Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
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सामान्य: लेखक किडनी प्रिसिजन मेडिसिन प्रोजेक्ट (www.kpmp.org) के जांचकर्ताओं को उनके अनुग्रह समर्थन और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।
फंडिंग: इस काम के लिए समर्थन NIH/NIDK K08DK107864 (M.T.E.) द्वारा प्रदान किया गया था; NIH/NIDDK UG3DK1114923 (T.M.E., P.C.d.); R01dK099345 (T.A.S.) । इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या U2CDK114886 के तहत राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों (NIDDK) किडनी प्रेसिजन मेडिसिन परियोजना (KPMP), (www.kpmp.org) द्वारा समर्थित किया गया था ।
डेटा और सामग्री की उपलब्धता: डेटा जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही में संग्रहीत है (जियो # लंबित)

इस अध्ययन को इंडियाना विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा उपयोग के लिए मंजूरी दी गई थी ।
नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग गुर्दे के नेफ्रेक्टॉमी ऊतक (एक्स और वाई दोनों आयामों ?...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

एलएमडी आधारित ट्रांसक्रिप्टोमिक्स एक उपयोगी तकनीक है जो ऊतक के भीतर विशिष्ट क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति को एंकर करती है। इस तकनीक का आधार और गुर्दे में इसके संभावित अनुप्रयोग को पहले8बताय?...

ऊतक नमूनों का अध्ययन करने में तकनीकी प्रगति ने विभिन्न अंगों में स्वास्थ्य और रोग की स्थिति की समझ में सुधार किया है। इस तरह के अग्रिमों ने रेखांकित किया है कि विकृति सीमित क्षेत्रों में या विशिष्ट कोशिका प्रकारों में शुरू हो सकती है, फिर भी पूरे अंग पर महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। इसलिए, व्यक्तिगत चिकित्सा के वर्तमान युग में, कोशिका और क्षेत्रीय दोनों स्तरों पर जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है और न केवल विश्व स्तर पर1। यह गुर्दे में विशेष रूप से सच है, जो विभिन्न विशेष कोशिकाओं और संरचनाओं से बना है जो अलग-अलग रूप से शुरू करते हैं और/या पैथोलॉजिकल तनाव का जवाब देते हैं । विभिन्न प्रकार की मानव गुर्दे की बीमारी के रोगजनन अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। मानव गुर्दे में विशिष्ट ट्यूबलर खंडों, संरचनाओं या इंटरस्टिटियम के क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति पैदा करने से क्षेत्र विशिष्ट परिवर्तनों को उजागर करने की क्षमता में वृद्धि होगी जो रोग के रोगजनकों पर सूचित कर सकते हैं ।
मानव गुर्दे बायोप्सी नमूने एक सीमित और कीमती संसाधन हैं। इसलिए, गुर्दे के ऊतकों में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स से पूछताछ करने वाली प्रौद्योगिकियों को ऊतक को अर्थव्यवस्था बनाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। सेल और क्षेत्रीय स्तर पर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों में एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNaseq), एकल परमाणु RNaseq (snRNaseq), सीटू स्थानिक संकरण में, और लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) शामिल हैं। उत्तरार्द्ध ऊतक वर्गों के भीतर क्षेत्रों या रुचि की संरचनाओं के सटीक अलगाव के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण और विश्लेषण2,3,4,5के लिए। विच्छेदन के दौरान फ्लोरेसेंस-आधारित इमेजिंग का उपयोग करके मान्य मार्कर के आधार पर विशिष्ट सेल प्रकार या संरचनाओं की पहचान पर भरोसा करने के लिए एलएमडी अपनाया जा सकता है।
लेजर माइक्रोडिसेक्शन असिस्टेड रीजनल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की अनूठी विशेषताओं में शामिल हैं: 1) कोशिकाओं और संरचनाओं के स्थानिक संदर्भ का संरक्षण, जो एकल कोशिका प्रौद्योगिकियों का पूरक है जहां कोशिकाओं को हिस्टोलॉजिकल रूप से अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना जाता है; 2) प्रौद्योगिकी अन्य इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा सूचित और सूचित की जाती है क्योंकि एक एंटीबॉडी मार्कर अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों को परिभाषित करता है; 3) रोग में मार्कर बदलने पर भी संरचनाओं की पहचान करने की क्षमता; 4) लगभग 20,000 जीन में नीच व्यक्त टेप का पता लगाना; और 5) उल्लेखनीय ऊतक अर्थव्यवस्था। यह तकनीक पर्याप्त आरएनए अधिग्रहण के लिए आवश्यक कोर की 100 माइक्रोन मोटाई से कम के साथ गुर्दे की बायोप्सी के लिए स्केलेबल है और संग्रहीत जमे हुए ऊतकों के उपयोग को सक्षम बनाती है, जो आमतौर पर बड़े भंडार या अकादमिक केंद्रों में उपलब्ध हैं6।
आगामी काम में, हम विस्तार से क्षेत्रीय और थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स तकनीक का वर्णन करते हैं, जो मानव गुर्दे के ऊतकों के साथ उपयोग के लिए एक उपन्यास रैपिड फ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल के साथ अनुकूलित होता है। यह दृष्टिकोण क्लासिक एलएमडी अन्वेषणों पर सुधार करता है क्योंकि यह कुल तुबुलोइंटिशियल अभिव्यक्ति के विपरीत इंटरस्टिटियम और नेफ्रॉन उप-खंडों के लिए अलग अभिव्यक्ति डेटा प्रदान करता है। कठोरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए लागू गुणवत्ता आश्वासन और नियंत्रण उपाय शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं और रुचि के क्षेत्रों के दृश्य को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन अलग-थलग क्षेत्रों से आरएनए का संतोषजनक अधिग्रहण होता है ताकि डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण की अनुमति दी जा सके ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

