Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
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我们感谢苏珊娜·艾默生对E型肝炎病毒p6克隆。HEV特异性兔高免疫血清由德国弗里德里希·勒夫勒研究所的雷纳·乌尔里希提供。此外，我们感谢波鸿鲁尔大学分子和医学病毒学系的所有成员的支持和讨论。图1-7是用BioRender.com。

注：所有实验在BSL-2条件下进行。所有与E型肝炎病毒RNA或传染性病毒接触的材料，在处置前，必须用4%的Kohrsolin FF从烟罩内的废物容器中正确冲洗。
1. 质粒制备
<ol><li>接种含有100μg/mL安皮西林的200 mL LB介质，用转化的Escherichia大肠杆菌JM109加入全长 HEV gtnow-C1p6 序列的质粒编码 （pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54或 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37）.在...

从质粒制备开始，DNA产量应超过150纳克/μL，以便能够从同一质粒存量进行多重线性化，从而最大限度地降低关键基因组序列由细菌引起的突变的风险。此外，通过凝胶电泳检查完全质粒线性化的限制摘要（图8b）也很重要。缺乏线性质粒DNA会导致滚动圆扩增，导致体外转录效率降低。此外，应确认RNA完整性，以评估样品中RNA酶的丰度（图8c）。只有这?...

E型肝炎是一种被低估的疾病，全世界患病率正在上升。每年约有2000万人感染，导致7万多人死亡。基础代理，E型肝炎病毒（HEV），最近被重新分配，现在被归入家族赫佩维利达，包括基因正畸病毒和皮西赫佩病毒。各种起源的HEV被分类在物种正畸病毒 A-D 包括从人类，猪，兔子，大鼠，鸟类和其他哺乳动物的分离2。目前，8种不同基因型（GT）的正向型、单链RNA病毒已发现2种。虽然它们的序列特征、传播途径和地理分布不同，但它们的基因组结构却高度保守。更具体地说，7.2 kbp HEV基因组分为3个主要的开放读取帧（ORF1-3）。ORF1对宿主细胞内成功复制所需的所有酶进行编码，ORF2对帽状蛋白进行编码，ORF3蛋白作为组装和释放传染性颗粒所需的功能离子通道。一旦被释放到基础或全息流明HV存在于两个，准病毒和非包络/裸种，取决于病毒是否来自血液或粪便，分别4,4，5。
虽然GT1和GT2主要发现在发展中国家只感染人类6通过粪便-口腔路线，GT3，GT4和GT7主要发生在发达国家1，77与各种物种作为1水库， 例如，猪8，大鼠9，鸡10，11，10,11鹿12，驼鹿13，蝙蝠14，兔子15，16，,16野猪17和更多,7，18，19，,19提供动物病7，20，21，22,21,的证据。7,除了卫生条件差23种和受污染的食品,,12、24、25、26，25,通过输血和器官移植传播的1224食品也有27种、28,种。HEV 是肝硬化和肝衰竭的常见原因29，特别是对于预先存在的肝病患者、免疫功能低下的个人（基因型 3、4 和 7）和孕妇（基因型 1）。值得注意的是，也有肝外表现，如造血病30，31，32，,32神经紊乱33和肾损伤34。30,
迄今为止，标签外药物利巴韦林（RBV）是许多感染患者的首选治疗35，36。35,36然而，治疗失败和临床长期效果不佳的病例已经报告。治疗失败与病毒突变和慢性感染患者37，38，39,的病毒异质性增加有关。相反，最近欧洲的回顾性多中心研究未能将聚合酶突变与RBF治疗失败40相关。在临床观察和体外实验中，干扰素41、42、43、索福斯布韦41,42,4344、45、,45锌盐46和硅酸盐47、48也显示出抗47,48病毒作用。然而，由于对 HEV 生命周期及其发病机制缺乏了解，仍有待发现特定的 HEV 治疗。因此，迫切需要一个强大的细胞培养系统进行病毒学研究和开发新的抗病毒药物。
不幸的是，与其他肝炎病毒一样，HEV很难在常规细胞系中传播，而且通常进展非常缓慢，导致病毒负荷低。然而，一些组能够通过生成细胞系子球50或调整介质补充剂51来促进病毒负荷。最近cDNA克隆52的生成和原发性患者通过传世53、54的适应，进一步改善了细胞培养中的 HEV 传播55。在该协议中，我们使用细胞培养的基因组适应Kernow-C1菌株（称为p6_WT）54和含有复制增强突变（称为p6_G1634R）37的突变株。Kernow-C1 是 HEV 细胞培养中最常用的菌株，能够产生高病毒载量。通过评估病毒RNA拷贝数，可以进行体外监测的 HEV 复制。然而，这些技术不允许评估产生的传染性颗粒的数量。因此，我们建立了免疫荧光染色，以确定焦点成形单位（FFU/mL）。
此处描述的方法56可用于产生全长传染性病毒颗粒，这些颗粒能够感染各种细胞类型，包括原发细胞和哺乳动物细胞系。这是破译 HEV 感染和tropism 的重要方面的基本先决条件。无需接种通常有限的患者隔离。来自质粒的传染性 HEV 颗粒的产生构成了一个无限的来源，这使得该协议具有相当的效率。此外，该系统可用于反向遗传学，使研究体内识别的基因组改变及其对 HEV 复制和健身的影响。该技术克服了许多限制，可以路径的药物开发，突变研究和评估病毒宿主相互作用，如限制或进入因素。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

