Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
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Nous sommes reconnaissants à Suzanne Emerson pour le virus de l’hépatite E p6 clone. Rainer Ulrich, Institut Friedrich Loeffler, Allemagne, a fourni un sérum hyperimmune de lapin spécifique à HEV. En outre, nous remercions tous les membres du Département de Virologie Moléculaire et Médicale de l’Université de la Ruhr Bochum pour leur soutien et leur discussion. Les chiffres 1 à 7 ont été générés avec BioRender.com.

REMARQUE : Toutes les expériences sont effectuées sous condition BSL-2. Tous les matériaux qui entrent en contact avec l’ARN du virus de l’hépatite E ou le virus infectieux doivent être rincés correctement avec 4% Kohrsolin FF à partir d’un conteneur de déchets à l’intérieur du capot avant l’élimination.
1. Préparation plasmide
<ol><li>Inoculer un milieu de 200 mL LB contenant une ampicilline de 100 μg/mL avec une apéricile Escherichia coli JM109 transformée...

En commençant par la préparation du plasmide, les rendements de l’ADN devraient dépasser 150 ng/μL pour être en mesure d’effectuer une linéarisation multiple à partir du même stock de plasmide, ce qui minimise le risque de mutagenèse induite par les bactéries des séquences génomiques cruciales. En outre, il est important de vérifier la digestion de restriction pour la linéarisation complète du plasmide par électrophorèse de gel (figure 8b). Un manque d’ADN plasmide lin...