मानव गुर्दे के ऊतकों का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण होमोस्टेसिस और रोग रोगविज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। संकल्प और इस तकनीक की गहराई बढ़ाने और ऊतक के भीतर कोशिकाओं के स्तर तक विस्तार की जरूरत है । हालांकि एकल परमाणु और एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग व्यापक हो गया है, ऊतक वियोजन से प्राप्त कोशिकाओं की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर स्थानिक संदर्भ को बनाए नहीं रखते हैं। विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर के आधार पर लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) ज्ञात स्थानीयकरण के साथ विशिष्ट संरचनाओं और ब्याज के सेल समूहों के अलगाव की अनुमति देगा, जिससे गुर्दे के ऊतकों में स्थानिक रूप से लंगर डाले गए ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षरों के अधिग्रहण को सक्षम किया जा सकेगा। हमने मानव गुर्दे के भीतर पांच अलग-अलग डिब्बों को अलग करने और मूल्यवान मानव गुर्दे के ऊतक नमूनों से बाद में आरएनए अनुक्रमण का संचालन करने के लिए तेजी से फ्लोरेसेंस-आधारित दाग द्वारा निर्देशित एक एलएमडी पद्धति को अनुकूलित किया है। हम एकत्र नमूनों की पर्याप्तता के आकलन को सक्षम करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मापदंड भी प्रस्तुत करते हैं। इस पांडुलिपि में उल्लिखित कार्यप्रवाह उच्च आत्मविश्वास के साथ उप-खंडीय प्रतिलिपि हस्ताक्षरों को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को दर्शाता है। यहां प्रस्तुत पद्धतिगत दृष्टिकोण को प्रासंगिक एंटीबॉडी मार्कर के प्रतिस्थापन के साथ अन्य ऊतक प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है।

नमूने
हम नौ संदर्भ नेफ्रेक्टॉमी (इंडियाना विश्वविद्यालय में प्राप्त 3 नमूनों और गुर्दे की सटीक चिकित्सा परियोजना के माध्यम से प्राप्त 6 नमूनों) से डेटा प्रस्तुत करते हैं, गुर्दे के ने?...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

हम मानव गुर्दे के उप-खंडों के लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें ग्लोमेरुलस, समीपस्थ ट्यूबल, मोटी आरोही अंग, डक्ट और इंटरस्टिटियम इकट्ठा करना शामिल है। आरएनए को प्राप्त डिब्बों से अलग किया जाता है और प्रत्येक उप-खंड के भीतर ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण किया जाता है।

मानव गुर्दे के ऊतकों में क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को उजागर करने के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन का आवेदन

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

लेजर स्तनधारी ऊतक की कैद Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

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लेजर Microdissection से कोशिकाओं के सबसेट के जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा लागू करने के लिए ड्रोसोफिला विंग डिस्क

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

लेजर की मदद से अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के Transcriptional प्रोफाइलिंग के लिए एक उपकरण के रूप में Microdissection (एलएएम)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

माउस पृथक perfused किडनी तकनीक

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

लेजर पर कब्जा Microdissection जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध Trabecular Meshwork

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल जो ताजा-फ्रोज़न माउस हड्डियों से उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदाकरता है

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

पौधों में स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन आरएनए-अनुक्रमण

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

मानव मस्तिष्क ऊतक से प्रोटीन का एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी आधारित पता लगाने का उपयोग कर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

ऊतक और मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...