Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה לסוזן אמרסון. על וירוס הפטיטיס p6 שיבוט מערכת החיסון העצמי הספציפית של הארנב מסופקת באדיבות ריינר אולריך, מכון פרידריך לופלר, גרמניה. כמו כן, אנו מודים לכל חברי המחלקה לוירולוגיה מולקולרית ורפואית באוניברסיטת רוהר בוכום על תמיכתם ושיוריהם. דמויות 1-7 נוצרו עם BioRender.com.

הערה: כל הניסויים מתבצעים תחת תנאי BSL-2. כל החומרים שנכנסים במגע עם הפטיטיס וירוס RNA או וירוס זיהומיות יש לשטוף כראוי עם 4% Kohrsolin FF ממיכל פסולת בתוך המכסה לפני לסילוק.
1. הכנה פלסמיד
<ol><li>אינוהחסן 200 mL ליברות מדיום המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם השתנה הJM109 coli שילוב של קידוד פלאבין ?...

החל עם ההכנה הפלסטיות, התשואות DNA צריך לחרוג 150 ng/μL כדי להיות מסוגל לבצע לינריזציה מרובים מן המלאי באותו פלסטלינה, אשר ממזער את הסיכון של חיידקים המושרה מוטגנזה של רצפי הגנום המכריע. יתר על כן, חשוב לבדוק את תקציר ההגבלה עבור שורה מלאה פלריזציה על ידי ג'ל אלקטרופורזה (איור 8b). ...

צהבת E היא מחלה די מזלזל עם שכיחות גוברת ברחבי העולם. כ 20,000,000 זיהומים לגרום ליותר מ 70,000 מקרי מוות בשנה1. הסוכן הבסיסי, וירוס הפטיטיס (שלום), הוצב מחודש לאחרונה והוא מסווג כיום בתוך המשפחה Hepe, כולל הנגיף האורתופהווירוס ו piscihepevirus. האוהב של מקורות שונים מסווג בתוך מינים Orthohepevirus A-D כולל מבודד מבני אדם, חזיר, ארנבים, חולדות, ציפורים ויונקים אחרים2. בזמן הנוכחי, שמונה גנוסוגים שונים (GT) של חיובי, וירוס יחיד שנתקע RNA זוהו2. למרות שהם נבדלים בזהות הרצף שלהם, נתיבי שידור והפצה גיאוגרפית, מבנה גנומית שלהם הוא שימור מאוד. יותר ספציפי, הגנום 7.2 kbp האוהב מחולק ל 3 מסגרות קריאה הגדול פתוח (ORF1 -3). בעוד ORF1 מקודד את כל האנזימים הדרושים עבור שכפול מוצלח בתא המארח, ORF2 מקודד את חלבון הקפיסיד, והחלבון ORF3 מתפקד כערוץ יונים פונקציונלי הנדרש להרכבה ושחרור של חלקיקים זיהומיות3. שוחרר פעם לתוך הבסיס או לומן פסגה חי קיים בשני, quasienveloped ו מינים לא עטוף/עירום תלוי אם הנגיף מקורו דם או צואה, בהתאמה4,5.
בעוד GT1 ו GT2 נמצאים בעיקר במדינות מתפתחות רק מדביק את בני האדם6 דרך הדרך הצואה אוראלי, GT3, GT4 ו GT7 מתרחשים בעיקר במדינות מפותחות1,7 עם מגוון של מינים המשרתים כמו מאגרים, למשל, חזיר8, חולדה9, עוף10,11, צבי12,,22נמייה13, בת14, ארנב15,16, בר חזיר17 ועוד הרבה יותר7,18,19, מתן ראיות של zoonosis7,20,21 בנוסף לתנאים הסניטריים מספיק23 ומוצרי מזון מזוהם12,24,25,26, העברה באמצעות עירוי דם ושתילת איברים ניתן גם כן27,28. אוהב הוא גורם נפוץ של שחמת הכבד וכישלון הכבד29 במיוחד בחולים עם מחלת הכבד הקיימים מראש, אנשים בסיכון חיסוני (גנוטיפ 3, 4 ו 7) ונשים הרות (גנוטיפ 1). של הערה, יש גם ביטויים מחוץ לכבד כגון מחלה המטפאות30,31,32, הפרעות נוירולוגיות33 ופציעה הכליה34.
