Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

نحن ممتنون لسوزان ايمرسون لالتهاب الكبد E فيروس P6 استنساخ. تم توفير مصل الأرانب فرط المناعة الخاصة بHV بلطف من قبل راينر أولريش، معهد فريدريش لوفلر، ألمانيا. وعلاوة على ذلك، نشكر جميع أعضاء قسم علم الفيروسات الجزيئي والطبي في جامعة الرور بوخوم على دعمهم ومناقشتهم. تم إنشاء الأرقام 1-7 مع BioRender.com.

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة التجارب تحت شرط BSL-2. يجب أن تشطف جميع المواد التي تحصل على اتصال مع فيروس التهاب الكبد E RNA أو الفيروس المعدي بشكل صحيح مع 4٪ كوهرسولين FF من حاوية النفايات داخل غطاء محرك السيارة قبل التخلص منها.
1- إعداد بلاسميد
<ol><li>تلقيح 200 مل LB المتوسطة التي تحتوي على 100...

بدءا من إعداد البلازميد، ينبغي أن تتجاوز غلة الحمض النووي 150 نانوغرام/ميكرولتر لتكون قادرة على إجراء خطية متعددة من نفس المخزون البلازميد، مما يقلل من خطر الطفرات الناجمة عن البكتيريا من تسلسلات الجينوم الحاسمة. وعلاوة على ذلك، من المهم للتحقق من خلاصة تقييد لplsmid الخطية كاملة بواسطة جل ele...

