Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Wir sind Suzanne Emerson für den Klon des Hepatitis-E-Virus p6 dankbar. HEV-spezifisches Kaninchenhyperimmunserum wurde freundlicherweise von Rainer Ulrich, Friedrich-Loeffler-Institut, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern des Fachbereichs Molekulare und Medizinische Virologie der Ruhr-Universität Bochum für ihre Unterstützung und Diskussion. Die Zahlen 1-7 wurden mit BioRender.com erstellt.

HINWEIS: Alle Experimente werden unter BSL-2-Bedingung durchgeführt. Alle Materialien, die mit DerHepatitis E-Virus-RNA oder infektiösem Virus in Berührung kommen, müssen vor der Entsorgung mit 4% Kohrsolin FF aus einem Abfallbehälter in der Haube richtig gespült werden.
1. Plasmid-Vorbereitung
<ol><li>Inokulatieren Sie 200 ml LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin mit transformiertem Escherichia coli JM109 mit einer Plasmid-Codierung für die Sequenz HEV gt3 Kernow-C1p6 in voller ...

Beginnend mit der Plasmidpräparation sollten die DNA-Erträge 150 ng/l überschreiten, um eine multiple Linearisierung aus demselben Plasmidbestand durchführen zu können, was das Risiko einer durch Bakterien induzierten Mutagenese wichtiger Genomsequenzen minimiert. Darüber hinaus ist es wichtig, den Restriktionsdigest für die vollständige Plasmid-Linearisierung durch Gelelektrophorese zu überprüfen (Abbildung 8b). Ein Mangel an linearisierter Plasmid-DNA würde eine Rollkreisverstä...

Hepatitis E ist eine ziemlich unterschätzte Krankheit mit zunehmender Verbreitung weltweit. Etwa 20 Millionen Infektionen führen zu mehr als 70.000 Todesfällen pro Jahr1. Das zugrunde liegende Mittel, das Hepatitis-E-Virus (HEV), wurde vor kurzem neu zugewiesen und ist nun in der Familie Hepeviridae einschließlich der Gattungen Orthohepevirus und Piscihepevirus klassifiziert. HEV verschiedener Herkunft werden innerhalb der Art Orthohepevirus A-D einschließlich Isolate n. Mensch, Schwein, Kaninchen, Ratten, Vögel und andere Säugetiere2eingestuft. Derzeit wurden acht verschiedene Genotypen (GT) des positiv-orientierten, einsträngigen RNA-Virus identifiziert2. Obwohl sie sich in ihrer Sequenzidentität, den Übertragungswegen und der geographischen Verteilung unterscheiden, ist ihre genomische Struktur stark konserviert. Genauer ist, dass das 7,2 kbp HEV Genom in 3 große offene Leserahmen (ORF1-3) unterteilt ist. Während ORF1 alle Enzyme kodiert, die für eine erfolgreiche Replikation innerhalb der Hostzelle benötigt werden, kodiert ORF2 das Capsid-Protein und das ORF3-Protein als funktioneller Ionenkanal, der für die Montage und Freisetzung von InfektiösePartikelnbenötigt wird 3 . Einmal in das Basal- oder apikales Lumen freigesetzt, existiert HEV sowohl bei quasi umhüllten als auch bei nicht umhüllten/nackten Arten, je nachdem, ob das Virus aus Blut oder Kot stammt bzw.4,5.
