Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
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General: Los autores quieren agradecer a los investigadores del Proyecto de Medicina de Precisión Renal (www.kpmp.org) por su amable apoyo y asesoramiento.
Financiación: El soporte para este trabajo fue proporcionado por el NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Proyecto de Medicina de Precisión Renal (KPMP) del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), (www.kpmp.org), bajo el número de premio U2CDK114886.
Disponibilidad de datos y materiales: Los datos se archivan en el Ómnibus de expresión génica (GEO # pendiente)

El estudio fue aprobado para su uso por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Indiana.
NOTA: Utilice este protocolo con tejido de nefrectomía renal (hasta 2 cm en las dimensiones X e Y) conservado en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y almacenado a -80 °C. Realice todo el trabajo de una manera que limite la contaminación por ARN, use guantes desechables limpios y una máscara facial. Asegúrese de la limpieza de todas las superficies. El equipo par...

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	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

La transcriptómica basada en LMD es una tecnología útil que ancla la expresión génica a áreas específicas dentro del tejido. La base de esta tecnología y su aplicación potencial en el riñón se ha descrito anteriormente8. Sin embargo, la optimización, modernización y racionalización de la disección basada en la fluorescencia específicamente dirigida a la disección de alta precisión para la secuenciación de ARN aguas abajo es menos omnipresente. Debido a que esta metodología est?...

Los avances tecnológicos en el estudio de muestras de tejidos han mejorado la comprensión del estado de salud y enfermedades en varios órganos. Estos avances han puesto de relieve que la patología puede comenzar en regiones limitadas o en tipos celulares específicos, pero tienen implicaciones importantes en todo el órgano. Por lo tanto, en la era actual de la medicina personalizada, es importante entender la biología tanto a nivel celular como regional y no sólo a nivel mundial1. Esto es particularmente cierto en el riñón, que se compone de varias células especializadas y estructuras que inician y/o responden diferencialmente al estrés patológico. La patogénesis de varios tipos de enfermedad renal humana todavía no se entiende bien. Generar una metodología para estudiar los cambios en la expresión génica en segmentos tubulares específicos, estructuras o áreas del interstitium en el riñón humano mejorará la capacidad de descubrir cambios específicos de la región que podrían informar sobre la patogénesis de la enfermedad.
Los especímenes de biopsia renal humana son un recurso limitado y precioso. Por lo tanto, las tecnologías que interrogan la transcriptómica en el tejido renal deben optimizarse para economizar el tejido. Los métodos disponibles para estudiar la transcriptómica a nivel celular y regional incluyen secuenciación de ARN de una sola célula (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridación espacial in situ y microdissección láser (LMD). Este último es adecuado para el aislamiento preciso de regiones o estructuras de interés dentro de las secciones de tejido, para secuenciación y análisis de ARN aguas abajo2,3,4,5. La LMD se puede adoptar para basarse en la identificación de tipos o estructuras celulares específicas basadas en marcadores validados utilizando imágenes basadas en fluorescencia durante la disección.
Las características únicas de la transcriptómica regional asistida por microdisección láser incluyen: 1) la preservación del contexto espacial de las células y estructuras, que complementa las tecnologías unicelulares donde las células se identifican por expresión en lugar de histológicamente; 2) la tecnología informa y es informada por otras tecnologías de imágenes porque un marcador de anticuerpos define firmas de expresión; 3) la capacidad de identificar estructuras incluso cuando los marcadores cambian en la enfermedad; 4) detección de transcripciones poco expresadas en aproximadamente 20.000 genes; y 5) notable economía de tejidos. La tecnología es escalable a una biopsia renal con menos de 100 μm de espesor de un núcleo necesario para la adquisición suficiente de ARN y permite el uso de tejido congelado archivado, que comúnmente están disponibles en grandes repositorios o centros académicos6.
En el trabajo subsiguiente, describimos la tecnología de transcriptómica regional y a granel en detalle, optimizada con un nuevo protocolo de tinción rápida de fluorescencia para su uso con tejido renal humano. Este enfoque mejora las exploraciones lmd clásicas porque proporciona datos de expresión independientes para los subsegmentos de interstitium y nefrón en lugar de la expresión tubulointersticial agregada. Se incluyen las medidas de control y garantía de calidad implementadas para garantizar el rigor y la reproducibilidad. El protocolo permite la visualización de células y regiones de interés, lo que resulta en la adquisición satisfactoria de ARN de estas áreas aisladas para permitir la secuenciación de ARN aguas abajo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

El análisis de la expresión génica del tejido renal humano es una herramienta importante para entender la homeostasis y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesita aumentar la resolución y profundidad de esta tecnología y extenderla al nivel de las células dentro del tejido. Aunque el uso de secuenciación única de ARN nuclear y unicelular se ha generalizado, las firmas de expresión de las células obtenidas de la disociación tisular no mantienen el contexto espacial. La microdisección láser (LMD) basada en marcadores fluorescentes específicos permitiría el aislamiento de estructuras específicas y grupos celulares de interés con localización conocida, permitiendo así la adquisición de firmas transcriptómicas ancladas espacialmente en el tejido renal. Hemos optimizado una metodología LMD, guiada por una mancha rápida a base de fluorescencia, para aislar cinco compartimentos distintos dentro del riñón humano y llevar a cabo la posterior secuenciación de ARN de valiosas muestras de tejido renal humano. También presentamos parámetros de control de calidad para permitir la evaluación de la adecuación de los especímenes recogidos. El flujo de trabajo descrito en este manuscrito muestra la viabilidad de este enfoque para aislar firmas transcriptómicas sub-segmentales con alta confianza. El enfoque metodológico que se presenta aquí también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con la sustitución de marcadores de anticuerpos relevantes.

Muestras
Presentamos datos de nueve nefrectomías de referencia (3 muestras obtenidas en la Universidad de Indiana y 6 muestras obtenidas a través de Kidney Precision Medicine Project), utilizando el protocolo de tinción rápida de fluorescencia para aislar segmentos de nefrones renales y áreas intersticiales. Las secciones utilizadas en este proceso se obtuvieron de donantes renales fallecidos o nefrectomías tumorales no afectadas. Estas muestras no tenían evidencia pato...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Investigación

Biología

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

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