التهاب الكبد E هو مرض أقل من الواقع إلى حد ما مع تزايد انتشاره في جميع أنحاء العالم. حوالي 20 مليون إصابة تؤدي إلى أكثر من 70،000 حالة وفاة سنويا1. تم إعادة تعيين العامل الكامن، فيروس التهاب الكبد E (HEV)، مؤخرًا، وهو الآن مصنف داخل Hepeviridae العائلية بما في ذلك فيروس جينيرا أورثوبي وفيروس بيستشيهيبي. يتم تصنيف HEV من أصول مختلفة ضمن الأنواع Orthohepevirus A-D بما في ذلك عزل عن البشر والخنازير والأرانب والجرذان والطيور والثدييات الأخرى2. في الوقت الحاضر، تم تحديد ثمانية أنواع جينية مختلفة (GT) من فيروس الحمض النووي الريبي الإيجابي الموجه، الذي تقطعت به السبل واحد2. وعلى الرغم من اختلافها في هوية تسلسلها وطرق نقلها وتوزيعها الجغرافي، إلا أن هيكلها الجيني يحافظ عليه بدرجة عالية. أكثر تحديدا، 7.2 كيلو بايت 10000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بينما ORF1 ترميز جميع الإنزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الناجح داخل الخلية المضيفة، ORF2 ترميز البروتين capsid، والبروتين ORF3 تعمل كقناة أيون وظيفية مطلوبة للتجميع وإطلاق الجزيئات المعدية3. مرة واحدة أطلقت في التجويف القاعدية أو apical HEV موجود في كل من, شبه مظلومة والأنواع غير مغلفة / عارية اعتمادا على ما إذا كان الفيروس ينشأ من الدم أو البراز, على التوالي4,5.
في حين أن GT1 و GT2 توجدان بشكل رئيسي في البلدان النامية تصيب البشرفقط 6 عبر الطريق الفموي البرازي ، فإن GT3 و GT4 و GT7 تحدث بشكل رئيسي في البلدان المتقدمة1،7 مع مجموعة متنوعة من الأنواع التي تخدم كمكامن ، على سبيل المثال، الخنازير8، الجرذ9، الدجاج10،11، الغزلان12، النمس 13 ، الخفافيش14، الأرانب15،16، الخنزير البري17 والعديد من أكثر7،18،19، تقديم أدلة على zoonosis7،1320،21،22. بالإضافة إلى الظروف الصحية غير كافية23 والمنتجات الغذائية الملوثة12,24,25,26, انتقال عن طريق نقل الدم وزرع الأعضاء هو أيضا ممكن27,28. HEV هو سبب شائع لتليف الكبد وفشل الكبد29 خاصة في المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الموجودة من قبل ، والأفراد المناعيين (النمط الجيني 3 و 4 و 7) والنساء الحوامل (النمط الجيني 1). ملاحظة، وهناك أيضا مظاهر خارج الكبد مثل مرض الدم30،31،32، الاضطرابات العصبية33 والإصابات الكلوية34.
حتى الآن, خارج التسمية المخدرات ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل بالنسبة للعديد من المرضى المصابين35,36. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن حالات فشل في العلاج وضعف النتائج السريرية على المدى الطويل. وقد تم ربط فشل العلاج إلى الطفرات الفيروسية وزيادة التجانس الفيروسي في المرضى المصابين بشكل مزمن37,38,39. على العكس من ذلك، لم تكن دراسة متعددة المراكز الأوروبية بأثر رجعي الأخيرة قادرة على ربط طفرات البوليميراز بفشل العلاج RBV40. في الملاحظات السريرية والتجارب في المختبر, إنترفيرون41,,42,,43, sofosbuvir44,45, أملاح الزنك46 و silvestrol47,,48 كما أظهرت آثار مضادة للفيروسات. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لـ HEV لا يزال يتعين العثور عليه، ويعيقه نقص المعرفة حول دورة حياة HEV والعوامل المسببة للمرض. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى نظام قوي لثقافة الخلايا للدراسات الفيروسية وتطوير أدوية جديدة مضادة للفيروسات49.
لسوء الحظ، مثل فيروسات التهاب الكبد الأخرى، من الصعب نشر HEV في خطوط الخلايا التقليدية وعادة ما يتقدم ببطء شديد مما يؤدي إلى انخفاض الأحمال الفيروسية. ومع ذلك، كانت بعض المجموعات قادرة على زيادة الأحمال الفيروسية من خلال توليد من خلية خط subclones50 أو تعديل وسائل الاعلام ملاحق51. في الآونة الأخيرة جيل استنساخ cDNA52 والتكيف مع عزل المريض الابتدائي عن طريق passaging53،54 مزيد من تحسين انتشار HEV في خلية ثقافة55. في هذا البروتوكول، استخدمنا جينوم ثقافة الخلية تكييف Kernow-C1 سلالة (يشار إليها باسم p6_WT)54 وسلالة متحولة إيواء طفرة تعزيز النسخ المتماثل (يشار إليها باسم p6_G1634R)37. Kernow-C1 هو السلالة الأكثر استخداما في ثقافة الخلية HEV وقادرة على إنتاج الأحمال الفيروسية العالية. من خلال تقييم أعداد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي ، يمكن رصد النسخ المتماثل HEV في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تسمح بتقييم عدد الجسيمات المعدية التي يجري إنتاجها. لذلك، أنشأنا تلطيخ مناعيا لتحديد وحدات تشكيل التركيز (FFU / مل).
يمكن استخدام الطريقة56 الموصوفة هنا لإنتاج جزيئات فيروسية معدية كاملة الطول قادرة على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط خلايا الثدييات. هذا هو شرط أساسي لفك الجوانب الهامة من العدوى HEV وtropism. ليست هناك حاجة لللقح مع عزل المريض عادة محدودة. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا حصر له، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة بالمقارنة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النظام لعلم الوراثة العكسية تمكين دراسة في تحوي تغير الجينوم المحدد وتأثيرها على تكرار HEV واللياقة البدنية. هذه التقنية تتغلب على العديد من القيود ، ويمكن أن المسار الطريق لتطوير المخدرات ، والدراسات المطفرة وتقييم التفاعلات استقبال الفيروس مثل العوامل المقيدة أو الدخول.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