Während GT1 und GT2 hauptsächlich in Entwicklungsländern gefunden werden, die Menschen6 nur über den fäkal-oralen Weg infizieren, GT3, GT4 und GT7 kommen vorwiegend in entwickelten Ländern1,7 mit einer Vielzahl von Arten als Reservoirs dienen, z.B., Schweine8, Ratte9, Huhn10,11, Hirsch12, Mongoose13, Fledermaus14, Kaninchen15,16, Wildschwein17 und viele mehr 77,18,19, beweise Zoonose7,20,21,22. Neben unzureichenden sanitären Bedingungen23 und kontaminierte Lebensmittel12,24,25,26, Übertragung über Bluttransfusion und Organtransplantationen ist auch möglich27,28. HEV ist eine häufige Ursache für Leberzirrhose und Leberversagen29 vor allem bei Patienten mit bereits bestehenden Lebererkrankungen, immungeschwächten Personen (Genotyp 3, 4 und 7) und Schwangeren (Genotyp 1). Bemerkenswert ist, dass es auch extrahepatische Manifestationen wie hämatopoetische Erkrankungen30,31,32, neurologische Erkrankungen33 und Nierenverletzungen34.
Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) die Behandlung der Wahl für viele infizierte Patienten35,36. Jedoch, Fälle von Behandlungsversagen und schlechte klinische langfristige Ergebnisse wurden berichtet. Behandlungsversagen wurde mit viraler Mutagenese und erhöhter viraler Heterogenität bei chronisch infizierten Patienten37,38,39zusammengebracht. Im Gegenteil, eine kürzlich durchgeführte europäische retrospektive multizentrische Studie war nicht in der Lage, Polymerase-Mutationen mit Einem Fehler bei der RBV-Behandlung40zu korrelieren. In klinischen Beobachtungen und In-vitro-Experimenten haben Interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, Zinksalze46 und Silvestrol47,48 ebenfalls antivirale Wirkungen gezeigt. Dennoch bleibt eine spezifische HEV-Behandlung zu finden, die durch das mangelnde Wissen über den HEV-Lebenszyklus und seine Pathogenese behindert wird. Daher ist ein robustes Zellkultursystem für virologische Studien und die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente dringend erforderlich49.
Leider ist HEV, wie andere Hepatitis-Viren, in konventionellen Zelllinien schwer zu vermehren und entwickelt sich in der Regel sehr langsam, was zu niedrigen Virusbelastungen führt. Dennoch waren einige Gruppen in der Lage, die Viruslast durch die Erzeugung von Zelllinien-Subklonen50 oder die Einstellung von Medienergänzungen51zu steigern. Kürzlich die Erzeugung von cDNA-Klone52 und die Anpassung von Primären-Patientenisolaten durch Passaging53,54 weiter verbesserte HEV-Vermehrung in der Zellkultur55. In diesem Protokoll verwendeten wir das Genom eines zellkulturangepassten Kernow-C1-Stamms (bezeichnet als p6_WT)54 und einen mutierten Stamm, der eine replikationsverstärkende Mutation (p6_G1634R)37. Kernow-C1 ist die am häufigsten verwendete Sorte in der HEV-Zellkultur und ist in der Lage, hohe Viruslasten zu produzieren. Durch die Bewertung viraler RNA-Kopierzahlen kann die HEV-Replikation in vitro überwacht werden. Diese Techniken erlauben jedoch keine Bewertung der Anzahl der erzeugten infektiösen Partikel. Daher haben wir eine Immunfluoreszenzfärbung zur Bestimmung von Fokusbildungseinheiten (FFU/ml) etabliert.
