Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

כללי: המחברים מבקשים להודות לחוקרי פרויקט הרפואה המדויקת בכליות (www.kpmp.org) על תמיכתם ואדיבותם וייעוץ.
מימון ומימון: תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי NIH / NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). מחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ועיכול ומחלות כליות (NIDDK) פרויקט רפואת דיוק כליות (KPMP), (www.kpmp.org), תחת מספר הפרס U2CDK114886.
זמינות נתונים וחומרים: הנתונים מאוחסנים בארכיון ב- Omnibus ביטוי גנים (GEO # ממתין)

המחקר אושר לשימוש על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) באוניברסיטת אינדיאנה.
הערה: השתמש בפרוטוקול זה עם רקמת כריתת כליות (עד 2 ס"מ בממדי X ו- Y) שהשתמרו בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 °C (60 °F). בצע את כל העבודה באופן המגביל זיהום RNA, להשתמש בכפפות חד פ...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

תעתיקים מבוססי LMD היא טכנולוגיה שימושית המעגנת ביטוי גנים לאזורים ספציפיים בתוך הרקמה. הבסיס של טכנולוגיה זו ואת היישום הפוטנציאלי שלה בכליה תוארה בעבר8. עם זאת, אופטימיזציה, מודרניזציה וייעול של ניתוח מבוסס פלואורסצנטיות שמטרתו במיוחד ניתוח דיוק גבוה עבור רצף RNA במורד הזרם ה...

ההתקדמות הטכנולוגית בחקר דגימות רקמות שיפרה את ההבנה של מצב הבריאות והמחלות באיברים שונים. התקדמות כזו הדגישה כי פתולוגיה יכולה להתחיל באזורים מוגבלים או בסוגי תאים ספציפיים, אך יש לה השלכות חשובות על האיבר כולו. לכן, בעידן הנוכחי של רפואה מותאמת אישית, חשוב להבין את הביולוגיה הן ברמה התאית והן ברמה האזורית ולא רק בעולם1. הדבר נכון במיוחד בכליה, המורכבת מתאים ומבנים מיוחדים שונים היוזמים ו/או מגיבים באופן דיפרנציאלי ללחץ פתולוגי. הפתוגנזה של סוגים שונים של מחלת כליות אנושית עדיין לא מובנת היטב. יצירת מתודולוגיה לחקר שינויים בביטוי גנים במקטעים צינוריים ספציפיים, מבנים או אזורים של interstitium בכליה האנושית תשפר את היכולת לחשוף שינויים ספציפיים באזור שיכולים ליידע על הפתוגנזה של המחלה.
דגימות ביופסיה של כליות אנושיות הן משאב מוגבל ויקר. לכן, טכנולוגיות לחקור transcriptomics ברקמת הכליה צריך להיות אופטימיזציה כדי להציע רקמות. השיטות הזמינות לחקר תעתיקים ברמה התאית והאזורית כוללות ריצוף RNA של תא יחיד (scRNaseq), RNaseq גרעיני יחיד (snRNaseq), בהכלאה מרחבית במקום, ומיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD). זה האחרון מתאים היטב לבידוד מדויק של אזורים או מבנים של עניין בתוך מקטעי רקמה, עבור רצף RNA במורד הזרם וניתוח2,3,4,5. ניתן לאמץ LMD כדי להסתמך על זיהוי של סוגי תאים או מבנים ספציפיים המבוססים על סמנים מאומתים באמצעות דימות מבוסס פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.
התכונות הייחודיות של מיקרו-דיסקציה בלייזר בסיוע תעתיקים אזוריים כוללות: 1) שימור ההקשר המרחבי של תאים ומבנים, המשלים טכנולוגיות תא יחיד שבהן תאים מזוהים על ידי ביטוי ולא על ידי היסטולוגיה; 2) הטכנולוגיה מודיעה ומעודכנה על ידי טכנולוגיות הדמיה אחרות מכיוון שסמן נוגדנים מגדיר חתימות ביטוי; 3) היכולת לזהות מבנים גם כאשר סמנים משתנים במחלה; 4) איתור תעתיקים בעלי ביטוי נמוך בכ-20,000 גנים; ו-5) כלכלת רקמות יוצאת דופן. הטכנולוגיה מדרגית לביופסיה בכליות עם עובי של פחות מ -100 מיקרומטר של ליבה הדרושה לרכישת RNA מספקת ומאפשרת שימוש ברקמה קפואה בארכיון, הזמינים בדרך כלל במאגרים גדולים או במרכזים אקדמיים6.
בעבודה שלאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את טכנולוגיית התמלולים האזורית והתפזורת, הממוטבת עם פרוטוקול מכתים פלואורסצנטי מהיר חדשני לשימוש עם רקמת כליות אנושית. גישה זו משפרת את חקר ה- LMD הקלאסי מכיוון שהיא מספקת נתוני ביטוי נפרדים עבור מקטעי המשנה interstitium ו- nephron לעומת ביטוי tubulointerstitial המצטבר. כלולים אמצעי אבטחת איכות ובקרה המיושמים כדי להבטיח הקפדה ושחזור. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של תאים ואזורים מעניינים, וכתוצאה מכך רכישה משביעת רצון של RNA מאזורים מבודדים אלה כדי לאפשר רצף RNA במורד הזרם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

ניתוח ביטוי גנים של רקמת כליה אנושית הוא כלי חשוב להבנת הומאוסטזיס ופתופיזיולוגיה של מחלות. הגדלת הרזולוציה והעומק של טכנולוגיה זו והרחבתה לרמת התאים בתוך הרקמה יש צורך. למרות שהשימוש ברצף RNA גרעיני יחיד ותא יחיד הפך נפוץ, חתימות הביטוי של תאים המתקבלים מדיסוציאציה של רקמות אינן שומרות על הקשר מרחבי. מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המבוססת על סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים תאפשר בידוד של מבנים ספציפיים וקבוצות תאים מעניינות עם לוקליזציה ידועה, ובכך תאפשר רכישה של חתימות תעתיקיות מעוגנות באופן מעוגן במים ברקמת הכליה. יש לנו אופטימיזציה מתודולוגיית LMD, מונחה על ידי כתם מבוסס פלואורסצנטיות מהירה, כדי לבודד חמישה תאים נפרדים בתוך הכליה האנושית ולבצע רצף RNA הבאים מדגימות רקמת כליה אנושית יקרות ערך. אנו מציגים גם פרמטרים לבקרת איכות כדי לאפשר הערכה של הלימות הדגימות שנאספו. זרימת העבודה המתוארת בכתב יד זה מראה את ההיתכנות של גישה זו לבודד חתימות תעתיק תת-מגזריות בביטחון רב. הגישה המתודולוגית המוצגת כאן עשויה לחול גם על סוגי רקמות אחרים עם החלפת סמני נוגדנים רלוונטיים.

דגימות
אנו מציגים נתונים מתשעה ניתוחים nephrectomies (3 דגימות שהושגו באוניברסיטת אינדיאנה ו 6 דגימות שהושגו באמצעות פרויקט רפואה דיוק כליות), ניצול פרוטוקול כתמי פלואורסצנטיות מהירה כדי לבודד מקטעי nephron כליות ואזורים ביניים. הסעיפים בהם נוצלו בתהליך זה התקבלו מתורמי כל?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.

יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...