Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

We zijn Suzanne Emerson dankbaar voor de hepatitis E virus p6 kloon. HEV-specifieke konijn hyperimmune serum werd vriendelijk geleverd door Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Instituut, Duitsland. Bovendien danken wij alle leden van de afdeling Moleculaire en Medische Virologie van de Ruhr-universiteit Bochum voor hun steun en discussie. Cijfers 1-7 werden gegenereerd met BioRender.com.

OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarde. Alle materialen die in contact komen met hepatitis E virus RNA of infectieuze virus moet goed worden gespoeld met 4% Kohrsolin FF uit een afvalcontainer in de kap voorafgaand aan verwijdering.
1. Plasmidvoorbereiding
<ol><li>Inoculat 200 mL LB medium met 100 μg/mL ampicilline met getransformeerde Escherichia coli JM109 met een plasmide codering voor de full-length HEV gt3 Kernow-C1p6 sequentie (pBluescript_SK_HE...

Beginnend met het plasmidepreparaat, zouden de opbrengsten van DNA meer dan 150 ng/μL moeten overschrijden om veelvoudige linearisatie van de zelfde plasmidvoorraad te kunnen uitvoeren, die het risico van bacteriën-geïnduceerde mutagenese van essentiële genoomopeenvolgingen minimaliseert. Verder is het belangrijk om de beperking te controleren voor de volledige plasmide linearisatie door gel elektroforese (Figuur 8b). Een gebrek aan gelinealiseerd plasmide DNA zou leiden tot rollende cir...

