Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Suzanne Emerson for hepatitis E-virus p6 klon. HEV-specifik kanin hyperimmune serum blev venligt leveret af Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Desuden takker vi alle medlemmer af Institut for Molekylær og Medicinsk Virologi ved Ruhr Universitet Bochum for deres støtte og diskussion. Figur 1-7 blev genereret med BioRender.com.

BEMÆRK: Alle eksperimenter udføres under BSL-2-tilstand. Alle materialer, der kommer i kontakt med Hepatitis E-virus RNA eller infektiøs virus skal skylles ordentligt med 4% Kohrsolin FF fra en affaldsbeholder inde i emhætten før bortskaffelse.
1. Plasmid præparat
<ol><li>Podning 200 ml LB medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin med omdannet Escherichia coli JM109 indarbejde en plasmid kodning for fuld længde HEV gt3 Kernow-C1p6 sekvens (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]<sup ...

Begyndende med plasmidpræparatet bør DNA-udbyttet overstige 150 ng/μL for at kunne udføre flere lineariseringer fra samme plasmidbestand, hvilket minimerer risikoen for bakterieinduceret mutagenese af afgørende genomsekvenser. Desuden er det vigtigt at kontrollere begrænsningen fordøje for den komplette plasmid linearisering ved gel elektroforese (Figur 8b). En mangel på lineariseret plasmid DNA ville fremkalde rullende cirkel forstærkning forårsager in vitro transskription at vær...

