Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Generelt: Forfatterne vil gjerne takke etterforskerne av Nyre Precision Medicine Project (www.kpmp.org) for deres nådige støtte og råd.
Finansiering: Støtte for dette arbeidet ble levert av NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning rapportert i dette manuskriptet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under prisnummer U2CDK114886.
Tilgjengelighet av data og materialer: Data er arkivert i Gene Expression Omnibus (GEO # venter)

Studien ble godkjent for bruk av Institutional Review Board (IRB) ved Indiana University.
MERK: Bruk denne protokollen med nyrenevrbektomivev (opptil 2 cm i både X- og Y-dimensjonene) som er bevart i optimal skjæretemperatur (OCT) og lagret ved -80 °C. Utfør alt arbeid på en måte som begrenser RNA-kontaminering, bruk rene engangshansker og en ansiktsmaske. Sørg for rensligheten til alle overflater. Utstyret som denne protokollen ble optimalisert for er et lasermikrodisseksjonssystem me...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

LMD-baserte transkripsjonsmikromer er en nyttig teknologi som forankrer genuttrykk til bestemte områder i vevet. Grunnlaget for denne teknologien og dens potensielle anvendelse i nyrene har blitt beskrevet tidligere8. Optimalisering, modernisering og effektivisering av fluorescensbasert disseksjon spesielt rettet mot høy nøyaktighetsspisse for nedstrøms RNA-sekvensering er imidlertid mindre allestedsnærværende. Fordi denne metodikken er romlig jordet i vevet, har den potensial til å avslør...

