Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Algemeen: De auteurs willen de onderzoekers van het Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) bedanken voor hun gracieuze steun en advies.
Financiering: De NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) heeft dit werk ondersteund; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Onderzoek in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), onder awardnummer U2CDK114886.
Beschikbaarheid van gegevens en materialen: Gegevens worden gearchiveerd in de Gene Expression Omnibus (GEO # pending)

De studie werd goedgekeurd voor gebruik door de Institutional Review Board (IRB) van de Indiana University.
OPMERKING: Gebruik dit protocol met niernefrectomieweefsel (tot 2 cm in zowel de X- als de Y-afmetingen) dat bewaard is gebleven in de optimal cutting temperature (OCT) verbinding en bewaard bij -80 °C. Voer al het werk uit op een manier die RNA-vervuiling beperkt, gebruik schone wegwerphandschoenen en een gezichtsmasker. Zorg voor de netheid van alle oppervlakken. De apparatuur waarvo...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Transcriptomics op basis van LMD is een nuttige technologie die genexpressie verankert naar specifieke gebieden in het weefsel. De basis van deze technologie en de mogelijke toepassing ervan in de nier is eerder beschreven8. Optimalisatie, modernisering en stroomlijning van fluorescentie-gebaseerde dissectie specifiek gericht op hoge nauwkeurigheid dissectie voor downstream RNA sequencing is echter minder alomtegenwoordig. Omdat deze methodologie ruimtelijk geaard is in het weefsel, heeft het het ...

Technologische vooruitgang bij het bestuderen van weefselmonsters heeft het begrip van de gezondheidstoestand en ziekte in verschillende organen verbeterd. Dergelijke vooruitgang heeft onderstreept dat pathologie kan beginnen in beperkte regio's of in specifieke celtypen, maar toch belangrijke implicaties heeft voor het hele orgaan. Daarom is het in het huidige tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde belangrijk om de biologie op zowel cel- als regionaal niveau te begrijpen en niet alleen wereldwijd1. Dit geldt met name voor de nier, die bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen en structuren die differentieel initiëren en/of reageren op pathologische stress. De pathogenese van verschillende soorten menselijke nierziekte is nog steeds niet goed begrepen. Het genereren van een methodologie om veranderingen in genexpressie in specifieke buisvormige segmenten, structuren of gebieden van het interstitium in de menselijke nier te bestuderen, zal het vermogen vergroten om regiospecifieke veranderingen te ontdekken die kunnen informeren over de pathogenese van ziekte.
Menselijke nierbiopsie-exemplaren zijn een beperkte en kostbare hulpbron. Daarom moeten technologieën die transcriptomics in nierweefsel ondervragen, worden geoptimaliseerd om weefsel te bezuinigen. De beschikbare methoden om transcriptomics op cel- en regionaal niveau te bestuderen omvatten single cell RNA sequencing (scRNaseq), single nuclear RNaseq (snRNaseq), in situ spatial hybridization en laser microdissection (LMD). Dit laatste is zeer geschikt voor een nauwkeurige isolatie van regio 's of structuren die van belang zijn binnen weefselsecties , voor downstream RNA-sequencing en -analyse2,3,4,5. LMD kan worden gebruikt om te vertrouwen op identificatie van specifieke celtypen of structuren op basis van gevalideerde markers met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming tijdens dissectie.
De unieke kenmerken van lasermicrodissectie ondersteunde regionale transcriptomics omvatten: 1) het behoud van de ruimtelijke context van cellen en structuren, die eenmalige celtechnologieën aanvult waar cellen worden geïdentificeerd door expressie in plaats van histologisch; 2) de technologie informeert en wordt geïnformeerd door andere beeldvormingstechnologieën omdat een antilichaammarker expressiehandtekeningen definieert; 3) het vermogen om structuren te identificeren, zelfs wanneer markers veranderen in ziekte; 4) detectie van laag uitgedrukte transcripties in ongeveer 20.000 genen; en 5) opmerkelijke weefseleconomie. De technologie is schaalbaar voor een nierbiopsie met een dikte van minder dan 100 μm van een kern die nodig is voor voldoende RNA-acquisitie en maakt het gebruik van gearchiveerd bevroren weefsel mogelijk, dat algemeen beschikbaar is in grote repositories of academische centra6.
In het daaropvolgende werk beschrijven we de regionale en bulk transcriptomics-technologie in detail, geoptimaliseerd met een nieuw protocol voor snelle fluorescentiekleuring voor gebruik met menselijk nierweefsel. Deze aanpak verbetert klassieke LMD-verkenningen omdat het afzonderlijke expressiegegevens biedt voor de subsegmenten interstitium en nephron in tegenstelling tot geaggregeerde tubulo-interstitiële expressie. Inbegrepen zijn de kwaliteitsborgings- en controlemaatregelen die zijn genomen om strengheid en reproduceerbaarheid te waarborgen. Het protocol maakt visualisatie van cellen en interessegebieden mogelijk, wat resulteert in een bevredigende verwerving van RNA uit deze geïsoleerde gebieden om downstream RNA-sequencing mogelijk te maken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Genexpressieanalyse van menselijk nierweefsel is een belangrijk hulpmiddel om homeostase en ziektepathofysiologie te begrijpen. Het verhogen van de resolutie en diepte van deze technologie en het uitbreiden ervan tot het niveau van cellen in het weefsel is nodig. Hoewel het gebruik van single nuclear en single cell RNA sequencing wijdverspreid is geworden, behouden de expressiehandtekeningen van cellen verkregen uit weefseldissociatie geen ruimtelijke context. Lasermicrodissectie (LMD) op basis van specifieke fluorescerende markers zou de isolatie van specifieke structuren en celgroepen van belang met bekende lokalisatie mogelijk maken, waardoor ruimtelijk verankerde transcriptomische handtekeningen in nierweefsel kunnen worden verwerving. We hebben een LMD-methodologie geoptimaliseerd, geleid door een op fluorescentie gebaseerde vlek, om vijf verschillende compartimenten in de menselijke nier te isoleren en daaropvolgende RNA-sequencing uit waardevolle menselijke nierweefselmonsters te geleiden. We presenteren ook kwaliteitscontroleparameters om de toereikendheid van de verzamelde specimens te kunnen beoordelen. De workflow die in dit manuscript wordt beschreven, toont de haalbaarheid van deze aanpak om subsegmentale transcriptomische handtekeningen met veel vertrouwen te isoleren. De hier gepresenteerde methodologische benadering kan ook worden toegepast op andere weefseltypen met vervanging van relevante antilichaammarkers.

Monsters
We presenteren gegevens van negen referentie nefrectomieën (3 exemplaren verkregen aan de Indiana University en 6 specimens verkregen via Kidney Precision Medicine Project), gebruikmakend van het rapid fluorescence kleuringsprotocol om niernefronsegmenten en interstitiële gebieden te isoleren. De secties die in dit proces werden gebruikt, werden verkregen van overleden nierdonoren of niet-aangetaste tumornectectomie. Deze monsters hadden geen pathologisch bewijs van...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.

Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generatie van menselijke nier tubuloïden uit weefsel en urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...