Hepatitis E er en temmelig undervurderet sygdom med stigende prævalens på verdensplan. Omkring 20 millioner infektioner resultere i mere end 70.000 dødsfald om året1. Den underliggende agent, Hepatitis E virus (HEV), blev omfordelt for nylig og er nu klassificeret i familien Hepeviridae herunder slægterne Orthohepevirus og Piscihepevirus. HEV af forskellig oprindelse er klassificeret inden for arten Orthohepevirus A-D, herunder isolater fra mennesker, svin, kaniner, rotter, fugle og andre pattedyr2. På nuværende tidspunkt er otte forskellige genotyper (GT) af den positivtorienterede, enkeltsnørede RNA-virus blevet identificeret2. Selv om de er forskellige med hensyn til deres sekvensidentitet, transmissionsveje og geografiske fordeling, bevares deres genomiske struktur i høj grad. Mere specifikt er 7,2 kbp HEV-genomet opdelt i 3 større åbne læserammer (ORF1-3). Mens ORF1 koder alle enzymer, der er nødvendige for en vellykket replikation i værtscellen, koder ORF2 kapsidproteinet, og ORF3-proteinet fungerer som en funktionel ionkanal, der kræves til samlingog frigivelse af infektiøse partikler 3. Når frigivet i basal eller apical lumen HEV findes i både, quasienveloped og ikke-indhyllet / nøgne arter, afhængigt af om virus stammer fra blod eller afføring, henholdsvis4,5.
Mens GT1 og GT2 hovedsageligt findes i udviklingslandene udelukkende inficere mennesker6 via fækal-oral rute, GT3, GT4 og GT7 overvejende forekommer i de udviklede lande1,7 med en række arter, der tjener som reservoirer, f.eks.svin 8, rotte9,kylling 10,,11,hjorte 12,desmerdyr13,bat14,kanin 15,,16,vildsvin 17 og mange flere7,18,19, som viser zoonose7,20,21,22. Ud over utilstrækkelige sanitæreforhold 23 og kontamineredefødevarer 12,24,25,26er overførsel via blodtransfusion og organtransplantation også mulig27,28. HEV er en almindelig årsag til skrumpelever og leversvigt29, især hos patienter med allerede eksisterende leversygdom, immunkompromitterede personer (genotype 3, 4 og 7) og gravide kvinder (genotype 1). Bemærk, at der også er ekstrahepatiske manifestationer såsom hæmatopoietisk sygdom30,,31,,32, neurologiske lidelser33 og nyreskade34.
Til dato, off-label stof ribavirin (RBV) er behandlingen af valg for mange inficerede patienter35,36. Der er dog rapporteret tilfælde af behandlingssvigt og dårlige kliniske langsigtede resultater. Behandlingssvigt har været forbundet med viral mutagenese og øget viral heterogenitet hos kronisk inficerede patienter37,,38,39. Tværtimod var en nylig europæisk retrospektiv multicenterundersøgelse ikke i stand til at korrelere polymerasemutationer til RBV-behandlingssvigt40. I kliniske observationer og in vitro-forsøg har interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinksalte46 og silvestrol47,48 også vist antivirale virkninger. Ikke desto mindre, en specifik HEV behandling er stadig at finde, hæmmet af den manglende viden om HEV livscyklus og dens patogenese. Der er derfor et presserende behov for et robust cellekultursystem til virologiske undersøgelser og udvikling af nye antiviralelægemidler 49.
Desværre, ligesom andre hepatitis virus, HEV er vanskeligt at udbrede i konventionelle cellelinjer og normalt skrider meget langsomt fører til lav viral belastninger. Ikke desto mindre, nogle grupper var i stand til at øge viral belastninger ved generering af cellelinje subkloner50 eller justering af medier kosttilskud51. For nylig blev generationen af cDNA-kloner52 og tilpasningen af primære patientisolater ved at passere53,54 yderligere HEV-formering icellekulturen 55. I denne protokol brugte vi genomet af en cellekultur tilpasset Kernow-C1 stamme (benævnt p6_WT)54 og en mutant stamme huser en replikationsfremmende mutation (benævnt p6_G1634R)37. Kernow-C1 er den hyppigst anvendte stamme i HEV cellekultur og er i stand til at producere høje virale belastninger. Ved at vurdere virale RNA kopi numre, HEV replikation kan overvåges in vitro. Ikke desto mindre gør disse teknikker det ikke muligt at vurdere antallet af infektiøse partikler, der produceres. Derfor har vi etableret en immunofluorescens farvning til at bestemme Focus Danner Enheder (FFU / ml).
Den her beskrevne metode56 kan bruges til at producere infektiøse viruspartikler i fuld længde, som er i stand til at inficere en række celletyper fra forskellige oprindelser, herunder primærceller og pattedyrcellelinjer. Dette er en grundlæggende forudsætning for at dechifrere vigtige aspekter af HEV-infektion og tropisme. Der er ikke behov for vaccination med normalt begrænsede patientisolater. Produktionen af infektiøse HEV partikler fra plasmider udgør en uendelig kilde, hvilket gør denne protokol sammenligneligt effektiv. Desuden kan dette system anvendes til omvendt genetik, der gør det muligt at undersøge in vivo-identificeret genomændring og deres indvirkning på HEV-replikation og -kondition. Denne teknik overvinder mange begrænsninger og kan bane vejen for udvikling af lægemidler, mutageneseundersøgelser og evaluering af virus-vært interaktioner såsom begrænsning eller indrejse faktorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatitis E-virus er den hyppigste årsag til skrumpelever og leversvigt med stigende prævalens på verdensplan. Den enkeltsnørede RNA-virus overføres overvejende ved blodtransfusioner, utilstrækkelige sanitære forhold og forurenede fødevarer. Til dato off-label stof ribavirin (RBV) er behandlingen af valg for mange patienter. Ikke desto mindre er der stadig en specifik HEV-behandling, der skal identificeres. Hidtil har viden om HEV livscyklus og patogenese været alvorligt hæmmet på grund af manglen på en effektiv HEV celle kultur system. Et robust cellekultursystem er afgørende for studiet af den virale livscyklus, som også omfatter den virale patogenese. Med den metode, der er beskrevet her, kan man producere virale titere på op til 3 x10 6 fokus danner enhed / ml (FFU / ml) af ikke-indhyllet HEV og op til 5 x10 4 FFU / ml af indhyllet HEV. Ved hjælp af disse partikler er det muligt at inficere en række celler af forskellig oprindelse, herunder primære celler og mennesker samt dyrecellelinjer. Produktionen af infektiøse HEV partikler fra plasmider udgør en uendelig kilde, hvilket gør denne protokol overordentlig effektiv.

I denne protokol beskriver vi produktionen af høj titer infektiøse HEVcc. Det første skridt er at isolere plasmid DNA (pBluescript_SK_HEVp654 og pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figur 8a), som derefter er lineariseret ved begrænsning fordøjelse og renset for in vitro transskription (Figur 1). En vellykket linearisering kan verificeres ved at sammenligne det ikke-fordøjede plasmid-DNA med det fordøjede plasmid-...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Beskrevet her er en effektiv metode til, hvordan man producerer høje virale titer lagre af hepatitis E-virus (HEV) til effektivt at inficere hepatoma celler. Med den præsenterede metode kan både ikke-kappes samt kappede virale partikler høstes og bruges til at vaccinere forskellige cellelinjer.

