Name: delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound
Uploaded: 2020-07-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound at JoVE.com

Wir danken der Unterstützung durch den Nachlass von Dr. Clem Jones AO, dem National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], der Metal Foundation und der Regierung des Bundesstaates Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der University of Queensland genehmigt.
1. Eigene Mikroblasenaufbereitung
<ol><li>Wiegen Sie ein 9:1 molares Verhältnis von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) ab. Pro 1 ml Mikroblasenlösung werden 0,5 mg Lipidmischung benötigt. Alternativ können Lipide bereits in Chloroform gekauft werden, wenn mit vorgelösten Lipiden mit Schritt...

<ol>
	<li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer's+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound.">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li><li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer's+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound.">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).</li><li>Pandit, R., Chen, L., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+physiology+and+strategies+for+drug+delivery.">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).</li><li>Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+questions+for+Alzheimer's+disease+immunotherapy.">Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy.</a> Alzheimers Research &amp; Therapy. 6 (1), 3 (2014).</li><li>Nisbet, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+scanning+ultrasound+and+a+tau-specific+single+chain+antibody+in+a+tau+transgenic+mouse+model.">Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model.</a> Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).</li><li>Janowicz, P. W., Leinenga, G., G&#246;tz, J., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-mediated+blood-brain+barrier+opening+enhances+delivery+of+therapeutically+relevant+formats+of+a+tau-specific+antibody.">Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).</li><li>Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+ultrasound+removes+amyloid-beta+and+restores+memory+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+neural+stem+cells+to+the+brain+using+MRI-guided+focused+ultrasound+to+disrupt+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier.</a> PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-enhanced+intranasal+brain+delivery+of+brain-derived+neurotrophic+factor.">Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor.</a> Scientific Reports. 6, 28599 (2016).</li><li>Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+treatment+of+neurological+diseases+-+current+and+emerging+applications.">Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).</li><li>G&#246;tz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathogenesis+of+the+Tauopathies.">Molecular Pathogenesis of the Tauopathies.</a> Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).</li><li>Pandit, R., Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+ultrasound+treatment+of+tau+transgenic+mice+clears+neuronal+tau+by+autophagy+and+improves+behavioral+functions.">Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions.</a> Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).</li><li>Karakatsani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model.">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li><li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging.">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li></ol>

Fluoreszenzmarkierte Antikörper können mit fokussiertem Ultraschall zusammen mit Mikrobläschen, die in einem Scanning-Modus angewendet werden, an das Gehirn abgegeben werden. Antikörperabgabe, Mikrogliamorphologie und lysosomale Vergrößerung können durch Fluoreszenzmikroskopie nach Rasterultraschall nachgewiesen werden. Mikroglia können in ihren Lysosomen Antikörper und Antigene aufnehmen, an die die Antikörper in einem Fc-Rezeptor-vermittelten Prozess gebunden sind4.
<p class="jove_...