Teknologiske fremskritt i å studere vevsprøver har forbedret forståelsen av helsetilstanden og sykdommen i ulike organer. Slike fremskritt har understreket at patologi kan starte i begrensede regioner eller i bestemte celletyper, men har viktige implikasjoner på hele orgelet. Derfor, i dagens æra av personlig medisin, er det viktig å forstå biologien på både celle- og regionalnivå og ikke bare globalt1. Dette gjelder spesielt i nyrene, som består av ulike spesialiserte celler og strukturer som differensialt initierer og / eller reagerer på patologisk stress. Patogenesen av ulike typer menneskelig nyresykdom er fortsatt ikke godt forstått. Generere en metodikk for å studere endringer i genuttrykk i spesifikke rørformede segmenter, strukturer eller områder av interstitium i den menneskelige nyre vil forbedre evnen til å avdekke regionen spesifikke endringer som kan informere om patogenesen av sykdommen.
Humane nyrebiopsiprøver er en begrenset og dyrebar ressurs. Derfor bør teknologier som forhører transkripsjonsmikromikk i nyrevev optimaliseres for å isere vev. De tilgjengelige metodene for å studere transkripsjonsmikromer på celle- og regionalnivå inkluderer encellede RNA-sekvensering (scRNaseq), enkelt kjernefysisk RNaseq (snRNaseq), in situ romlig hybridisering og lasermikrodisseksjon (LMD). Sistnevnte er godt egnet for presis isolering av regioner eller strukturer av interesse innenfor vevsseksjoner, for nedstrøms RNA sekvenseringog analyse 2,3,4,5. LMD kan vedtas for å stole på identifisering av bestemte celletyper eller strukturer basert på validerte markører ved hjelp av fluorescensbasert avbildning under disseksjon.
De unike egenskapene til lasermikrodisseksjon assistert regionale transkripsjonsmikromikk inkluderer: 1) bevaring av romlig kontekst av celler og strukturer, som utfyller enkeltcelleteknologier der celler identifiseres ved uttrykk i stedet for histologisk; 2) teknologien informerer og er informert av andre bildeteknologier fordi en antistoffmarkør definerer uttrykkssignaturer; 3) evnen til å identifisere strukturer selv når markører endres i sykdom; 4) påvisning av lavt uttrykte transkripsjoner i ca 20.000 gener; og 5) bemerkelsesverdig vev økonomi. Teknologien er skalerbar til en nyrebiopsi med mindre enn 100 μm tykkelse av en kjerne som er nødvendig for tilstrekkelig RNA-oppkjøp og muliggjør bruk av arkivert frosset vev, som vanligvis er tilgjengelige i store repositorier ellerakademiske sentre 6.
I det påfølgende arbeidet beskriver vi den regionale og bulk transkripsjonsteknologien i detalj, optimalisert med en ny rask fluorescensfargingsprotokoll for bruk med menneskelig nyrevev. Denne tilnærmingen forbedres på klassiske LMD-utforskninger fordi den gir separate uttrykksdata for interstitium- og nephron-delsegmentene i motsetning til aggregert tubulointerstitialuttrykk. Inkludert er kvalitetssikring og kontrolltiltak iverksatt for å sikre rigor og reproduserbarhet. Protokollen muliggjør visualisering av celler og regioner av interesse, noe som resulterer i tilfredsstillende oppkjøp av RNA fra disse isolerte områdene for å tillate nedstrøms RNA-sekvensering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Genuttrykksanalyse av menneskelig nyrevev er et viktig verktøy for å forstå homeostase og sykdomsveiofysiologi. Øke oppløsningen og dybden av denne teknologien og utvide den til nivået av celler i vevet er nødvendig. Selv om bruken av enkelt kjernefysisk og enkeltcellede RNA-sekvensering har blitt utbredt, opprettholder uttrykket signaturer av celler hentet fra vevdissosiasjon ikke romlig kontekst. Laser mikrodisseksjon (LMD) basert på spesifikke fluorescerende markører ville tillate isolering av spesifikke strukturer og cellegrupper av interesse med kjent lokalisering, og dermed muliggjør oppkjøpet av romlig forankret transkripsjonsiske signaturer i nyrevev. Vi har optimalisert en LMD-metodikk, styrt av en rask fluorescensbasert flekk, for å isolere fem forskjellige rom i den menneskelige nyren og utføre påfølgende RNA-sekvensering fra verdifulle menneskelige nyrevevsprøver. Vi presenterer også kvalitetskontrollparametere for å muliggjøre vurdering av tilstrekkeligheten av de innsamlede prøvene. Arbeidsflyten som er skissert i dette manuskriptet, viser muligheten for denne tilnærmingen til å isolere subsegmentale transkripsjonsmessige signaturer med høy tillit. Den metodiske tilnærmingen som presenteres her, kan også brukes på andre vevstyper med substitusjon av relevante antistoffmarkører.

Prøver
Vi presenterer data fra ni referanse nephrectomies (3 prøver innhentet ved Indiana University og 6 prøver innhentet gjennom Nyre Precision Medicine Project), ved hjelp av rask fluorescens farging protokollen for å isolere nyre nephron segmenter og interstitielle områder. Seksjonene som benyttes i denne prosessen ble hentet fra avdøde nyredonorer eller upåvirket tumornephhrectomies. Disse prøvene hadde ikke patologiske tegn på sykdom som visualisert i H&E-flekke...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Vi beskriver en protokoll for lasermikrodisseksjon av undersegmenter av den menneskelige nyren, inkludert glomerulus, proksimal tubule, tykk stigende lem, samlekanal og interstitium. RNA blir deretter isolert fra de oppnådde rommene, og RNA-sekvensering utføres for å bestemme endringer i transkripsjonssignaturen i hvert undersegment.

Anvendelse av lasermikrodisseksjon for å avdekke regionale transkripsjonsmikromikk i humant nyrevev

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser fange Microdissection av svært ren trabekulært Meshwork fra musen øyne for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En laser Capture Microdissection protokoll som gir høy kvalitet RNA fra fersk-frosne Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Laserfangst mikrodisseksjon RNA-sekvensering for romlig og temporal vevspesifikt genuttrykksanalyse i planter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativ proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av flerreaksjonsovervåkingsbasert påvisning av proteiner fra humant hjernevev

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generering av humane nyre tubuoider fra vev og urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...