En celle kulturmodel for produktion af høj titer Hepatitis E Virus Lagre

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatitis E virus forskning er blevet hæmmet af manglen på en effektiv celle kultur system. Vores teknikker overvinde disse begrænsninger bane vejen for lægemiddeldesign og vaccine udvikling. Med denne protokol, vi er i stand til at producere smitsomme høje titer virus af både ikke-kuvert og kuvert HEV partikler, lette infektionen af en række celler.Udførelse af denne protokol kræver adgang til en BSA-2 facilitet og erfaring med grundlæggende cellekultur teknikker. For at linearisere plasmid-DNA'et blandes 10 mikrogram af skabelon-DNA'et med 10 mikroliter buffer og to mikroliter af Micrococcus luteus-restriktionsenzymet, og det endelige volumen justeres til 100 mikroliter med vand. Derefter inkuberes opløsningen i en time ved 37 grader Celsius og bekræfte linearisering af plasmid ved agarose gel elektroforese i henhold til standard protokoller.Efter plasmid DNA isolation og linearisering, kan succesen af linearisering verificeres ved at sammenligne den ikke-fordøjet plasmid DNA til fordøjet plasmid DNA ved gel elektroforese. For in vitro transskription af den rensede, fuld længde hepatitis E virus DNA, bland to mikrogram af den lineariserede DNA skabelon med de relevante reagenser og bruge kernen-fri vand til at bringe det endelige volumen af opløsningen til 100 mikroliter. Efter grundig blanding inkuberes opløsningen i to timer ved 37 grader Celsius.Efter to timer tilsættes yderligere to mikroliter T7 RNA polymerase til røret. Bland derefter reaktionen og inkuber røret ved 37 grader Celsius i yderligere to timer. Ved slutningen af inkubationen fordøjes den oprindelige DNA-skabelon med 7,5 mikroliter af DNAs med grundig blanding og inkubering i 37 grader Celsius i 30 minutter.Efter ekstraktionen skal RNA's integritet kontrolleres omhyggeligt, og udbyttet ved agarosegelelektroforese skal kontrolleres i henhold til standardprotokollerne. I tilfælde af lav RNAs abundancy, bør forskellige bånd, snarere end en sløret smøre observeres. Nogle trin kræver hurtig udførelse og derfor grundig forberedelse.Vær også særlig opmærksom på RNA-integritet og celle levedygtighed. For at forberede humane leverkræft celler til cellekultur-afledt hepatitis E virus produktion, frø cellerne i 20 milliliter komplet DMEM på en 15 centimeter kollagen belagt kultur fad og inkubere ved 37 grader Celsius, indtil de når 90% sammenløbet. I slutningen af kulturen vaskes cellerne med 10 milliliter PBS, før de tages ud af cellekulturpladen med tre milliliter 0,05% Trypsin-EDTA ved 37 grader Celsius.Opsaltning af de fritliggende celler i 10 milliliter komplet DMEM og overføre cellerne i et 50 milliliter konisk rør til optælling. Fem gange 10 overføres til de seks celler til et nyt 50 milliliterrør, og cellerne vaskes to gange med 35 milliliter PBS pr. vask. Efter den anden vask, placere cellerne på is uden at fjerne supernatant.Ved elektroporering af målcellerne suppleres 384 mikroliter cytomix med to millimolar ATP og fem millimolar glutathion, hvor de efterfølgende opbevares på is indtil videre. Udskift forsigtigt supernatanten med hele opløsningen på 400 mikroliter. Tilføj fem mikrogram renset viralt genomisk RNA til cellerne og overfør cellesuspensionen til en fire millimeter kuvette til elektroporation ved 975 mikrofarve og 270 volt i 20 millisekunder.Efter elektroporation, bruge en Pasteur pipette til at overføre cellerne så hurtigt som muligt i 11 milliliter komplet DMEM og frø 10 milliliter af de elektroporerede celler i en 10 centimeter kultur fad belagt med kollagen. Dernæst tilsættes 1,3 gange 10 til de femte celler i 300 mikroliter af medium jævnt på et dæksel slip i en brønd af en kollagen-belagt 24 microtiter plade og placere pladen og skålen i cellekultur inkubator i 24 timer. Den næste dag, erstatte supernatant i skålen med 10 milliliter frisk DMEM og returnere skålen til cellen kultur kuvøse i yderligere seks dage.På dag fem til syv, afhængigt af celletætheden, udføre immunfluorescerende farvning af transfektion kontrol at tillade beregning af antallet af celler, der udtrykker målet protein af interesse normaliseret til det samlede antal celler. Vellykket elektroporation kan overvåges ved immunfluorescerende farvning af transfektionskontrollen. Transfektionseffektiviteten bør overstige 40%A replikationsdetær mutant kan fungere som en negativ kontrol for at bekræfte farvningens specificitet.At høste ekstracellulære cellekultur-afledte