Hepatitis E is een vrij onderschatte ziekte met toenemende prevalentie wereldwijd. Ongeveer 20 miljoen infecties resulteren in meer dan 70.000 sterfgevallen per jaar1. Het onderliggende middel, het Hepatitis E-virus (HEV), werd onlangs overgeplaatst en is nu ingedeeld binnen de familie Hepeviridae, waaronder het geslacht Orthohepevirus en het Piscihepevirus. HEV van verschillende oorsprong zijn ingedeeld binnen de soort Orthohepevirus A-D met inbegrip van isolaten van mensen, varkens, konijnen, ratten, vogels en andere zoogdieren2. Op dit moment zijn acht verschillende genotypes (GT) van het positief georiënteerde, enkelstrengs RNA-virus geïdentificeerd2. Hoewel ze verschillen in hun sequentie-identiteit, routes van transmissie en geografische spreiding, is hun genomische structuur zeer behouden. Meer specifiek, de 7.2 kbp HEV genoom is verdeeld in 3 grote open leesframes (ORF1-3). Terwijl ORF1 alle enzymen codeert die nodig zijn voor een succesvolle replicatie binnen de hostcel, codeert ORF2 het capsid-eiwit en werkt het ORF3-eiwit als een functioneel ionenkanaal dat nodig is voor de assemblage en afgifte van infectieuze deeltjes3. Eenmaal vrijgegeven in de basale of apical lumen HEV bestaat in zowel, quasi-veloped en niet-gehulde / naakte soorten, afhankelijk van de vraag of het virus afkomstig is van bloed of uitwerpselen, respectievelijk4,5.
Terwijl GT1 en GT2 zijn vooral te vinden in ontwikkelingslanden uitsluitend infecteren mensen6 via de fecale orale route, GT3, GT4 en GT7 komen voornamelijk voor in ontwikkelde landen1,7 met een verscheidenheid aan soorten die als reservoirs, b.v. varkens8, rat9, kip10,11, herten12, mongoose13, vleermuis14, konijn15,16, wilde zwijnen17 en nog veel meer7,18,19, die aantonen dat zoönose7,20,21,22. Naast ontoereikende hygiënische omstandigheden23 en besmette voedingsproducten12,24,25,26, is overdracht via bloedtransfusie en orgaantransplantaties ook mogelijk27,28. HEV is een veel voorkomende oorzaak van levercirrose en leverfalen29 vooral bij patiënten met reeds bestaande leverziekte, immuungecompromitteerde individuen (genotype 3, 4 en 7) en zwangere vrouwen (genotype 1). Van belang zijn er ook extrahepatische manifestaties zoals hematopoietische ziekte30,31,32, neurologische aandoeningen33 en nierletsel34.
Tot op heden is het off-label medicijn ribavirin (RBV) de keuzebehandeling voor veel geïnfecteerde patiëntenvan 35,36. Er zijn echter gevallen van falen van de behandeling en slechte klinische resultaten op lange termijn gemeld. Het falen van de behandeling is gekoppeld aan virale mutagenese en verhoogde virale heterogeniteit bij chronisch geïnfecteerde patiënten37,38,39. Integendeel, een recente Europese retrospectieve multicenter studie was niet in staat om polymerase mutaties te correleren met RBV behandeling falen40. In klinische waarnemingen en in vitro experimenten hebben interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinkzouten46 en silvestrol47,48 ook antivirale effecten vertoond. Niettemin moet er nog een specifieke HEV-behandeling worden gevonden, die wordt belemmerd door het gebrek aan kennis over de HEV-levenscyclus en de pathogenese ervan. Daarom is een robuust celkweeksysteem voor virologische studies en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen dringend nodig49.
Helaas, net als andere hepatitis virussen, HEV is moeilijk te verspreiden in conventionele cellijnen en meestal vordert zeer langzaam leidt tot lage virale belastingen. Niettemin, sommige groepen waren in staat om virale belastingen te stimuleren door de generatie van de cellijn subklonen50 of de aanpassing van de media supplementen51. Onlangs is de generatie van cDNA klonen52 en de aanpassing van de primaire patiënt isolaten door passaging53,54 verder verbeterde HEV voortplanting in celcultuur55. In dit protocol gebruikten we het genoom van een celcultuur aangepaste Kernow-C1 stam (aangeduid als p6_WT)54 en een mutant stam herbergen een replicatie-verbeterende mutatie (aangeduid als p6_G1634R)37. Kernow-C1 is de meest gebruikte stam in HEV celcultuur en is in staat om hoge virale belastingen te produceren. Door het beoordelen van virale RNA kopie nummers, HEV replicatie kan worden gecontroleerd in vitro. Deze technieken maken het echter niet mogelijk om het aantal besmettelijke deeltjes te beoordelen. Daarom hebben we een immunofluorescentie kleuring vastgesteld om Focus Forming Units (FFU/mL) te bepalen.
De hier beschreven methode56 kan worden gebruikt om infectieuze virale deeltjes over de hele lengte te produceren die in staat zijn om een verscheidenheid aan celtypen van verschillende oorsprong te infecteren, waaronder primaire cellen en zoogdiercellijnen. Dit is een fundamentele voorwaarde om belangrijke aspecten van HEV-infectie en tropisme te ontcijferen. Er is geen noodzaak voor inenting met meestal beperkte patiënt isolaten. De productie van besmettelijke HEV-deeltjes uit plasmiden vormt een oneindige bron, wat dit protocol vergelijkbaar efficiënt maakt. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor omgekeerde genetica waardoor in vivo geïdentificeerde genoomwijziging en hun impact op HEV-replicatie en fitness mogelijk zijn. Deze techniek overwint vele beperkingen en kan de weg vinden voor medicijnontwikkeling, mutagenesestudies en de evaluatie van virushostinteracties zoals beperking of toegangsfactoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatitis E-virus is de belangrijkste oorzaak van levercirrose en leverfalen met toenemende prevalentie wereldwijd. Het enkelstrende RNA-virus wordt voornamelijk overgedragen door bloedtransfusies, ontoereikende hygiënische omstandigheden en besmette voedingsproducten. Tot op heden is het off-label medicijn ribavirin (RBV) de behandeling naar keuze voor veel patiënten. Niettemin moet een specifieke HEV-behandeling nog worden vastgesteld. Tot nu toe is de kennis over de HEV levenscyclus en pathogenese ernstig belemmerd door het ontbreken van een efficiënt HEV-celkweeksysteem. Een robuust celkweeksysteem is essentieel voor de studie van de virale levenscyclus, die ook de virale pathogenese omvat. Met de hier beschreven methode kan men virale titers produceren tot 3 x 106 focusvormende eenheid/mL (FFU/mL) van niet-omhulde HEV en tot 5 x 104 FFU/mL van omhulde HEV. Met behulp van deze deeltjes is het mogelijk om een verscheidenheid aan cellen van verschillende oorsprong te infecteren, waaronder primaire cellen en menselijke, evenals dierlijke cellijnen. De productie van besmettelijke HEV-deeltjes uit plasmiden vormt een oneindige bron, wat dit protocol buitengewoon efficiënt maakt.

In dit protocol beschrijven we de productie van high titer infectieuze HEVcc. De eerste stap is het isoleren van plasmide DNA (pBluescript_SK_HEVp654 en pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figuur 8a), die vervolgens wordt gelinealiseerd door beperking van de spijsvertering en gezuiverd voor in vitro transcriptie (Figuur 1). Een succesvolle linearisatie kan worden geverifieerd door het niet-verteerde plasmid-DNA te verge...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hier beschreven is een effectieve methode voor het produceren van hoge virale titer voorraden van hepatitis E-virus (HEV) om efficiënt te infecteren hepatoma cellen. Met de gepresenteerde methode kunnen zowel niet-omhulde, als omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt voor het inenten van verschillende cellijnen.