فيروس التهاب الكبد E هو السبب الرئيسي لتليف الكبد وفشل الكبد مع زيادة انتشاره في جميع أنحاء العالم. وينتقل فيروس الحمض النووي الريبي الوحيد في الغالب عن طريق نقل الدم، والظروف الصحية غير الملائمة، والمنتجات الغذائية الملوثة. حتى الآن من خارج التسمية دواء ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل لكثير من المرضى. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لمعالجات الـ HEV التي لا يزال يتعين تحديدها. حتى الآن، وقد أعاقت بشدة المعرفة حول دورة حياة HEV و pathogenesis بسبب عدم وجود نظام فعال لثقافة الخلايا HEV. نظام قوي لثقافة الخلية ضروري لدراسة دورة الحياة الفيروسية التي تشمل أيضا الإمراض الفيروسية. مع الأسلوب الموصوف هنا يمكن للمرء أن ينتج ال titers الفيروسية تصل إلى 3 × 106 وحدة التركيز تشكيل / مل (FFU / مل) من غير مغلفة HEV وما يصل إلى 5 × 104 FFU / مل من HEV مغلفة. باستخدام هذه الجسيمات، فمن الممكن أن تصيب مجموعة متنوعة من الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية والإنسان، فضلا عن خطوط الخلايا الحيوانية. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا نهائي، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة للغاية.

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف إنتاج عالية تيتر المعدية HEVcc. الخطوة الأولى هي عزل الحمض النووي plasmid (pBluescript_SK_HEVp654 و pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37، الشكل 8a) ، والتي هي بعد ذلك خطية عن طريق الهضم تقييد وتنقيت للنسخ في المختبر (الشكل 1). ويمكن التحقق من ا...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

وصف هنا هو وسيلة فعالة على كيفية إنتاج ارتفاع الأسهم تتر الفيروسية من فيروس التهاب الكبد E (HEV) لتصيب خلايا الورم الكبدي بكفاءة. مع طريقة عرض، سواء غير مغلفة، وكذلك الجسيمات الفيروسية المغلفة يمكن حصادها واستخدامها في تلقيح خطوط الخلايا المختلفة.

