Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
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Geral: Os autores gostariam de agradecer aos pesquisadores do Projeto de Medicina de Precisão Renal (www.kpmp.org) pelo apoio e aconselhamento graciosos.
Financiamento: O suporte para este trabalho foi fornecido pelo NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Projeto de Medicina de Precisão Renal (KPMP) do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), (www.kpmp.org), sob o número de premiação U2CDK114886.
Disponibilidade de dados e materiais: Os dados são arquivados no Omnibus de Expressão Genética (GEO # pendente)

O estudo foi aprovado para uso pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade de Indiana.
NOTA: Use este protocolo com tecido de nefrectomia renal (até 2 cm nas dimensões X e Y) preservado no composto de Temperatura de Corte Ideal (OCT) e armazenado a -80 °C. Realize todo o trabalho de forma que limite a contaminação do RNA, use luvas descartáveis limpas e uma máscara facial. Certifique-se da limpeza de todas as superfícies. O equipamento para o qual este protocolo foi otimizad...

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	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

A transcriptômica baseada em LMD é uma tecnologia útil que ancora a expressão genética em áreas específicas dentro do tecido. A base dessa tecnologia e sua potencial aplicação no rim foram descritas anteriormente8. No entanto, a otimização, modernização e simplificação da dissecção baseada em fluorescência especificamente destinada à dissecção de alta precisão para sequenciamento de RNA a jusante é menos onipresente. Como essa metodologia é espacialmente fundamentada dentro...

Os avanços tecnológicos no estudo dos espécimes teciduais melhoraram a compreensão do estado de saúde e da doença em diversos órgãos. Tais avanços têm sublinhado que a patologia pode começar em regiões limitadas ou em tipos celulares específicos, mas têm implicações importantes em todo o órgão. Portanto, na atual era da medicina personalizada, é importante compreender a biologia tanto no nível celular quanto regional e não apenas globalmente1. Isso é particularmente verdadeiro no rim, que é composto por várias células e estruturas especializadas que iniciam diferencialmente e/ou respondem ao estresse patológico. A patogênese de vários tipos de doença renal humana ainda não é bem compreendida. Gerar uma metodologia para estudar mudanças na expressão genética em segmentos tubulares específicos, estruturas ou áreas do interstício no rim humano aumentará a capacidade de descobrir alterações específicas da região que poderiam informar sobre a patogênese da doença.
Biópsia de rim humano é um recurso limitado e precioso. Portanto, as tecnologias que interrogam a transcrição no tecido renal devem ser otimizadas para economizar tecido. Os métodos disponíveis para estudar transcrição em nível celular e regional incluem sequenciamento de RNA de célula única (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridização espacial in situ e microdissecção a laser (LMD). Este último é adequado para o isolamento preciso de regiões ou estruturas de interesse dentro de seções teciduais, para sequenciamento e análise de RNA a jusante2,3,4,5. A LMD pode ser adotada para contar com a identificação de tipos ou estruturas celulares específicas baseadas em marcadores validados usando imagens baseadas em fluorescência durante a dissecção.
As características únicas da microdisseção a laser assistida transcrição regional incluem: 1) a preservação do contexto espacial das células e estruturas, que complementa tecnologias celulares únicas onde as células são identificadas pela expressão e não histologicamente; 2) a tecnologia informa e é informada por outras tecnologias de imagem porque um marcador de anticorpos define assinaturas de expressão; 3) a capacidade de identificar estruturas mesmo quando os marcadores mudam na doença; 4) detecção de transcrições humildemente expressas em aproximadamente 20.000 genes; e 5) notável economia tecidual. A tecnologia é escalável para uma biópsia renal com menos de 100 μm de espessura de um núcleo necessário para aquisição suficiente de RNA e permite o uso de tecido congelado arquivado, que são comumente disponíveis em grandes repositórios ou centros acadêmicos6.
No trabalho seguinte, descrevemos em detalhes a tecnologia de transcrição regional e em massa, otimizada com um novo protocolo de coloração rápida de fluorescência para uso com tecido renal humano. Essa abordagem melhora em explorações clássicas de LMD porque fornece dados de expressão separados para os subsegmentos interstitium e nefron em oposição à expressão tubulointerstícia agregada. Incluem-se as medidas de garantia e controle de qualidade implementadas para garantir rigor e reprodutibilidade. O protocolo permite a visualização de células e regiões de interesse, resultando na aquisição satisfatória de RNA dessas áreas isoladas para permitir o sequenciamento de RNA a jusante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

A análise da expressão genética do tecido renal humano é uma ferramenta importante para entender a homeostase e a fisiopatologia da doença. Aumentar a resolução e a profundidade dessa tecnologia e estendê-la ao nível das células dentro do tecido é necessário. Embora o uso de sequenciamento de RNA uni nuclear e unicelular tenha se espalhado, as assinaturas de expressão das células obtidas a partir da dissociação tecidual não mantêm o contexto espacial. A microdisseção a laser (LMD) baseada em marcadores fluorescentes específicos permitiria o isolamento de estruturas específicas e grupos celulares de interesse com localização conhecida, permitindo assim a aquisição de assinaturas transcriômicas ancoradas espacialmente no tecido renal. Otimizamos uma metodologia de LMD, guiada por uma mancha rápida baseada em fluorescência, para isolar cinco compartimentos distintos dentro do rim humano e realizar sequenciamento subsequente de RNA de valiosos espécimes de tecido renal humano. Também apresentamos parâmetros de controle de qualidade para permitir a avaliação da adequação das amostras coletadas. O fluxo de trabalho descrito neste manuscrito mostra a viabilidade dessa abordagem para isolar assinaturas transcriômicas subsu segmentares com alta confiança. A abordagem metodológica aqui apresentada também pode ser aplicada a outros tipos de tecidos com substituição de marcadores de anticorpos relevantes.

Amostras
Apresentamos dados de nove nefrectomias de referência (3 espécimes obtidos na Universidade de Indiana e 6 espécimes obtidos através do Kidney Precision Medicine Project), utilizando o protocolo de coloração de fluorescência rápida para isolar segmentos de nefradeira renal e áreas intersticiais. As seções utilizadas neste processo foram obtidas de doadores renais falecidos ou nefrectomias tumorais não afetadas. Estas amostras não apresentaram evidência pa...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologia

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

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Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Geração de Tubuloides de Rim Humano a partir de tecido e urina

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...