L’hépatite E est une maladie assez sous-estimée avec une prévalence croissante dans le monde entier. Environ 20 millions d’infections entraînent plus de 70 000 décès par an1. L’agent sous-jacent, le virus de l’hépatite E (HEV), a été réaffecté récemment et est maintenant classé dans la famille hepeviridae, y compris les genres Orthohepevirus et Piscihepevirus. HEV de diverses origines sont classés dans l’espèce Orthohèpevirus A-D y compris les isolats de l’homme, porc, lapins, rats, oiseaux et autres mammifères2. À l’heure actuelle, huit génotypes différents (GT) du virus de l’ARN à brin unique orienté vers un positif ont été identifiés2. Bien qu’ils diffèrent dans leur identité de séquence, les voies de transmission et la répartition géographique, leur structure génomique est fortement conservée. Plus spécifique, le génome hev de 7,2 kbp est divisé en 3 cadres de lecture ouverts majeurs (ORF1-3). Alors que ORF1 code toutes les enzymes nécessaires à une réplication réussie dans la cellule hôte, ORF2 code la protéine capside, et la protéine ORF3 fonctionne comme un canal d’ion fonctionnel requis pour l’assemblage et la libération des particules infectieuses3. Une fois libéré dans le lumen basal ou apical, le VHEM existe chez les deux espèces, quasi-enveloppées et non enveloppées/nues selon que le virus provient du sang ou des excréments, respectivement4,5.
Alors que gt1 et GT2 se trouvent principalement dans les pays en développement uniquement infecter les humains6 par la voie fécale-orale, GT3, GT4 et GT7 se produisent principalement dans les pays développés1,7 avec une variété d’espèces servant de réservoirs, par exemple, porcs8, rat9, poulet10,11, cerf12, mangouste13, chauve-souris14, lapin15,16, sanglier17 et beaucoup plus7,18,19, fournissant des preuves de zoonose7,20,21,22. En plus des conditions sanitaires inadéquates23 et des produits alimentaires contaminés12,24,25,26, la transmission par transfusion sanguine et transplantations d’organes est également possible27,28. Le VHEV est une cause fréquente de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique29, en particulier chez les patients atteints d’une maladie hépatique préexistante, d’immunocompromis (génotype 3, 4 et 7) et de femmes enceintes (génotype 1). A noter, il ya aussi des manifestations extrahépatiques telles que la maladie hématopoïétique30,31,32, troubles neurologiques33 et les lésions rénales34.
À ce jour, la ribavirine (RBV) médicament hors étiquette est le traitement de choix pour de nombreux patients infectés35,36. Cependant, des cas d’échec de traitement et de mauvais résultats cliniques à long terme ont été rapportés. L’échec de traitement a été lié à la mutagénèse virale et à l’hétérogénéité virale accrue dans les patients chroniquement infectés37,38,39. Au contraire, une étude multicentrique rétrospective européenne récente n’a pas été en mesure de corréler les mutations de la polymérase à l’échec du traitement rbv40. Dans les observations cliniques et les expériences in vitro, l’interféron41,42,43, sofosbuvir44,45, sels de zinc46 et silvestrol47,48 ont également montré des effets antiviraux. Néanmoins, un traitement spécifique de VH reste à trouver, entravé par le manque de connaissances au sujet du cycle de vie de HEV et de sa pathogénie. Par conséquent, un système robuste de culture cellulaire pour les études virologiques et le développement de nouveaux médicaments antiviraux est nécessaire de toute urgence49.
Malheureusement, comme d’autres virus de l’hépatite, le VHE est difficile à propager dans les lignées cellulaires conventionnelles et progresse généralement très lentement, ce qui entraîne de faibles charges virales. Néanmoins, certains groupes ont été en mesure d’augmenter les charges virales par la génération de sous-clones ligne cellulaire50 ou l’ajustement des suppléments de médias51. Récemment, la génération de clones d’ADNC52 et l’adaptation des isolats du patient primaire en passant53,54 encore amélioré propagation HEV dans la culture cellulaire55. Dans ce protocole, nous avons utilisé le génome d’une souche Kernow-C1 adaptée à la culture cellulaire (appelée p6_WT)54 et d’une souche mutante abritant une mutation améliorant la réplication (appelée p6_G1634R)37. Kernow-C1 est la souche la plus fréquemment utilisée dans la culture cellulaire HEV et est capable de produire des charges virales élevées. En évaluant les numéros de copie virale de l’ARN, la réplication du VH peut être surveillée in vitro. Néanmoins, ces techniques ne permettent pas d’évaluer le nombre de particules infectieuses produites. Par conséquent, nous avons établi une coloration d’immunofluorescence pour déterminer les unités de formation de mise au point (FFU/mL).
La méthode56 décrite ici peut être utilisée pour produire des particules virales infectieuses pleine longueur qui sont capables d’infecter une variété de types de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et les lignées cellulaires des mammifères. Il s’agit d’une condition préalable fondamentale pour déchiffrer les aspects importants de l’infection et du tropisme de HEV. Il n’y a pas besoin d’inoculation avec des isolats de patient habituellement limités. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole comparablement efficace. En outre, ce système peut être utilisé pour la génétique inverse permettant l’étude de l’altération du génome in vivo identifié et leur impact sur la réplication et la condition physique du VH. Cette technique surmonte de nombreuses limitations et peut suivre la voie pour le développement de médicaments, les études de mutagenesis et l’évaluation des interactions virus-hôte tels que la restriction ou les facteurs d’entrée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Le virus de l’hépatite E est la principale cause de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique avec une prévalence croissante dans le monde entier. Le virus de l’ARN à brin unique est principalement transmis par transfusion sanguine, des conditions sanitaires inadéquates et des produits alimentaires contaminés. À ce jour, la ribavirine (RBV) est le traitement de choix pour de nombreux patients. Néanmoins, un traitement spécifique de VHEM reste à identifier. Jusqu’à présent, les connaissances sur le cycle de vie et la pathogénie du VH ont été sérieusement entravées en raison de l’absence d’un système efficace de culture cellulaire HEV. Un système de culture cellulaire robuste est essentiel pour l’étude du cycle de vie viral qui comprend également la pathogénie virale. Avec la méthode décrite ici, on peut produire des titres viraux allant jusqu’à 3 x 106 unité de formation de mise au point /mL (FFU/mL) de HEV non enveloppé et jusqu’à 5 x 104 FFU/mL de HEV enveloppé. En utilisant ces particules, il est possible d’infecter une variété de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et humaines, ainsi que les lignées cellulaires animales. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole extrêmement efficace.

Dans ce protocole, nous décrivons la production de HEVcc infectieux à haute teneur en titer. La première étape consiste à isoler l’ADN plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 et pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figure 8a), qui est ensuite linéaire par digestion de restriction et purifié pour la transcription in vitro (Figure 1). Une linéarisation réussie peut être vérifiée en comparant l’ADN plasmide non dig...

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A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Décrit ici est une méthode efficace sur la façon de produire des stocks de trier virale élevé du virus de l’hépatite E (HEV) pour infecter efficacement les cellules hépatomes. Avec la méthode présentée, les particules virales non enveloppées et les particules virales enveloppées peuvent être récoltées et utilisées pour inoculer diverses lignées cellulaires.

Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

La recherche sur le virus de l’hépatite E a été entravée par l’absence d’un système efficace de culture cellulaire. Nos techniques surmontent ces limitations ouvrant la voie à la conception de médicaments et à la mise au point de vaccins. Avec ce protocole, nous sommes en mesure de produire des virus infectieux à haut litre à la fois de particules de HEV non enveloppe et enveloppe, facilitant l’infection d’une variété de cellules.L’exécution de ce protocole nécessite l’accès à une installation BSA-2 et une expérience des techniques de culture cellulaire de base. Pour linéariser l’ADN plasmide, mélangez 10 microgrammes de l’ADN modèle avec 10 microlitres de tampon et deux microlitres de l’enzyme de restriction micrococcus lutéus et ajustez le volume final à 100 microlitres avec de l’eau. Puis incuber la solution pendant une heure à 37 degrés Celsius et confirmer la linéarisation du plasmide par électrophoresis gel agarose selon les protocoles standard.Après l’isolement et la linéarisation de l’ADN plasmide, le succès de la linéarisation peut être vérifié en comparant l’ADN plasmide non digéré à l’ADN plasmide digéré par électrophoresis gel. Pour la transcription in vitro de l’ADN purifié du virus de l’hépatite E, mélangez deux microgrammes du modèle d’ADN linéarisé avec les réapprovisionnements appropriés et utilisez de l’eau sans noyau pour porter le volume final de la solution à 100 microlitres. Après un mélange complet, incuber la solution pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Après deux heures, ajouter deux microlitres supplémentaires de polymése d’ARN T7 au tube. Ensuite, mélanger la réaction et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant encore deux heures. À la fin de l’incubation, digérer le modèle d’ADN initial avec 7,5 microlitres d’ADN avec mélange complet et incuber pendant 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après l’extraction, vérifiez soigneusement l’intégrité de l’ARN et le rendement par électrophorèse de gel agarose selon les protocoles standard. Dans le cas d’une faible abundance des ARN, des bandes distinctes, plutôt qu’un frottis flou, devraient être observées. Certaines étapes nécessitent une exécution rapide et donc une préparation minutieuse.En outre, portez une attention particulière à l’intégrité de l’ARN et à la viabilité des cellules. Pour préparer les cellules cancéreuses du foie humain à la production de virus de l’hépatite E dérivée de la culture cellulaire, ensemencer les cellules en 20 millilitres de DMEM complet sur un plat de culture enduit de collagène de 15 centimètres et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence. À la fin de la culture, laver les cellules avec 10 millilitres de PBS avant de les détacher de la plaque de culture cellulaire avec trois millilitres de 0,05%Trypsin-EDTA à 37 degrés Celsius.Resuspendez les cellules détachées en 10 millilitres de DMEM complet et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour le comptage. Transférer cinq fois 10 dans les six cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres et laver les cellules deux fois avec 35 millilitres de PBS par lavage. Après le deuxième lavage, placez les cellules sur la glace sans enlever le surnatant.Pour l’électroporation des cellules cibles, compléter 384 microlitres de cytomix avec deux millimolaire ATP et cinq glutathion millimolaire, ensuite stocker sur la glace jusqu’à nouvel usage. Remplacez soigneusement le supernatant par l’ensemble des 400 microlitres de solution. Ajouter cinq microgrammes d’ARN génomique viral purifié aux cellules et transférer la suspension cellulaire à une cuvette de quatre millimètres pour l’électroporation à 975 microfarades et 270 volts pendant 20 millisecondes.Après électroporation, utiliser une pipette Pasteur pour transférer les cellules le plus rapidement possible en 11 millilitres de DMEM complet et ensemencer 10 millilitres des cellules électroporées dans un plat de culture de 10 centimètres recouvert de collagène. Ensuite, ajouter 1,3 fois 10 à la cinquième cellule dans 300 microlitres de milieu uniformément sur un bordereau de couverture dans un puits d’une plaque de collagène enduit de 24 microtitres et placer l’assiette et le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le supernatant dans le plat par 10 millilitres de DMEM frais et retournez le plat à l’incubateur de culture cellulaire pendant six jours supplémentaires.Le cinquième au septième jour, selon la densité cellulaire, effectuer la coloration immunofluorescente du contrôle de la transfection pour permettre le calcul du nombre de cellules exprimant la protéine cible d’intérêt normalisée au nombre total de cellules. L’électroporation réussie peut être