E型肝炎病毒是肝硬化和肝衰竭的主要原因，全球患病率呈上升趋势。单链RNA病毒主要通过输血、卫生条件差和受污染的食品传播。迄今为止，标签外药物利巴韦林（RBV）是许多患者的首选治疗。尽管如此，特定的 HEV 治疗仍有待确定。到目前为止，由于缺乏有效的 HEV 细胞培养系统，有关 HEV 生命周期和发病机制的知识受到严重阻碍。一个强大的细胞培养系统对于研究病毒生命周期至关重要，其中也包括病毒发病机制。与这里描述的方法，可以产生病毒滴答声高达3 x 106焦点形成单位/mL （FFU/mL） 的非包络 HEV 和高达 5 x 104 FFU/mL 的包络 HEV。使用这些粒子，可以感染各种不同来源的细胞，包括原细胞和人类，以及动物细胞系。来自质粒的传染性 HEV 颗粒的产生构成了一个无限的来源，这使得该协议非常有效。

在该协议中，我们描述了高滴度传染性 HEVcc 的生产。第一步是分离质粒DNA（pBluescript_SK_HEVp654和pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37，图8a），然后通过限制消化线性化，并纯化为体外转录（图1）。通过使用凝胶电泳将非消化质粒DNA与消化质粒DNA进行比较，可以验证成功的线性化。除了大小移位外，只有一个 DNA 波段应可见，表示?...

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A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

