Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Allmänt: Författarna vill tacka utredarna av Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) för deras älskvärda stöd och råd.
Finansiering: Stöd för detta arbete tillhandahölls av NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning som rapporterades i detta manuskript stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under tilldelningsnummer U2CDK114886.
Tillgång till data och material: Data arkiveras i Gene Expression Omnibus (GEO # väntar)

Studien godkändes för användning av Institutional Review Board (IRB) vid Indiana University.
OBS: Använd detta protokoll med njurnefrektomivävnad (upp till 2 cm i både X- och Y-måtten) som bevarats i den optimala skärtemperaturen (OCT) och lagrats vid -80 °C. Utför allt arbete på ett sätt som begränsar RNA-kontaminering, använd rena engångshandskar och en ansiktsmask. Se till att alla ytor är rena. Utrustningen för vilken detta protokoll optimerades är ett lasermikrodissekti...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

LMD-baserad transkriptomik är en användbar teknik som förankrar genuttryck till specifika områden i vävnaden. Grunden för denna teknik och dess potentiella tillämpning i njuren har beskrivits tidigare8. Optimering, modernisering och effektivisering av fluorescensbaserad dissekering som specifikt syftar till hög noggrannhet dissekering för nedströms RNA-sekvensering är dock mindre allestädes närvarande. Eftersom denna metod är rumsligt grundad i vävnaden, har den potential att avslö...

Tekniska framsteg när det gäller att studera vävnadsprover har förbättrat förståelsen för hälsotillstånd och sjukdom i olika organ. Sådana framsteg har understrukit att patologi kan börja i begränsade regioner eller i specifika celltyper, men har ändå viktiga konsekvenser för hela organet. Därför är det i den nuvarande eran av personlig medicin viktigt att förstå biologin på både cell- och regional nivå och inte bara globalt1. Detta gäller särskilt i njuren, som består av olika specialiserade celler och strukturer som differentiellt initierar och/ eller svarar på patologisk stress. Patogenesen vid olika typer av mänsklig njursjukdom är fortfarande inte väl förstådd. Att generera en metodik för att studera förändringar i genuttryck i specifika rörformiga segment, strukturer eller områden av interstitium i den mänskliga njuren kommer att förbättra förmågan att avslöja regionspecifika förändringar som kan informera om patogenesen vid sjukdom.
Mänskliga njurbiopsiprover är en begränsad och värdefull resurs. Därför bör teknik som förhör transkriptomik i njurvävnad optimeras för att spara vävnad. De tillgängliga metoderna för att studera transkriptomik på cell- och regional nivå inkluderar RNA-sekvensering med en cell (scRNaseq), RNaseq (snRNaseq), rumslig hybridisering på plats och lasermikrodissektion (LMD). Den senare är väl lämpad för exakt isolering av regioner eller strukturer av intresse inom vävnadssektioner, för nedströms RNA-sekvensering ochanalys 2,3,4,5. LMD kan antas för att förlita sig på identifiering av specifika celltyper eller strukturer baserade på validerade markörer med fluorescensbaserad avbildning under dissekering.
De unika egenskaperna hos lasermikrodissekretionsassisterad regional transkriptomik omfattar: 1) bevarandet av cellernas och struktureras rumsliga sammanhang, som kompletterar encellsteknik där celler identifieras med uttryck snarare än histologiskt; 2) Tekniken informerar och informeras av annan bildteknik eftersom en antikroppsmarkör definierar uttryckssignaturer. 3) Förmågan att identifiera strukturer även när markörer förändras i sjukdom; 4) påvisande av lågt uttryckta transkriptioner i cirka 20 000 gener; och 5) anmärkningsvärd vävnadsekonomi. Tekniken är skalbar för en njurbiopsi med mindre än 100 μm tjocklek av en kärna som är nödvändig för tillräckligt RNA-förvärv och möjliggör användning av arkiverad frusen vävnad, som är allmänt tillgängliga i stora databaser eller akademiskacentra 6.
I det efterföljande arbetet beskriver vi den regionala och bulk transcriptomics tekniken i detalj, optimerad med en ny snabb fluorescens färgning protokoll för användning med mänskliga njurvävnad. Den här metoden förbättrar klassiska LMD-utforskningar eftersom den tillhandahåller separata uttrycksdata för delsegmenten interstitium och nephron i motsats till aggregerade tubulointerstitiella uttryck. Här ingår de kvalitetssäkrings- och kontrollåtgärder som vidtagits för att säkerställa stringens och reproducerbarhet. Protokollet möjliggör visualisering av celler och regioner av intresse, vilket resulterar i tillfredsställande förvärv av RNA från dessa isolerade områden för att tillåta nedströms RNA-sekvensering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Genuttryck analys av mänskliga njurvävnad är ett viktigt verktyg för att förstå homeostas och sjukdom patofysiologi. Att öka upplösningen och djupet av denna teknik och utvidga den till cellnivån i vävnaden behövs. Även om användningen av enstaka nukleära och encelliga RNA-sekvensering har blivit utbredd, upprätthåller uttryckssignaturer av celler som erhållits från vävnadsdisociation inte rumsligt sammanhang. Laser microdissection (LMD) baserat på specifika fluorescerande markörer skulle tillåta isolering av specifika strukturer och cellgrupper av intresse med känd lokalisering, vilket möjliggör förvärv av rumsligt förankrade transkriptomic signaturer i njurvävnad. Vi har optimerat en LMD-metodik, styrd av en snabb fluorescensbaserad fläck, för att isolera fem distinkta fack i den mänskliga njuren och genomföra efterföljande RNA-sekvensering från värdefulla mänskliga njurvävnadsprover. Vi presenterar också kvalitetskontrollparametrar för att göra det möjligt att bedöma om de insamlade exemplaren är adekvata. Arbetsflödet som beskrivs i detta manuskript visar genomförbarheten av denna metod för att isolera subsegmentala transkriptionsbaserade signaturer med högt förtroende. Det metodologiska tillvägagångssätt som presenteras här kan också tillämpas på andra vävnadstyper med ersättning av relevanta antikroppsmarkörer.

Prover
Vi presenterar data från nio referens nephrectomies (3 exemplar erhålls vid Indiana University och 6 exemplar erhålls genom Kidney Precision Medicine Project), med hjälp av rapid fluorescence färgning protokoll för att isolera njure nephron segment och interstitiella områden. De avsnitt som används i denna process erhölls från avlidna njure givare eller opåverkade tumör nephrectomies. Dessa prover hade inte patologiska tecken på sjukdom som visualiserats i ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Vi beskriver ett protokoll för laser microdissektion av undersegment av den mänskliga njuren, inklusive glomerulus, proximala tubule, tjock stigande lem, samla kanalen och interstitium. RNA isoleras sedan från de erhållna facken och RNA-sekvensering utförs för att bestämma förändringar i den transkriptomiska signaturen inom varje delsegment.

Tillämpning av lasermikrodissektion för att upptäcka regional transkriptomik i mänsklig njurvävnad

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Microdissection av däggdjur

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolering från Cell Specifika Subpopulationer Använda Laser-capture Microdissection Kombinerat med Rapid immunomärkning

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) som ett verktyg för transkriptions Profilering av enskilda celltyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen Isolerad perfusion njure Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser Capture lokalt av högt rent trabekelverket från mus ögon för gen uttryck analys

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En laser Capture Microdissection protokoll som ger hög kvalitet RNA från färsk frysta mus ben

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Laser-Capture Microdissection RNA-sekvensering för rumsliga och temporala vävnadsspecifika genuttryck analys i växter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generering av humana njurslanguloider från vävnad och urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...