نموذج ثقافة الخلية لإنتاج ارتفاع الأسهم فيروس التهاب الكبد Titer E

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

وقد أعاق أبحاث فيروس التهاب الكبد E عدم وجود نظام فعال لثقافة الخلايا. تقنياتنا التغلب على هذه القيود تمهيد الطريق لتصميم المخدرات وتطوير اللقاحات. مع هذا البروتوكول، ونحن قادرون على إنتاج الفيروسات عالية الاتر المعدية من كل من غير المغلف والجسيمات HEV المغلف، مما يسهل العدوى من مجموعة متنوعة من الخلايا.يتطلب تنفيذ هذا البروتوكول الوصول إلى مرفق BSA-2 والخبرة في تقنيات زراعة الخلايا الأساسية. لتكييف الحمض النووي البلازمي ، اخلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي للقالب مع 10 ميكرولترات من العازلة واثنين من ميكروليترس إنزيم تقييد luteus وضبط الحجم النهائي إلى 100 ميكرولترات مع الماء. ثم احتضان الحل لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وتأكيد الخطية من البلازميد بواسطة agarose هلام electrophoresis وفقا للبروتوكولات القياسية.بعد عزل الحمض النووي plasmid والخطية، يمكن التحقق من نجاح الخطية من خلال مقارنة الحمض النووي البلازميد غير هضم إلى الحمض النووي plasmid هضم بواسطة جل electrophoresis. للنسخ في المختبر من الحمض النووي النقي، كامل طول التهاب الكبد E، مزيج اثنين من ميكروغرام من قالب الحمض النووي الخطي مع الكواشف المناسبة واستخدام نواة خالية من المياه لتحقيق الحجم النهائي للحل إلى 100 ميكرولترات. بعد خلط شامل، احتضان الحل لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.بعد ساعتين، إضافة اثنين من microliters إضافية من T7 RNA البوليميراز إلى الأنبوب. ثم اخلطي رد الفعل وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، هضم قالب الحمض النووي الأولي مع 7.5 ميكرولترات من DNAs مع خلط شامل واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.بعد الاستخراج، تحقق بعناية من سلامة الحمض النووي الريبي والعائدة بواسطة agarose هلام electrophoresis وفقا للبروتوكولات القياسية. في حالة انخفاض RNAs الزهد، ينبغي ملاحظة نطاقات متميزة، بدلا من تشويه غير واضح. بعض الخطوات تتطلب التنفيذ السريع، وبالتالي إعداد شامل.أيضا، إيلاء اهتمام خاص لسلامة RNA وقابلية الخلية. لإعداد خلايا سرطان الكبد البشرية لإنتاج فيروس التهاب الكبد E المشتق من ثقافة الخلايا ، بذور الخلايا في 20 ملليلتر من DMEM كاملة على طبق ثقافة الكولاجين المغلفة 15 سنتيمترا واحتضان في 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 90 ٪ التقاء. في نهاية الثقافة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل فصلها من لوحة ثقافة الخلية مع ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية.resuspend الخلايا المنفصلة في 10 ملليلتر من DMEM كاملة ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للعد. نقل خمس مرات 10 إلى الخلايا الست إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا مرتين مع 35 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، ضع الخلايا على الجليد دون إزالة المابير.لكهربية الخلايا المستهدفة, تكملة 384 ميكرولترات من cytomix مع اثنين من المليمولار ATP وخمسة الجلوتاثيون مليمولار, ثم تخزين على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. استبدال بعناية supernatant مع كامل 400 ميكرولترات من الحل. إضافة خمسة ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي الفيروسي المنقى إلى الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى cuvette أربعة ملليمتر للكهربة في 975 microfarad و 270 فولت لمدة 20 مللي ثانية.بعد الكهربة، استخدم ماصة باستور لنقل الخلايا في أسرع وقت ممكن إلى 11 ملليلتر من DMEM كاملة والبذور 10 ملليلتر من الخلايا الكهروبروميد في طبق ثقافة 10 سم المغلفة مع الكولاجين. بعد ذلك، أضف 1.3 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة في 300 ميكرولترات من المتوسط بالتساوي على زلة غلاف في بئر واحدة من لوحة 24 ميكروتيات المغلفة بالكولاجين ووضع الطبق والطبق في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المابير في الطبق بـ 10 ملليلتر من DMEM الطازجة واعيد الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ستة أيام إضافية.