Een cel cultuur model voor de productie van hoge titer hepatitis E virus voorraden

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatitis E virus onderzoek is belemmerd door het ontbreken van een efficiënte celkweek systeem. Onze technieken overwinnen deze beperkingen die de weg vrijmaken voor het ontwerpen van geneesmiddelen en de ontwikkeling van vaccins. Met dit protocol zijn we in staat om infectieuze hoge titervirussen te produceren van zowel niet-envelopsen als envelop HEV-deeltjes, waardoor de infectie van een verscheidenheid aan cellen wordt vergemakkelijkt.De uitvoering van dit protocol vereist toegang tot een BSA-2 faciliteit en ervaring met basiscelcultuurtechnieken. Om het plasmide DNA te lineariseren, meng je 10 microgram van het sjabloon-DNA met 10 microliter buffer en twee microliters van het Micrococcus luteus restrictieenzym en pas je het uiteindelijke volume aan tot 100 microliter met water. Vervolgens broeden de oplossing voor een uur bij 37 graden Celsius en bevestigen linearisatie van de plasmid door agarose gel elektroforese volgens standaard protocollen.Na plasmide DNA isolatie en linearisatie, kan het succes van de linearisatie worden geverifieerd door het niet-verteerd plasmide DNA te vergelijken met het verteerde plasmide DNA door gel elektroforese. Voor in vitro transcriptie van het gezuiverde, volledige hepatitis E-virus-DNA, meng twee microgram van de gelinelineiseerde DNA-sjabloon met de juiste reagentia en gebruik nucleusvrij water om het uiteindelijke volume van de oplossing naar 100 microliter te brengen. Na grondig mengen, incubeer de oplossing gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.Voeg na twee uur nog eens twee microliters T7 RNA polymerase toe aan de buis. Meng vervolgens de reactie en broed de buis op 37 graden Celsius voor nog eens twee uur. Verteerbaar aan het einde van de incubatie de eerste DNA-sjabloon met 7,5 microliter DNA's met grondig mengen en incubeer gedurende 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Controleer na de extractie zorgvuldig de RNA-integriteit en opbrengst door agarose gel elektroforese volgens standaardprotocollen. In het geval van lage RNAs abundancy moeten verschillende banden, in plaats van een wazig uitstrijkje worden waargenomen. Sommige stappen vereisen een snelle uitvoering en dus een grondige voorbereiding.Ook speciale aandacht besteden aan RNA integriteit en cel levensvatbaarheid. Ter voorbereiding van menselijke leverkankercellen voor celcultuur afgeleide hepatitis E virus productie, zaad de cellen in 20 milliliter van volledige DMEM op een 15 centimeter collageen gecoate kweekschaal en incubeer bij 37 graden Celsius totdat ze bereiken 90%confluency. Aan het einde van de cultuur, was de cellen met 10 milliliter PBS voordat ze los te maken van de celcultuur plaat met drie milliliter van 0,05%Trypsin-EDTA bij 37 graden Celsius.Resuspend de vrijstaande cellen in 10 milliliter van volledige DMEM en breng de cellen in een 50 milliliter conische buis voor het tellen. Breng vijf keer 10 naar de zes cellen naar een nieuwe 50 milliliter buis en was de cellen twee keer met 35 milliliter PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, plaats de cellen op ijs zonder het verwijderen van de supernatant.Voor elektroporatie van de doelcellen, vul 384 microliter cytomix met twee millimolar ATP en vijf millimolar glutathion, vervolgens op te slaan op ijs tot verder gebruik. Vervang de supernatant voorzichtig door de volledige 400 microliters van de oplossing. Voeg vijf microgram gezuiverd viraal genomic RNA toe aan de cellen en breng de celsuspensie over naar een vier millimeter cuvette voor elektroporatie bij 975 microfar en 270 volt gedurende 20 milliseconden.Gebruik na elektroporatie een Pasteur pipet om de cellen zo snel mogelijk over te brengen in 11 milliliter complete DMEM en zaad 10 milliliter van de geëlektreerde cellen in een 10 centimeter cultuurschaal bedekt met collageen. Voeg vervolgens 1,3 keer 10 aan de vijfde cellen in 300 microliter van medium gelijkmatig toe aan een cover slip in een put van een met collageen bedekte 24 microtiterplaat en plaats de plaat en schotel gedurende 24 uur in de celkweek incubator. De volgende dag, vervang de supernatant in het gerecht met 10 milliliter verse DMEM en breng het gerecht terug naar de celcultuur incubator voor een extra zes dagen.Op dag vijf tot zeven, afhankelijk van de celdichtheid, voert immunofluorescente kleuring van de transfectiecontrole uit om de berekening mogelijk te maken van het aantal cellen dat het doeleiwit van