Die hier beschriebene Methode56 kann verwendet werden, um infektiöse Viruspartikel in voller Länge zu produzieren, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Zelltypen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und Säugetierzelllinien. Dies ist eine grundvoraussetzung, um wichtige Aspekte der HEV-Infektion und des Tropismus zu entschlüsseln. Es besteht keine Notwendigkeit für impfungen mit in der Regel begrenzten Patientenisolaten. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll vergleichsweise effizient macht. Darüber hinaus kann dieses System für die Reverse-Genetik verwendet werden, die die Untersuchung der in vivo identifizierten Genomveränderung und ihrer Auswirkungen auf die HEV-Replikation und -Fitness ermöglicht. Diese Technik überwindet viele Einschränkungen und kann den Weg für die Arzneimittelentwicklung, Mutagenesestudien und die Bewertung von Virus-Host-Wechselwirkungen wie Restriktions- oder Eintrittsfaktoren ebnen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatitis E Virus ist die Hauptursache für Leberzirrhose und Leberversagen mit zunehmender Prävalenz weltweit. Das einsträngige RNA-Virus wird überwiegend durch Bluttransfusionen, unzureichende hygienische Bedingungen und kontaminierte Lebensmittel übertragen. Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) für viele Patienten die Behandlung der Wahl. Dennoch muss noch eine spezifische HEV-Behandlung identifiziert werden. Bisher wurde das Wissen über den HEV-Lebenszyklus und die Pathogenese durch das Fehlen eines effizienten HEV-Zellkultursystems stark behindert. Ein robustes Zellkultursystem ist für die Untersuchung des viralen Lebenszyklus unerlässlich, der auch die virale Pathogenese umfasst. Mit der hier beschriebenen Methode kann man virale Titer von bis zu 3 x 106 Fokusbildeinheit/ml (FFU/ml) von nicht umhüllter HEV und bis zu 5 x 104 FFU/ml umhüllter HEV produzieren. Mit diesen Partikeln ist es möglich, eine Vielzahl von Zellen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und menschlichen, sowie tierischen Zelllinien. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll außerordentlich effizient macht.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Produktion von Hochtiter-Infektier HEVcc. Der erste Schritt besteht darin, die Plasmid-DNA (pBluescript_SK_HEVp654 und pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Abbildung 8a) zu isolieren, die dann durch Restriktionsverdauung linearisiert und für die In-vitro-Transkription gereinigt wird (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Linearisierung kann durch den Vergleich der nicht verdauten Plasmi...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hier wird eine wirksame Methode beschrieben, wie man hohe virale Titerbestände an Hepatitis-E-Viren (HEV) produziert, um Häpatomzellen effizient zu infizieren. Mit der vorgestellten Methode können sowohl nicht umhüllte als auch umhüllte Viruspartikel geerntet und zur Impfung verschiedener Zelllinien verwendet werden.

Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Beständen mit hohem Titer

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Die Hepatitis-E-Virusforschung wurde durch das Fehlen eines effizienten Zellkultursystems behindert. Unsere Techniken überwinden diese Einschränkungen und ebnen den Weg für die Entwicklung von Arzneimitteln und die Entwicklung von Impfstoffen. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, infektiöse High Titerviren von HEV-Partikeln ohne Hülle und Hüllkurve zu produzieren, was die Infektion einer Vielzahl von Zellen erleichtert.Die Ausführung dieses Protokolls erfordert den Zugriff auf eine BSA-2-Einrichtung und Erfahrung mit grundlegenden Zellkulturtechniken. Um die Plasmid-DNA linearisieren, mischen Sie 10 Mikrogramm der Schablonen-DNA mit 10 Mikroliter Puffer und zwei Mikroliter des Micrococcus luteus-Restriktionsenzyms und passen Sie das Endvolumen auf 100 Mikroliter mit Wasser an. Dann inkubieren Sie die Lösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und bestätigen Sie die Linearisierung des Plasmids durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Standardprotokollen.Nach