本文介绍，如何产生E型肝炎病毒（HEV）的高病毒滴度库存，以有效感染肝细胞的有效方法。通过提出的方法，可以收获非包络和包络病毒颗粒，并用于接种各种细胞系。

生产高滴度性乙型肝炎病毒库的细胞培养模型

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

由于缺乏有效的细胞培养系统，E型肝炎病毒研究受到阻碍。我们的技术克服了这些限制，为药物设计和疫苗开发铺平道路。通过该协议，我们能够产生传染性高滴度病毒的非包络和包络HV颗粒，促进各种细胞的感染。执行此协议需要访问 BSA-2 设施，并体验基本的细胞培养技术。要使质粒DNA线性化，将10微克的模板DNA与10微升缓冲液和两微升微升的微球蛋白酶混合，将最终体积与水一起调节至100微升。然后在37摄氏度下孵育溶液一小时，并按照标准协议通过阿加罗斯凝胶电泳确认质粒的线性化。在质粒DNA分离和线性化后，通过凝胶电泳将非消化质粒DNA与消化质粒DNA进行比较，验证线性化的成功。对于纯化的全长E型肝炎病毒DNA的体外转录，将线性DNA模板的两微克与适当的试剂混合，并使用无核水将溶液的最终体积达到100微升。经过彻底混合后，在37摄氏度下孵育溶液两小时。两小时后，在管中再加入两升T7RNA聚合酶。然后混合反应，在37摄氏度下孵育管子两个小时。在孵育结束时，用7.5微升DNA消化初始DNA模板，彻底混合并孵育37摄氏度30分钟。萃取后，根据标准方案，仔细检查由阿加罗斯凝胶电泳的RNA完整性和产量。在低RNA的显著性的情况下，应观察到不同的波段，而不是模糊的污迹。有些步骤需要快速执行，因此需要周密的准备。此外，特别注意RNA的完整性和细胞的生存能力。为准备人类肝癌细胞进行细胞培养衍生的E型肝炎病毒的产生，将20毫升全DMEM细胞播种到15厘米胶原蛋白涂层培养皿上，并在37摄氏度下孵育，直到达到90%。培养结束时，用10毫升PBS清洗细胞，然后用3毫升0.05%的三毫升在37摄氏度下将其从细胞培养板中分离出来。将分离的细胞重新放入10毫升完整的DMEM中，将细胞转移到50毫升的圆锥管中进行计数。将5乘10转移到6个细胞中，将新的50毫升管中，每次洗涤用35毫升PBS清洗细胞两次。第二次洗涤后，将细胞放在冰上，而不去除上经剂。对于目标细胞的电穿孔，补充384微升的细胞混合与2毫摩尔ATP和5毫摩尔谷胱甘肽，随后储存在冰上，直到进一步使用。小心地用整个 400 微升溶液更换上一杯。将五微克纯化病毒基因组RNA加入细胞中，将细胞悬浮液转移到4毫米的奎弗特中，在975微法拉德和270伏特的电穿孔下进行20毫秒的电穿孔。电穿孔后，使用巴斯德移液器将细胞尽快转移到11毫升完整的DMEM，将10毫升电穿孔细胞的种子转化为涂有胶原蛋白的10厘米培养皿。接下来，在300微升介质中，将1.3倍10添加到第五细胞中，均匀地添加到胶原蛋白涂层的24微蒂板的一口井中，并将盘子和盘子放在细胞培养培养箱中24小时。第二天，用10毫升的新鲜DMEM代替菜中的上一代，将该菜返回细胞培养箱，再用6天。第5至第7天，根据细胞密度，对转染控制进行免疫荧光染色，以便计算表达目标蛋白质的细胞数量，这些细胞与细胞总数正常化。通过转染控制的免疫荧光染色，可以监测成功的电穿孔。转染效率应超过40%复制缺陷突变体可作为负对照，以确认染色的特异性。为了收获细胞外培养源性E型肝炎病毒颗粒，在第六天，通过0.45微升网过滤上清液，清除任何细胞碎片，并在4摄氏度下储存收获的细胞外培养物衍生E型肝炎病毒。对于细胞内培养源性乙型肝炎病毒颗粒的收获，用PBS清洗细胞，并在37摄氏度下用1.5毫升0.05%的三辛-EDTA分离细胞。当细胞分离时，停止与8.5毫升DMEM的反应，将细胞悬浮液转移到50毫升管中进行离心。将1.6毫升的DMEM完整介质加入单个两毫升反应管，并使用800微升的介质重新给细胞，从而将细胞转移到管中。将细胞冷冻在液氮中，随后在冰上解冻细胞三次，然后高速离心产生的 10 分钟，达到 10，000 倍 g。然后将超自然物转移到新管中，而不会干扰细胞碎片颗粒，以储存零下80摄氏度。为了评估新生产的内、细胞外E病毒库的滴答声，将每100微升 MEM 的滴定剂种子 2 倍至每 100 微升 MEM 的 4 个细胞，放入胶原蛋白涂层的 96 孔微滴板的 60 个中心井中，并在最外层井中每井填充 100 微升 PBS。在37摄氏度的24小时后，在第一排细胞中加入50微升细胞外病毒颗粒上流。彻底混合后，通过将50微升上清液从上一排转移到下一排细胞，直到最后一排细胞，以每井一到三浓度连续稀释井内六次。要用细胞内细胞培养源性乙型肝炎病毒颗粒感染细胞，在细胞顶部行中加入25微升细胞内病毒颗粒上，并混合在细胞上，然后以一比五的比例连续稀释细胞六次，重复稀释25微升。然后根据手稿中的规程，将板放在细胞培养培养箱中七天，然后进行免疫荧光染色。在孵育和免疫染色后，可以使用免疫荧光显微镜分析板材。免疫后，可以使用相应的公式计算细胞内和细胞外颗粒的最终滴度。靶细胞感染细胞培养源性E病毒颗粒后，通过连续稀释，奶嘴在1倍10至第5至3倍至10至每毫升6个焦点形成单位之间，可预期从细胞培养物感染非包膜细胞培养源性E病毒颗粒。在感染包膜细胞培养源性乙型肝炎病毒颗粒的培养物中，预计每毫升1倍10至2倍和第四焦点形成单位之间的滴答声。此外，基因组拷贝与非包膜内感染病毒颗粒的比例通常低于观察到的细胞外细胞培养源性E型肝炎病毒颗粒感染培养物的比例，表明非包膜E病毒物种的特定感染率较高。病毒颗粒产生和靶向细胞感染需要一个完整的病毒生命周期，并且可以提供病毒宿主相互作用的新见解。该协议可以修改以执行复制动力学或生成可用于感染测定的粒子。我们目前的主要研究依赖于传染性颗粒，无论是包络的，也是非包络的 HEV。目前，使用我们技术的文章正在发布中。

Research

JoVE Journal

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科研

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流感病毒的高通量检测方法

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Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

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An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

原发性鸡初囊-细胞培养模型研究传染性囊内病病毒发病机制

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...