD-baserede transskriptionsprodukter er en nyttig teknologi, der forankrer genekspression til specifikke områder i vævet. Grundlaget for denne teknologi og dens potentielle anvendelse i nyrerne er blevet beskrevet tidligere8. Optimering, modernisering og strømlining af fluorescensbaseret dissektion, der specifikt er rettet mod høj nøjagtighedsdissektion for downstream-RNA-sekventering, er imidlertid mindre allestedsnærværende. Fordi denne metode er rumligt funderet i vævet, det har potent...

Teknologiske fremskridt i studiet af vævsprøver har forbedret forståelsen af sundhedstilstanden og sygdommen i forskellige organer. Sådanne fremskridt har understreget, at patologi kan starte i begrænsede regioner eller i specifikke celletyper, men har vigtige konsekvenser for hele organet. Derfor er det i den nuværende æra af personlig medicin vigtigt at forstå biologien på både celle- og regionalt niveau og ikke kun globalt1. Dette gælder især i nyrerne, som består af forskellige specialiserede celler og strukturer, der differentieret indleder og / eller reagerer på patologisk stress. Patogenese af forskellige typer af menneskelig nyresygdom er stadig ikke godt forstået. Generering af en metode til undersøgelse af ændringer i genekspression i specifikke rørformede segmenter, strukturer eller områder af interstitium i den menneskelige nyre vil forbedre evnen til at afdække regionen specifikke ændringer, der kan informere om sygdomspatogenese.
Human nyre biopsi prøver er en begrænset og kostbar ressource. Derfor bør teknologier, der afhører transcriptomics i nyrevæv, optimeres til at spare væv. De tilgængelige metoder til at studere transcriptomics på celle- og regionalt plan omfatter enkeltcellet RNA-sekventering (scRNaseq), enkelt nuklear RNaseq (snRNaseq), in situ rumlig hybridisering og lasermikrodissement (LMD). Sidstnævnte er velegnet til præcis isolering af regioner eller strukturer af interesse inden for vævssektioner , til downstream-RNA-sekventering og analyse2,3,4,5. LMD kan anvendes til at basere sig på identifikation af specifikke celletyper eller strukturer baseret på validerede markører ved hjælp af fluorescensbaseret billeddannelse under dissektion.
De unikke træk ved lasermikrodissection assisteret regional transskription omfatter: 1) bevarelse af den rumlige kontekst af celler og strukturer, som supplerer enkeltcelleteknologier, hvor celler identificeres ved udtryk snarere end histologisk; 2) teknologien informerer og informeres af andre billeddannelsesteknologier, fordi en antistofmarkør definerer udtrykssignaturer 3) evnen til at identificere strukturer, selv når markører ændrer sig i sygdom; 4) påvisning af lavt udtrykte udskrifter i ca. 20.000 gener; og 5) bemærkelsesværdig vævsøkonomi. Teknologien er skalerbar for en nyrebiopsi med mindre end 100 μm tykkelse af en kerne, der er nødvendig for tilstrækkelig RNA-erhvervelse og muliggør brug af arkiveret frosset væv, som er almindeligt tilgængelige i store depoter eller akademiske centre6.
I det efterfølgende arbejde beskriver vi den regionale og bulk transcriptomics teknologi i detaljer, optimeret med en ny hurtig fluorescens farvning protokol til brug med humant nyrevæv. Denne tilgang forbedrer klassiske LMD-udforskninger, fordi den giver separate udtryksdata for interstitium- og nephron-undersegmenterne i modsætning til det samlede tubulointerstitial-udtryk. Herunder hører de kvalitetssikrings- og kontrolforanstaltninger, der er gennemført for at sikre stringens og reproducerbarhed. Protokollen muliggør visualisering af celler og interesseregioner, hvilket resulterer i tilfredsstillende erhvervelse af RNA fra disse isolerede områder for at muliggøre downstream RNA-sekventering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Genekspressionsanalyse af humant nyrevæv er et vigtigt redskab til at forstå homøostase og sygdomspatofysiologi. Det er nødvendigt at øge opløsningen og dybden af denne teknologi og udvide den til niveauet af celler i vævet. Selv om brugen af enkelt nuklear og enkelt celle RNA sekventering er blevet udbredt, udtrykket underskrifter af celler opnået fra væv dissociation ikke opretholde rumlige sammenhæng. Lasermikrobiagesektion (LMD) baseret på specifikke fluorescerende markører ville gøre det muligt at isolere specifikke strukturer og cellegrupper af interesse med kendt lokalisering, hvilket ville gøre det muligt at erhverve rumligt forankrede transskriptionssignaturer i nyrevæv. Vi har optimeret en LMD-metode, styret af en hurtig fluorescensbaseret plet, til at isolere fem forskellige rum i den menneskelige nyre og udføre efterfølgende RNA-sekventering fra værdifulde humane nyrevævsprøver. Vi præsenterer også kvalitetskontrolparametre, der gør det muligt at vurdere tilstrækkeligheden af de indsamlede prøver. Den arbejdsgang, der er skitseret i dette manuskript, viser gennemførligheden af denne tilgang til at isolere subsegmentale transskriptionssignaturer med høj tillid. Den metodologiske fremgangsmåde, der præsenteres her, kan også anvendes på andre vævstyper med substitution af relevante antistofmarkører.

Prøver
Vi præsenterer data fra ni referencenephrectomies (3 prøver opnået på Indiana University og 6 prøver opnået gennem Kidney Precision Medicine Project), ved hjælp af den hurtige fluorescens farvning protokol til at isolere nyre nephron segmenter og interstitielle områder. De sektioner, der anvendes i denne proces blev opnået fra afdøde nyredonorer eller upåvirket tumor nephrectomies. Disse prøver havde ikke patologiske tegn på sygdom som visualiseret i H&E-p...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Vi beskriver en protokol for laser mikrodissementering af undersegmenter af den menneskelige nyre, herunder glomerulus, proksimal tubule, tykt stigende lem, opsamlingskanal og interstitium. RNA'et isoleres derefter fra de opnåede rum, og der udføres RNA-sekventering for at bestemme ændringer i transskriptionssignaturen inden for hvert undersegment.

Anvendelse af Laser Microdissection at afdække regionale Transcriptomics i Human Nyre Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Mus isoleret perfunderet Nyre Teknik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser fange Microdissection af yderst rene trabekelværket fra mus øjne for gen Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En laser Capture Micro Dissection protokol, der giver høj kvalitet RNA fra fersk-frosne mus knogler

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Laser-Capture Microdissection RNA-sekventering for rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke genekspressionsanalyser i planter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativ Proteomics Workflow ved hjælp af flere reaktionsovervågningsbaserede detektioner af proteiner fra humant hjernevæv

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generation af humane nyre tubuloider fra væv og urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...