Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Общие: Авторы хотели бы поблагодарить исследователей проекта точной медицины почек (www.kpmp.org) за их любезное поддержку и советы.
Финансирование: Поддержку этой работе оказал NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и заболеваний почек (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP) (www.kpmp.org), под номером U2CDK114886.
Доступность данных и материалов: Данные архивируются в Omnibus экспрессии генов (GEO )

Исследование было одобрено для использования Советом по институциональному обзору (IRB) при Университете Индианы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот протокол с тканью нефрэктомии почек (до 2 см в размерах X и Y), сохраненных в соединении Оптимальная температура резки (OCT) и хранящ?...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Транскриптомика на основе LMD является полезной технологией, которая закрепляет экспрессию генов в определенных областях ткани. Основа этой технологии и ее потенциальное применение в почках было описано ранее8. Однако оптимизация, модернизация и оптимизация вскрытия на ос...

Технологический прогресс в изучении образцов тканей улучшил понимание состояния здоровья и заболеваний в различных органах. Такие достижения подчеркивают, что патология может начаться в ограниченных регионах или в конкретных типах клеток, но имеют важные последствия для всего органа. Поэтому в нынешнюю эпоху персонализированной медицины важно понимать биологию как на клеточном, так и на региональном уровне, а не только глобально1. Это особенно верно в почках, которая состоит из различных специализированных клеток и структур, которые дифференцированно инициировать и / или реагировать на патологический стресс. Патогенез различных типов заболеваний почек человека до сих пор не очень хорошо изучен. Создание методологии для изучения изменений экспрессии генов в конкретных трубчатых сегментах, структурах или областях интерстиция в почках человека повысит способность выявить конкретные изменения региона, которые могли бы информировать о патогенеза болезни.
Образцы биопсии почек человека являются ограниченным и ценным ресурсом. Поэтому технологии, допрашивающие транскриптомику в тканях почек, должны быть оптимизированы для экономии тканей. Доступные методы изучения транскриптомики на клеточном и региональном уровне включают одноклеточное секвенирование РНК (scRNaseq), одноядерную RNaseq (snRNaseq), пространственную гибридизацию на месте и лазерное микродиссекцию (LMD). Последний хорошо подходит для точной изоляции регионов или структур, представляющих интерес в секциях тканей, для секвенирования ианализа РНК вниз по течению 2,3,4,5. LMD может быть принят, чтобы полагаться на идентификацию конкретных типов клеток или структур на основе проверенных маркеров с использованием флуоресценции на основе изображений во время вскрытия.
Уникальные особенности лазерной микроперепись помощь региональной транскриптомики включают в себя: 1) сохранение пространственного контекста клеток и структур, который дополняет одноклеточных технологий, где клетки идентифицируются по выражению, а не гисто логики; 2) технология информирует и информируется другими технологиями визуализации, потому что маркер антител определяет экспрессионные подписи; 3) способность определять структуры даже при изменении маркеров заболевания; 4) обнаружение низко выраженных транскриптов примерно в 20 000 генов; и 5) замечательная экономия тканей. Технология масштабируется для биопсии почек с толщиной менее 100 мкм ядра, необходимого для достаточного приобретения РНК и позволяет использовать архивные замороженные ткани, которые обычно доступны в крупных хранилищах или академическихцентрах 6.
В последующей работе мы подробно описываем региональную и объемную технологию транскриптомики, оптимизированную новым протоколом быстрого окрашивания флуоресценции для использования в почечной ткани человека. Этот подход улучшает классические исследования LMD, поскольку он обеспечивает отдельные данные выражения для интерстиций и нефронных подсектов, в отличие от агрегированного тубулоинтерстициального выражения. Включены меры по обеспечению качества и контролю, принятые для обеспечения строгости и воспроизводимости. Протокол позволяет визуализировать ячейки и области, представляющие интерес, что приводит к удовлетворительному приобретению РНК из этих изолированных районов, чтобы позволить секвенированию РНК ниже по течению.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Анализ экспрессии генов тканей почек человека является важным инструментом для понимания гомеостаза и патофизиологии заболеваний. Необходимо увеличить разрешение и глубину этой технологии и расширить ее до уровня клеток в тканях. Хотя использование одноядерной и одноклеточной РНК-секвенирования получило широкое распространение, экспрессионные сигнатные знаки клеток, полученных в результате диссоциации тканей, не поддерживают пространственного контекста. Лазерная микроперепись (ЛМД) на основе специфических флуоресцентных маркеров позволит изоляции конкретных структур и клеточных групп, представляющих интерес с известной локализации, тем самым позволяя приобретение пространственно якорных транскриптомных подписей в ткани почек. Мы оптимизировали методологию LMD, руководствуясь быстрым пятном на основе флуоресценции, чтобы изолировать пять различных отсеков в почках человека и провести последующее секвенирование РНК из ценных образцов тканей почек человека. Мы также представляем параметры контроля качества, позволяющие оценить адекватность собранных образцов. Рабочий процесс, изложенный в этой рукописи, показывает осуществимость такого подхода к изоляции подкломентальных транскриптомных подписей с высокой достоверностью. Представленный здесь методологический подход может быть применен и к другим типам тканей с заменой соответствующих маркеров антител.

Образцы
Мы представляем данные из девяти эталонных нефрэктомий (3 образца, полученных в Университете Индианы и 6 образцов, полученных в рамках проекта почечной точной медицины), используя протокол быстрого окрашивания флуоресценции для изоляции сегментов нефро...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.

Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Лазерная Захват микродиссекция ткани млекопитающих

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Лазерный захват Microdissection Протокол, который дает высокое качество РНК из свежезамороженных костей мыши

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Лазер-Захват Микродиссеция РНК-секвенирования для пространственной и временной ткани-специфический анализ экспрессии генов в растениях

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Генерация почечных тубулоидов человека из тканей и мочи

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...