עד כה, התרופה מחוץ לתווית ריבוירין (rbv) היא הטיפול בבחירה עבור חולים רבים נגועים35,36. עם זאת, דווח על מקרים של כישלון הטיפול והתוצאות הרפואיות העניות לטווח הארוך דווחו. כישלון הטיפול נקשר מוטגנזה ויראלית ומוגברת טרוגניות ויראלי בחולים37נגועים באופןכרוני 37,38,39. להפך, האחרונה רטרוספקטיבי האירופי הכנס למחקר לא היה מסוגל לתאם פולימונאז מוטציות לכשל הטיפול RBV40. בתצפיות קליניות ובניסויים מחוץ למבחנה, אינטרפרון41,42,43, sofosbuvir44,45, מלחי אבץ46 ו-סילברול47,48 הראו גם אפקטים אנטי-ויראליים. למרות זאת, טיפול מסוים בנושא החיים נותר להימצא, והוא מושפע מחוסר הידע על מחזור חיי החיות והפתוגנזה שלה. לפיכך, מערכת תרבות תא חזקה למחקרים וירולוגיים ופיתוח תרופות אנטי-ויראליות חדשות, נחוצה בדחיפות49.
למרבה הצער, כמו וירוסים אחרים הפטיטיס, כלומר, קשה להפיץ בקווי התא קונבנציונאלי בדרך כלל מתקדם לאט מאוד מוביל ויראלי נמוך עומסים. אף על פי כן, קבוצות מסוימות הצליחו להגביר את העומסים ויראלי על ידי הדור של קו התא subclones50 או התאמה של תוספי מדיה51. לאחרונה הדור של cdna שיבוטים52 ו עיבוד של המטופל הראשי מבודד על ידי passaging53,54 הפצת האוהב משופרת נוסף בתרבות התא55. בפרוטוקול זה, השתמשנו הגנום של תרבות התא הותאם מאמץ Kernow-C1 (המכונה p6_WT)54 ו מוטציה זן מחסה מוטציה שיפור שכפול (המכונה p6_G1634R)37. Kernow-C1 הוא זן הנפוץ ביותר בתרבות תא מאוהב והוא מסוגל לייצר עומסים ויראלי גבוהה. על ידי הערכת ויראלי מספרים העתק RNA, שכפול האוהב יכול להיות מנוטרים בתוך מבחנה. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות הערכה של מספר החלקיקים הזיהומיות המיוצרים. לכן, יש לנו הקימה מודלובורנציה כתמים כדי לקבוע מיקוד ויוצרים יחידות (FFU/mL).