hepatitis E viruspartikler, på dag seks, filtrere supernatant gennem en 0,45 microliter mesh for at fjerne eventuelle cellerester og gemme den høstede ekstracellulære cellekultur-afledte hepatitis E-virus ved fire grader Celsius. For intracellulær cellekultur-afledt hepatitis E virus partikelhøst, vaske celler med PBS og løsrive cellerne med 1,5 milliliter 0,05% Trypsin-EDTA ved 37 grader Celsius. Når cellerne er taget af, skal reaktionen stoppes med 8,5 milliliter DMEM, og cellesuspensionen overføres til et 50 milliliterrør til centrifugering.Der tilsættes 1,6 milliliter DMEM komplet medium pr. elektroporation til individuelle to milliliterreaktionsrør, og der anvendes 800 mikroliter af mediet til at opslænge cellerne igen, hvorved cellerne overføres til rørene. Cellerne fryses ud i flydende nitrogen, og cellerne optøs derefter på is tre gange, før høj hastighed centrifugeres de resulterende lysater i 10 minutter ved 10.000 gange g. Overfør derefter supernatanterne til nye rør uden at forstyrre celleaffaldspillerne i minus 80 grader Celsius opbevaring.For at vurdere titere af de nyproducerede intra og ekstracellulære hepatitis E virus bestande, frø to gange 10 til de fire celler pr 100 mikroliter af MEM pr godt ind i de 60 center brønde af en kollagen-belagt 96-godt microtiter plade og fylde den yderste brønde med 100 mikroliter AF PBS per brønd. Efter 24 timer ved 37 grader Celsius, tilsæt 50 mikroliter af ekstracellulær virus partikel supernatant til den første række af celler. Efter grundig blanding fortyndes indholdet af brønden serielt seks gange ved en 1-3 koncentration pr. brønd ved at overføre 50 mikroliter supernatant fra den foregående til den næste cellerække i to eksemplarer indtil den sidste række celler.For at inficere cellerne med intracellulære cellekulturbaserede hepatitis E-viruspartikler tilsættes 25 mikroliter af den intracellulære viruspartikel supernatant til den øverste cellerække og blandes længe før seriefortyndelse af cellerne seks gange i et en til fem forhold med 25 mikroliter fortynding i to eksemplarer som påvist. Anbring derefter pladen i cellekulturskuvøsen i syv dage, før immunfluorescerende farvning i henhold til protokollen i manuskriptet. Efter inkubation og immunfarvning kan pladerne analyseres ved hjælp af immunfluorescensmikroskopi.Efter immunostaining den endelige titer af intra og ekstracellulære partikler kan beregnes ved hjælp af den relevante formel som angivet. Efter målcelleinfektionen med cellekulturbaserede E-viruspartikler ved sererisk fortynding kan titere mellem en gang 10 til femte og tre gange 10 til de seks fokusdannende enheder pr. milliliter forventes af de cellekulturer, der er inficeret med de ikke-indhyllede intracellulære cellekulturbaserede hepatitis E-viruspartikler. I kulturer inficeret med indhyllede ekstracellulære cellekultur-afledte hepatitis E viruspartikler forventes titere mellem en gang 10 til den anden og en gange 10 til den fjerde fokusdannende enheder pr. milliliter.Desuden er forholdet mellem genomkopier og ikke-indhyllede intracellulære infektiøse viruspartikler typisk lavere end det, der er observeret for ekstracellulære cellekulturbaserede hepatitis E-viruspartikelinficerede kulturer, hvilket tyder på en højere specifik infektivitet af de ikke-indhyllede hepatitis E-virusarter. Viral partikelproduktion og målcelleinfektion kræver en fuld viral livscyklus og kan give ny indsigt i virusværtsinteraktioner. Denne protokol kan ændres til at udføre replikation kinetik eller til at producere partikler, der kan bruges i infektion assays.Det meste af vores forskning i øjeblikket afhænger af smitsomme partikler, både i den indhyllede og ikke-indhyllede HEV. Og artikler ved hjælp af vores teknikker er i øjeblikket ved at blive offentliggjort.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyklin-regulerede cellelinje producerer high-titer lentivirusvektorer som specifikt rettet dendritiske celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

En protokol til at analysere Hepatitis C virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Udvikling af en hepatitis B virus Reporter system til at overvåge tidlige stadier af Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Lever-on-a-Chip" kulturer af primære hepatocytter og Kupffer celler for Hepatitis B virusinfektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kylling primære Bursal-cellekultur Model til at studere smitsomme Bursal Disease Virus patogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...