في اليوم الخامس إلى السابع، اعتمادا على كثافة الخلية، إجراء تلوين مناعي من التحكم في transfection للسماح بحساب عدد الخلايا التي تعبر عن البروتين المستهدف من الفائدة تطبيع إلى العدد الإجمالي للخلايا. يمكن رصد الكهربة الناجحة عن طريق تلطيخ الفلوروست المناعية للتحكم في التواليف. وينبغي أن تتجاوز كفاءة transfection 40 ٪ A استنساخ متحولة ناقصة يمكن أن تكون بمثابة سيطرة سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ.لحصاد جزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، في اليوم السادس، قم بفرز السائل الخارق من خلال شبكة ميكرولتر 0.45 لإزالة أي حطام خلية وتخزين فيروس التهاب الكبد E المشتق من الخلايا خارج الخلية المحصّل عند أربع درجات مئوية. بالنسبة للحصاد الناتج عن الخلايا بين الخلايا، جزيء التهاب الكبد E، قم بغسل الخلايا باستخدام PBS وفصل الخلايا بـ 1.5 ملليلتر بنسبة 0.05٪ لتربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية. عندما تكون الخلايا منفصلة، ووقف رد فعل مع 8.5 ملليلتر من DMEM ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر للطرد المركزي.إضافة 1.6 ملليلتر من DMEM كاملة متوسطة perporation الفردية اثنين من المليلتر ردود الفعل أنابيب واستخدام 800 ميكرولترات من المتوسطة ل resuspend الخلايا، وبالتالي نقل الخلايا إلى الأنابيب. تجميد الخلايا في النيتروجين السائل، وبعد ذلك ذوبان الخلايا على الجليد ثلاث مرات قبل سرعة عالية الطرد المركزي لlysates الناتجة لمدة 10 دقائق في 10، 000 مرات ز. ثم نقل super في أنابيب جديدة دون إزعاج الكريات حطام الخلية للتخزين ناقص 80 درجة مئوية.لتقييم الارتداء من الأسهم فيروس التهاب الكبد E داخل الخلايا المنتجة حديثا وخارج الخلايا، البذور مرتين 10 إلى الخلايا الأربع لكل 100 ميكرولتر من MEM في البئر في 60 آبار مركز من لوحة 96-جيدا المغلفة الكولاجين microtiter وملء الآبار الخارجية مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في البئر. بعد 24 ساعة في 37 درجة مئوية، إضافة 50 ميكرولترات من الجسيمات خارج الخلية فيروس عظمى إلى الصف الأول من الخلايا. بعد خلط دقيق، بشكل تسلسلي تخفيف محتويات البئر ست مرات في تركيز واحد إلى ثلاثة في بئر عن طريق نقل 50 ميكرولترات من ااسخدام من السابق إلى الصف التالي من الخلايا في مكررة حتى الصف الأخير من الخلايا.لتصيب الخلايا مع الخلايا داخل الخلايا المشتقة من جسيمات فيروس التهاب الكبد E، إضافة 25 ميكرولترات من الجسيمات الفيروس داخل الخلايا supernatant إلى الصف العلوي من الخلايا ومزيج جيدا قبل تخفيف المسلسل الخلايا ست مرات بنسبة واحد إلى خمسة مع 25 ميكرولترات من التخفيف في مكررة كما هو موضح. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام قبل تلطيخ الفلورات المناعية وفقًا للبروتوكول في المخطوطة. بعد الحضانة والتلطيخ المناعي، يمكن تحليل اللوحات باستخدام المجهر المناعي.بعد المناعة يمكن حساب اللتيتر النهائي للجسيمات داخل الخلية وخارج الخلية باستخدام الصيغة المناسبة على النحو المشار إليه. بعد إصابة الخلية المستهدفة مع جزيئات فيروس E المشتقة من ثقافة الخلية عن طريق التخفيف التسلسلي ، يمكن توقع الارتداء بين مرة واحدة 10 إلى 10 × 10 إلى وحدات تشكيل التركيز الست لكل ملليلتر من ثقافات الخلايا المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد الوبائي E المشتقة من الخلايا غير المغلفة. في الثقافات المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، من المتوقع أن تتراوح نسبة الإصابة بين 10 مرات إلى الثانية و10 مرات إلى وحدات التركيز الرابعة لكل ملليلتر.وبالإضافة إلى ذلك، فإن النسبة بين نسخ الجينوم وجزيئات الفيروس المعدية داخل الخلايا غير المغلفة هي عادة أقل من تلك التي لوحظت بالنسبة للثقافات المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، مما يشير إلى وجود إصابة إصابة أعلى تحديداً لأنواع فيروس التهاب الكبد E غير المغلفة. ويتطلب إنتاج الجسيمات الفيروسية والعدوى المستهدفة للخلايا دورة حياة فيروسية كاملة، ويمكن أن يوفر رؤى جديدة للتفاعلات بين مضيفي الفيروسات. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتنفيذ حركية النسخ المتماثل أو لإنتاج الجسيمات التي يمكن استخدامها في مقايسات العدوى.يعتمد معظم أبحاثنا حاليًا على الجسيمات المعدية ، سواء في HEV المغلفة وغير المغلفة. والمقالات التي تستخدم تقنياتنا يتم نشرها حاليا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

خط خلية التتراسيكلين التنظيم وتنتج ناقلات lentiviral عالي عيار التي تستهدف على وجه التحديد خلايا الجذعية

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...