השיטה המתוארת כאן56 יכולה לשמש להפקת חלקיקים ויראליים מדבקים באורך מלא, המסוגלים להדביק מגוון סוגי תאים ממקורות שונים, כולל תאים ראשוניים וקווי תאים. זהו תנאי מוקדם בסיסי לפענח היבטים חשובים של זיהום והטרוריזם. אין צורך בחיסונים. בדרך כלל מוגבלים בחולים הייצור של חלקיקי אוהב זיהומיות מפלמידים מהווה מקור אינסופי, מה שהופך פרוטוקול זה זהובה יעיל. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש עבור הגנטיקה הפוכה המאפשרת את המחקר של שינוי הגנום מזוהה vivo ואת השפעתם על שכפול וכושר. טכניקה זו גוברת על מגבלות רבות, ויכולה לסלול את הדרך להתפתחות הסמים, ללימודי מוטגנזה ולהערכת אינטראקציות של מארחי וירוסים כגון מגבלות או מקדמי כניסה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

וירוס צהבת E הוא הגורם המוביל של שחמת הכבד ואת אי ספיקת כבד עם הגדלת שכיחות ברחבי העולם. וירוס ה-RNA היחיד המועבר ברובו על ידי עירויי דם, תנאים סניטריים מספיקים ומוצרי מזון מזוהמים. כדי לצאת התרופה מחוץ לתווית ריבוירין (rbv) היא הטיפול בבחירה עבור חולים רבים. למרות זאת, יש לזהות את הטיפול המסוים. עד כה, הידע על מחזור החיים האוהב והפתוגנזה הושפע באופן קשה בשל היעדר מערכת יעילה של התרבות התאית של הגוף. מערכת התרבות הסלולרית האיתנה חיונית לחקר מחזור החיים הנגיפי הכולל גם את הפתוגנזה הנגיפית. עם השיטה המתוארת כאן ניתן לייצר מגדל ויראלי של עד 3 x 106 מיקוד להרכיב יחידה/ml (ffu/ml) של האדם הלא עטוף ואת עד 5 x 104 ffu/ml של מעטפת. באמצעות חלקיקים אלה, ניתן להדביק מגוון של תאים של מקורות מגוונים, כולל תאים ראשוניים ואנושיים, כמו גם קווי תאים של בעלי חיים. הייצור של חלקיקי אוהב זיהומיות מפלמידים מהווה מקור אינסופי, מה שהופך את הפרוטוקול הזה ליעיל ביותר.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההפקה של חברת הייטק מדבקת. הצעד הראשון הוא לבודד את ה-DNA פלמיד (pBluescript_SK_HEVp654 ו-PBLUESCRIPT_SK_HEVP6-G1634R37, איור 8a), אשר לאחר מכן הוא לאחר לבידוד על ידי הגבלת העיכול ומטוהר עבור תמלול מתורבת (איור 1). ניתן לאמת לינלון מוצ...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

מתוארים כאן היא שיטה יעילה כיצד לייצר מניות סיכוייו גבוהה ויראלי של וירוס הפטיטיס E (האוהב) כדי להדביק ביעילות תאים hepatoma. עם השיטה המוצגת, הן לא מעטפת, כמו גם חלקיקים ויראלי מעטוף ניתן לקצור ומשמש לצורך הצגת קווי תאים שונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

מחקר וירוס הפטיטיס E כבר קשה על ידי היעדר מערכת תרבות תאים יעילה. הטכניקות שלנו מתגברות על מגבלות אלה וסוללות את הדרך לעיצוב תרופות ופיתוח חיסונים. עם פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לייצר וירוסים טיטר גבוה זיהומיות של חלקיקי HEV שאינם מעטפה ומעטפה, להקל על זיהום של מגוון רחב של תאים.ביצוע פרוטוקול זה דורש גישה למתקן BSA-2 וניסיון בטכניקות בסיסיות של תרבות תאים. כדי להפוך את הדנ"א הפלסמיד ליניארי, יש לערבב 10 מיקרוגרם של הדנ"א של התבנית עם 10 מיקרוליטרים של חיץ ושני מיקרוליטרים של אנזים הגבלת המיקרוקוקוס לוטוס ולהתאים את הנפח הסופי ל-100 מיקרוליטרים במים. ואז לה הדגיר את הפתרון במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולאשר ליניאריזציה של פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר בידוד DNA פלסמיד ליניאריזציה, ההצלחה של ליניאריזציה ניתן לאמת על ידי השוואת ה- DNA פלסמיד לא מתעכל ל- DNA פלסמיד מתעכל על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לקבלת