Therapeutischer Ultraschall ist eine aufstrebende Technologie, die darauf abzielt, Hirnerkrankungen auf nichtinvasive Weise zu behandeln, zum Teil durch Erleichterung des Zugangs von Therapeutika zum Gehirn1,2,3. Da nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, vom Gehirn aufgenommen und im Gehirn zurückgehalten werden4, bietet therapeutischer Ultraschall die Möglichkeit, ihre Aufnahme und ihr gezieltes Engagement zu erhöhen5,6.
In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) abgegeben wird. Um dies zu erreichen, wird Ultraschall durch den Schädel an mehreren Stellen in das Gehirn angewendet, wobei ein Scanning-Modus verwendet wird, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen7. Die mechanische Wechselwirkung zwischen der Ultraschallenergie, den intravenös injizierten Mikrobläschen und dem Gefäßsystem des Gehirns trennt vorübergehend die Engstellen der BHS in einem gegebenen Beschallungsvolumen, so dass Antikörper und andere Ladungen, einschließlich therapeutischer Wirkstoffe, diese Barriere effektiv überwinden können7,8,9 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Ultraschall die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen erleichtert, wo sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritischen Prozessen verteilt5,10.
Die Alzheimer-Krankheit ist durch eine Amyloid-β- und Tau-Pathologie gekennzeichnet11, und eine Vielzahl von Tiermodellen steht zur Verfügung, um pathogene Mechanismen zu sezieren und therapeutische Strategien zu validieren. Ein SUS-Ansatz, bei dem Ultraschall in einem sequentiellen Muster über das gesamte Gehirn angewendet wird, kann, wenn er über mehrere Behandlungssitzungen wiederholt wird, die Amyloid-Plaque-Pathologie im Gehirn von Amyloid-β-ablagernden Amyloid-Vorläuferprotein-mutierten Mäusen (APP) reduzieren und Mikroglia aktivieren, die das Amyloid aufnehmen, was zu einer Verbesserung der kognitiven Funktion führt7. Die BBB-Öffnung mit Ultraschall und Mikroblasen reduziert auch die Tau-Pathologie bei pR5, K3 und rTg4510 tau-transgenen Mäusen5,12,13. Während Mikroglia extrazelluläre Proteinablagerungen entfernen, ist einer der zugrunde liegenden Clearance-Mechanismen für intraneuronale Pathologien, die durch SUS induziert werden, die Aktivierung der neuronalen Autophagie12.
Hier skizzieren wir einen experimentellen Prozess, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt und dann mit hauseigenen lipidbasierten Mikrobläschen gemischt werden, gefolgt von einer retroorbitalen Injektion in anästhesierte Mäuse. Die retroorbitale Injektion ist eine Alternative zur Schwanzveneninjektion, die sich als ebenso wirksam und einfacher erwiesen hat, wiederholt durchzuführen. Unmittelbar danach wird SUS auf das Gehirn angewendet. Um die therapeutische Antikörperaufnahme zu bestimmen, werden Mäuse geopfert und die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn anschließend quantifiziert. Als Stellvertreter für die Veränderung der Homöostase des Gehirns wird die mikrogliale phagozytäre Aktivität durch Histologie und volumetrische 3D-Rekonstruktion bestimmt.
Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein potenziell attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist. Das Protokoll kann in ähnlicher Weise auf andere Arzneimittelkandidaten sowie auf Modellladungen wie fluoreszierend markiertes Dextrans definierter Größen angewendet werden14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880128C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1957GA</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter (Multisizer 4e)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>head holder (model SG-4N, Narishige Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>#8547008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflow flow solution</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared imaging system Odyssey Fc</td>
			<td>Licor</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octafluoropropane</td>
			<td>Arcadophta</td>
			<td>0229NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIPS (Therapy Imaging Probe System)</td>
			<td>Philips Research</td>
			<td>TIPS_007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound

Nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, wird vom Gehirn aufgenommen. Fokussierter Ultraschall bietet die Möglichkeit, die Aufnahme von Antikörpern und das Engagement durch vorübergehende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu erhöhen. In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die BHS abgegeben wird, begleitet von einer fokussierten Ultraschallanwendung durch den Schädel, der auf mehrere Stellen abzielt, ein Ansatz, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen. Die mechanische Wirkung von Mikroblasen und Ultraschall auf Blutgefäße erhöht den parazellulären Transport über die BHS, indem sie Tight Junctions vorübergehend trennt und die vesikelvermittelte Transzytose verbessert, so dass Antikörper und Therapeutika effektiv kreuzen können. Darüber hinaus erleichtert Ultraschall auch die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen, in denen sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritische Prozesse verteilt. In unseren Studien werden fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt, mit intern hergestellten lipidbasierten Mikroblasen gemischt und in Mäuse injiziert, unmittelbar bevor SUS auf das Gehirn aufgetragen wird. Anschließend wird die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn quantifiziert. Um Veränderungen in der normalen Homöostase des Gehirns zu berücksichtigen, kann die Mikroglia-Phagozytose als zellulärer Marker verwendet werden. Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist.

Mit diesem Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Antikörper an das Gehirn abgegeben und können zusammen mit der Mikroglia-Aktivierung nachgewiesen werden. Die Schlussfolgerung, die gezogen werden kann, ist, dass die Verwendung von fokussiertem Ultraschall und Mikroblasen die Aufnahme von Antikörpern im Gehirn deutlich verbessert und Antikörper an das gesamte Gehirn oder die Hemisphäre einer Maus abgeben kann, wenn sie in einem Scanning-Modus verwendet wird. Abbildung 1 zeigt das TIPS-Ul...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound at JoVE.com

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.

Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Forschung

Neurowissenschaften

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS<i&gt; über</i&gt; Die Arteria carotis interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...