belang uitdrukt genormaliseerd naar het totale aantal cellen. Succesvolle elektroporatie kan worden gecontroleerd door immunofluorescente kleuring van de transfectiecontrole. De transfectie-efficiëntie moet meer dan 40% een replicatietekort mutant kan dienen als een negatieve controle om de specificiteit van de kleuring te bevestigen.Om extracellulaire celkweek-afgeleide hepatitis E-virusdeeltjes te oogsten, filtert u op dag zes het supernatant door een 0,45 microlitergaas om celpuin te verwijderen en het geoogste extracellulaire celkweek-afgeleide hepatitis E-virus op vier graden Celsius op te slaan. Voor intracellulaire celkweek-afgeleide hepatitis E-virusdeeltjesoogst, was cellen met PBS en maak de cellen los met 1,5 milliliter van 0,05%Trypsin-EDTA bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met 8,5 milliliter DMEM en breng de celsuspensie over naar een buis van 50 milliliter voor centrifugatie.Voeg 1,6 milliliter DMEM complete medium per elektroporatie toe aan individuele twee milliliter reactiebuizen en gebruik 800 microliter van het medium om de cellen opnieuw op te sluiten, waardoor de cellen naar de buizen worden overgebracht. Vries de cellen uit in vloeibare stikstof, en vervolgens ontdooien de cellen op ijs drie keer voor hoge snelheid centrifugeren de resulterende lysates gedurende 10 minuten op 10,000 keer g. Breng vervolgens de supernatants in nieuwe buizen zonder verstoring van de cel puin pellets voor min 80 graden Celsius opslag.Om de titers van de nieuw geproduceerde intra- en extracellulaire hepatitis E-virusvoorraden te beoordelen, zaad twee keer 10 tot de vier cellen per 100 microliter mem per put in de 60 centrumputten van een met collageen bedekte 96-put microtiterplaat en vul de buitenste putten met 100 microliter van PBS per put. Voeg na 24 uur bij 37 graden Celsius 50 microliter extracellulair virusdeeltje supernatant toe aan de eerste rij cellen. Na grondig mengen, serieel verdunnen van de put inhoud zes keer op een een tot drie concentratie per goed door de overdracht van 50 microliter van supernatant van de vorige naar de volgende rij cellen in duplicaat tot de laatste rij cellen.Om de cellen te infecteren met intracellulaire celcultuur-afgeleide hepatitis E virusdeeltjes, voeg 25 microliters van het intracellulaire virusdeeltje supernatant toe aan de bovenste rij cellen en meng goed voordat de cellen zes keer serieel verdunnen bij een verhouding van één tot vijf met 25 microliter verdunning in duplicaat zoals aangetoond. Plaats de plaat vervolgens zeven dagen in de couveuse van de celkweek voordat immunofluorescente kleuring volgens het protocol in het manuscript wordt aangebracht. Na incubatie en immuunvlekken kunnen de platen worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie.Na immunostaining kan de uiteindelijke titer van de intra- en extracellulaire deeltjes worden berekend met behulp van de juiste formule zoals aangegeven. Na de doelcelbesmetting met celcultuur-afgeleide virusdeeltjes van de cellen door seriële verdunning, kunnen de titers tussen één keer 10 tot vijfde en drie keer 10 aan de zes nadrukvormende eenheden per milliliter van de celculturen worden verwacht die met de niet-omhulde intracellulaire celkweek-afgeleide hepatitis E virusdeeltjes worden besmet. In culturen die met omhulde extracellulaire celkweek-afgeleide hepatitis E virusdeeltjes worden besmet, worden de titers tussen één keer 10 aan tweede en één keer 10 aan de vierde nadrukvormende eenheden per milliliter verwacht.Bovendien is de verhouding tussen genoomkopieën en niet-gehulde intracellulaire infectieuze virusdeeltjes doorgaans lager dan die waargenomen voor geïnterneerde culturen van het geïndrieterede hepatitis E-virusdeeltjes van extracellulaire celkweek, wat wijst op een hogere specifieke infectiviteit van de niet-omhulde hepatitis E-virussoorten. De productie van virale deeltjes en de infectie van de doelcel vereisen een volledige virale levenscyclus en kunnen nieuwe inzichten bieden in interacties met virussen. Dit protocol kan worden gewijzigd om replicatiekinetiek uit te voeren of om deeltjes te produceren die kunnen worden gebruikt in infectietesten.Het grootste deel van ons onderzoek is momenteel afhankelijk van besmettelijke deeltjes, zowel in de gehulde als in niet-omhulde HEV. En artikelen met behulp van onze technieken worden momenteel gepubliceerd.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Een Ex Vivo kip primaire Bursal-celkweek Model studie Bursal infectieziekte Virus pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...