surveillée par la coloration immunofluorescente du contrôle de transfection. L’efficacité de la transfection doit dépasser 40%Un mutant déficient en réplication peut servir de contrôle négatif pour confirmer la spécificité de la coloration.Pour récolter les particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire, le sixième jour, filtrer le supernatant à travers un maillage de 0,45 microlitre pour enlever les débris cellulaires et stocker le virus de l’hépatite E dérivé de la culture cellulaire extracellulaire récolté à quatre degrés Celsius. Pour la récolte de particules du virus de l’hépatite E dérivée de la culture cellulaire intracellulaire, lavez les cellules avec PBS et détachez les cellules avec 1,5 millilitres de 0,05%Trypsin-EDTA à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec 8,5 millilitres de DMEM et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres pour centrifugation.Ajouter 1,6 millilitres de DMEM milieu complet par électroporation à des tubes de réaction individuels de deux millilitres et utiliser 800 microlitres du milieu pour résuspendre les cellules, transférant ainsi les cellules vers les tubes. Congelez les cellules dans de l’azote liquide, puis décongelez les cellules sur la glace trois fois avant de centrifuger à grande vitesse les lysates qui en résultent pendant 10 minutes à 10 000 fois g. Ensuite, transférez les supernatants dans de nouveaux tubes sans déranger les granulés de débris cellulaires pour un stockage de moins 80 degrés Celsius.Pour évaluer les titres des stocks de virus intra et extracellulaires nouvellement produits de l’hépatite E, semer deux fois 10 à quatre cellules pour 100 microlitres de MEM par puits dans les 60 puits du centre d’une plaque de microtitre de 96 puits recouverte de collagène et remplir les puits les plus externes de 100 microlitres de PBS par puits. Après 24 heures à 37 degrés Celsius, ajouter 50 microlitres de supernatant de particules de virus extracellulaires à la première rangée de cellules. Après avoir bien mélangé, diluer en série le contenu du puits six fois à une concentration d’un à trois par puits en transférant 50 microlitres de supernatant de la rangée précédente à la rangée suivante de cellules en double jusqu’à la dernière rangée de cellules.Pour infecter les cellules avec des particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire intracellulaire, ajoutez 25 microlitres du supernatant de particules de virus intracellulaires à la rangée supérieure des cellules et mélangez bien avant de diluer périodiquement les cellules six fois à un rapport d’un à cinq avec 25 microlitres de dilution en double comme démontré. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept jours avant la coloration immunofluorescente selon le protocole dans le manuscrit. Après incubation et coloration immunitaire, les plaques peuvent être analysées à l’aide d’une microscopie d’immunofluorescence.Après l’immunostaining le titer final des particules intra et extracellulaires peut être calculé en utilisant la formule appropriée comme indiqué. Après l’infection cellulaire cible par des particules de virus E dérivées de la culture cellulaire par dilution en série, on peut s’attendre à des titrages entre une fois 10 à la cinquième et trois fois 10 aux six unités de formation de foyer par millilitre peuvent être attendues des cultures cellulaires infectées par les particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire intracellulaire non enveloppée. Dans les cultures infectées par des particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire enveloppée, des titres entre une fois 10 à la seconde et une fois 10 à la quatrième concentration formant des unités par millilitre sont attendus.En outre, le rapport entre les copies du génome et les particules intracellulaires non enveloppées de virus infectieux est généralement inférieur à celui observé pour les cultures infectées par les particules du virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire, ce qui suggère une infectiosité spécifique plus élevée des espèces non enveloppées du virus de l’hépatite E. La production de particules virales et l’infection cellulaire cible nécessitent un cycle de vie viral complet et peuvent fournir de nouvelles informations sur les interactions virus-hôte. Ce protocole peut être modifié pour effectuer la cinétique de réplication ou pour produire des particules qui peuvent être utilisées dans les analyses d’infection.La plupart de nos recherches dépendent actuellement de particules infectieuses, tant dans le VHS enveloppé que non enveloppé. Et des articles utilisant nos techniques sont en cours de publication.

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An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...