תמלול במבחנה של הדנ"א המטוהר, באורך מלא של נגיף הפטיטיס E, יש לערבב שני מיקרוגרם של תבנית הדנ"א ליניארית עם חברי ההנהלה המתאימים ולהשתמש במים נטולי גרעין כדי להביא את הנפח הסופי של הפתרון ל-100 מיקרוליטרים. לאחר ערבוב יסודי, הדגירה את הפתרון במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר שעתיים, מוסיפים שני מיקרוליטרים נוספים של פולימראז T7 RNA לצינור. לאחר מכן מערבבים את התגובה ו דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים נוספות. בסוף הדגירה, לעכל את תבנית ה-DNA הראשונית עם 7.5 microliters של DNAs עם ערבוב יסודי דגירה במשך 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר החילוץ, בזהירות לבדוק את שלמות RNA ותפוקה על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקרה של RNAs נמוך abundancy, להקות נפרדות, ולא כתם מטושטש יש לצפות. חלק מהצעדים דורשים ביצוע מהיר ולכן הכנה יסודית.כמו כן, לשים לב במיוחד שלמות RNA וכדאיות התא. כדי להכין תאים סרטניים בכבד האנושי לייצור וירוס הפטיטיס E שמקורו בתרבות התאים, זרע את התאים ב 20 מיליליטר של DMEM מלא על צלחת תרבות מצופה קולגן 15 ס"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים 90% confluency. בסוף התרבות, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS לפני ניתוק אותם מצלחת תרבות התא עם שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס.תן שימוש חוזר בתאים המנותקים ב-10 מיליליטר של DMEM מלא ותעביר את התאים לצינור חרוט של 50 מיליליטר לספירה. להעביר חמש פעמים 10 לשישה תאים לצינור חדש 50 מיליליטר ולשטוף את התאים פעמיים עם 35 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את התאים על הקרח מבלי להסיר את העל-טבעי.עבור אלקטרופורציה של תאי היעד, תוספת 384 microliters של ציטומיקס עם שני ATP מילימולר וחמישה גלוטתיון מילימולרי, לאחר מכן לאחסן על קרח עד שימוש נוסף. בזהירות להחליף את supernatant עם כל 400 microliters של פתרון. הוסף חמישה מיקרוגרם של רנ"א גנומי נגיפי מטוהר לתאים והעבר את ההשעיה התאית לקובט ארבעה מילימטרים לאלקטרופורציה ב 975 מיקרופאראד ו 270 וולט עבור 20 אלפיות שנייה.לאחר אלקטרופורציה, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את התאים מהר ככל האפשר לתוך 11 מיליליטר של DMEM מלא וזרע 10 מיליליטר של התאים אלקטרופולציה לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ מצופה קולגן. לאחר מכן, להוסיף 1.3 פעמים 10 לתאים החמישיים ב 300 microliters של בינוני באופן שווה על להחליק כיסוי באר אחת של צלחת 24 microtiter מצופה קולגן ולהמקם את הצלחת ואת המנה באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את supernatant בצלחת עם 10 מיליליטר של DMEM טרי ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא במשך שישה ימים נוספים.ביום החמישי עד השביעי, בהתאם לצפיפות התא, לבצע כתמים immunofluorescent של בקרת transfection כדי לאפשר חישוב של מספר התאים המבטאים את חלבון היעד של עניין מנורמל למספר הכולל של תאים. אלקטרופוזיה מוצלחת יכולה להיות מנוטרת על ידי כתמים immunofluorescent של בקרת ההמרה. יעילות ההמרה צריכה לחרוג מ- 40%A מוטציה חסרת שכפול יכולה לשמש כפקד שלילי כדי לאשר את הספציפיות של הכתם.