der Dna-Isolierung und Linearisierung von Plasmid kann der Erfolg der Linearisierung durch den Vergleich der nicht verdauten Plasmid-DNA mit der verdauten Plasmid-DNA durch Gelelektrophorese bestätigt werden. Mischen Sie für die In-vitro-Transkription der gereinigten, in voller Länge von Hepatitis E-Virus-DNA in voller Länge zwei Mikrogramm der linearisierten DNA-Schablone mit den entsprechenden Reagenzien und verwenden Sie kernfreies Wasser, um das Endvolumen der Lösung auf 100 Mikroliter zu bringen. Nach gründlichem Mischen die Lösung zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach zwei Stunden weitere zwei Mikroliter T7-RNA-Polymerase in die Röhre geben. Dann mischen Sie die Reaktion und inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für weitere zwei Stunden. Am Ende der Inkubation die erste DNA-Schablone mit 7,5 Mikroliter DNAs mit gründlicher Mischung verdauen und 30 Minuten lang für 37 Grad Celsius inkubieren.Nach der Extraktion die RNA-Integrität und Ausbeute durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Standardprotokollen sorgfältig überprüfen. Bei niedriger RNA-Ababscheidung sind eher unterschiedliche Bänder als ein verschwommener Abstrich zu beobachten. Einige Schritte erfordern eine schnelle Ausführung und damit eine gründliche Vorbereitung.Achten Sie auch besonders auf die RNA-Integrität und Zelllebensfähigkeit. Um menschliche Leberkrebszellen auf die Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virusproduktion vorzubereiten, säen Sie die Zellen in 20 Millilitern vollständiger DMEM auf eine 15 Zentimeter kollagenbeschichtete Kulturschale und brüten bei 37 Grad Celsius, bis sie 90 % Konfluenz erreichen. Am Ende der Kultur waschen Sie die Zellen mit 10 MilliliterPBS, bevor Sie sie von der Zellkulturplatte mit drei Millilitern von 0,05%Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius lösen.Setzen Sie die abgetrennten Zellen in 10 Milliliter n. CHR. zurück und übertragen Sie die Zellen zum Zählen in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Fünfmal 10 auf die sechs Zellen in ein neues 50-Milliliter-Rohr geben und die Zellen zweimal mit 35 MilliliterPBS pro Waschgang waschen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen auf Eis legen, ohne den Überstand zu entfernen.Für die Elektroporation der Zielzellen, ergänzen 384 Mikroliter Cytomix mit zwei Millimolar ATP und fünf Millimolar Glutathion, anschließend auf Eis bis zur weiteren Verwendung lagern. Ersetzen Sie den Überstand sorgfältig durch die gesamten 400 Mikroliter Lösung. Fügen Sie den Zellen fünf Mikrogramm gereinigter viraler genomischer RNA hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension für die Elektroporation bei 975 Mikrofarad und 270 Volt für 20 Millisekunden auf eine Vier-Millimeter-Küvette.Nach der Elektroporation verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Zellen so schnell wie möglich in 11 Milliliter komplettes DMEM zu übertragen und 10 Milliliter der elektropoierten Zellen in eine 10-Zentimeter-Kulturschale zu geben, die mit Kollagen beschichtet ist. Als nächstes fügen Sie 1,3 mal 10 zu den fünften Zellen in 300 Mikroliter Medium gleichmäßig auf einen Deckel schlupf in einem Brunnen einer kollagenbeschichteten 24 Mikrotiterplatte und legen Sie die Platte und Schale in der Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden. Am nächsten Tag den Überstand in der Schale durch 10 Milliliter frisches DMEM ersetzen und das Gericht für weitere sechs Tage in den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.Am fünften bis siebten Tag führen Sie je nach Zelldichte eine immunfluoreszierende Färbung der Transfektionskontrolle durch, um die Berechnung der Anzahl der Zellen zu ermöglichen, die das Zielprotein von Interesse ausdrücken, normalisiert auf die Gesamtzahl der Zellen. Erfolgreiche Elektroporation kann durch immunfluoreszierende Färbung der Transfektionskontrolle überwacht werden. Die Transfektionseffizienz sollte 40%A-Replikationsmangel mutant überschreiten kann als negative Kontrolle dienen, um die Spezifität der Färbung zu bestätigen.Um extrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Viruspartikel zu ernten, filtern Sie am sechsten Tag den Überstand durch ein 0,45 Mikroliter-Netz, um Zellablagerungen zu entfernen und das geerntete extrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virus bei vier Grad Celsius zu speichern. Für die intrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virus-Partikelernte, waschen Zellen mit PBS und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Milliliter von 0,05%Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 8,5 Milliliter DMEM und übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 50-Milliliter-Rohr.Fügen Sie 1,6 Milliliter DMEM-Gesamtmedium pro Elektroporation zu einzelnen zwei Milliliter-Reaktionsröhren hinzu und verwenden Sie 800 Mikroliter des Mediums, um die Zellen wieder aufzuhängen, wodurch die Zellen in die Röhren übertragen werden. Die Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren und anschließend die Zellen dreimal auf Eis auftauen, bevor die resultierenden Lysate 10 Minuten lang bei 10.000 mal g zentrifugiert werden. Dann die Überräube in neue Schläuche übertragen, ohne die Zellschuttpellets für minus 80 Grad Celsius Lagerung zu stören.Um die Titter der neu produzierten intra- und extrazellulären Hepatitis-E-Virusbestände zu bewerten, samen Sie zweimal 10 bis 10 bis vier Zellen pro 100 Mikroliter MEM pro Brunnen in die 60 Mittelbrunnen einer kollagenbeschichteten 96-Well-Mikrotiterplatte und füllen die äußersten Brunnen mit 100 MikroliterN PBS pro Brunnen. Nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius 50 Mikroliter extrazellulärer Viruspartikelüberstand in die erste Zellreihe geben. Nach gründlicher Vermischung den Brunneninhalt sechsmal bei einer ein- bis drei Konzentration pro Brunnen durch Übertragung von 50 MikroliterN Überstand von der vorherigen in die nächste Zellreihe in Doppeltarbeit bis zur letzten Zellreihe verdünnen.Um die Zellen mit intrazellulären Zellkultur-abgeleiteten Hepatitis-E-Viruspartikeln zu infizieren, fügen Sie 25 Mikroliter des intrazellulären Viruspartikelüberstandins in die obere Zellreihe ein und mischen Sie sich gut, bevor sie die Zellen sechsmal im Verhältnis eins zu fünf mit 25 Mikroliterverdünnung in Duplikat verdünnen. Legen Sie die Platte dann sieben Tage lang im Zellkultur-Inkubator auf, bevor Sie die immunfluoreszierende Färbung gemäß dem Protokoll im Manuskript erhalten. Nach inkubations- und Immunfärbung können die Platten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden.Nach der Immunfärbung kann der endliche Titer der intra- und extrazellulären Partikel mit der entsprechenden Formel wie angegeben berechnet werden. Nach der Zielzellinfektion mit zellkulturabgeleiteten E-Viruspartikeln durch serielle Verdünnung sind von den Zellkulturen, die mit den nicht umhüllten intrazellulären Hepatitis-E-Viruspartikeln infiziert sind, Tistern zwischen einem mal 10 bis zum fünften und dreimal 10 bis zu den sechs Fokusbildenden Einheiten pro Milliliter zu erwarten. In Kulturen, die mit umhüllten extrazellulären Zellkulturen infiziert sind, werden Tiellen zwischen einem Mal 10 bis zur Sekunde und ein mal 10 bis zum vierten Fokus bildende Einheiten pro Milliliter erwartet.Darüber hinaus ist das Verhältnis zwischen Genomkopien und nicht umhüllten intrazellulären virusischen Partikeln in der Regel niedriger als bei extrazellulären Zellkulturen, die von Hepatitis-E-Virusinfizierten beobachtet wurden, was auf eine höhere spezifische Infektiosität der nicht umhüllten Hepatitis-E-Virusarten hindeutet. Die Produktion von viralen Partikeln und die Infektion mit Zielzellen erfordern einen vollständigen viralen Lebenszyklus und können neue Einblicke in Virus-Host-Interaktionen liefern. Dieses Protokoll kann geändert werden, um Replikationskinetik durchzuführen oder Partikel zu erzeugen, die in Infektionstests verwendet werden können.Der größte Teil unserer Forschung hängt derzeit von infektiösen Partikeln ab, sowohl im umhüllten als auch im nicht umhüllten HEV. Und Artikel, die unsere Techniken verwenden, werden derzeit veröffentlicht.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...