כדי לקצור חלקיקי וירוס הפטיטיס E חוץ-תאיים שמקורם בתרבות התאים, ביום השישי, סנן את העל-טבעי דרך רשת מיקרוליטר של 0.45 כדי להסיר פסולת תאים ולאחסן את נגיף הפטיטיס E הנקצר הנגזר מתרבות התאים החוץ-תאיים בארבע מעלות צלזיוס. עבור קציר חלקיקי נגיף הפטיטיס E שמקורו בתרבות תאית, שטפו תאים עם PBS וניתקו את התאים עם 1.5 מיליליטר של 0.05%Trypsin-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם 8.5 מיליליטר של DMEM ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה.הוסף 1.6 מיליליטר של DMEM להשלים בינוני לכל אלקטרופורציה בודדים שני צינורות תגובה מיליליטר ולהשתמש 800 microliters של המדיום כדי resuspend התאים, ובכך להעביר את התאים לצינורות. להקפיא את התאים החוצה חנקן נוזלי, ולאחר מכן להפשיר את התאים על קרח שלוש פעמים לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה lysates וכתוצאה מכך במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים גרם. ואז להעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים מבלי להפריע כדורי פסולת התא עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.כדי להעריך את titers של מלאי נגיף הפטיטיס E המיוצר לאחרונה חוץ תאית, זרע פעמיים 10 לארבעת התאים לכל 100 microliters של MEM לתוך 60 בארות מרכז של צלחת מיקרוטיטר מצופה קולגן 96 היטב ולמלא את בארות החיצוניות ביותר עם 100 microliters של PBS לבא. לאחר 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 microliters של חלקיקי וירוס חוץ תאיים על טבעי לשורה הראשונה של תאים. לאחר ערבוב יסודי, לדלל באופן סדרתי את תוכן הבאר שש פעמים בריכוז אחד עד שלושה ל הבאר על ידי העברת 50 microliters של supernatant מן השורה הקודמת לשורה הבאה של תאים כפולים עד השורה האחרונה של תאים.כדי להדביק את התאים עם חלקיקי וירוס הפטיטיס E שמקורם בתרבות תאית, להוסיף 25 microliters של חלקיקי וירוס תאיים על טבעי לשורה העליונה של תאים ומערבבים היטב לפני דילול סדרתי של התאים שש פעמים ביחס של אחד עד חמישה עם 25 microliters של דילול כפול כפי שהוכח. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שבעה ימים לפני כתמים immunofluorescent על פי הפרוטוקול בכתב היד. לאחר הדגירה וכתמים חיסוניים, ניתן לנתח את הצלחות באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence.לאחר כשל חיסוני ניתן לחשב את הטיטר הסופי של החלקיקים האינטראקטיביים והחוץ-תאיים באמצעות הנוסחה המתאימה כפי שצוין. לאחר זיהום תא היעד עם חלקיקי וירוס E שמקורם בתרבות התא על ידי דילול סדרתי, titers בין אחד פעמים 10 לחמישי ושלוש פעמים 10 כדי שש יחידות היוקד להרכיב למיליליטר ניתן לצפות מתרבות התא נגועים חלקיקי נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים בתרבות תאית. בתרבויות נגועות בחלקיקי וירוס הפטיטיס E המופקים מתרבית תאים חוץ-תאיים עטופים, צפויים טיטרים בין פעם אחת 10 לשניה ו-10 פעמים להתמקדות הרביעית ויוצרים יחידות למיליליטר.בנוסף, היחס בין עותקי גנום וחלקיקי וירוס זיהומיות תאיים שאינם עטופים הוא בדרך כלל נמוך יותר מזה שנצפה עבור תרבויות נגועות בנגיף הפטיטיס E המופק מתרבות חוץ-תאית, מה שמרמז על זיהום ספציפי גבוה יותר של מיני נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים. ייצור חלקיקים ויראלי וזיהום תאי יעד דורשים מחזור חיים ויראלי מלא, והוא יכול לספק תובנות חדשות על אינטראקציות בין מארח וירוסים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לבצע קינטיקה שכפול או לייצר חלקיקים שניתן להשתמש בהם ב- assays זיהום.רוב המחקר שלנו תלוי כיום בחלקיקים זיהומיות, הן ב- HEV האפוי והן ב- HEV שאינו עטוף. ומאמרים המשתמשים בטכניקות שלנו מתפרסמים כעת.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...