Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
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Siamo grati a Suzanne Emerson per il clone del virus dell'epatite E p6. Il siero iperimmune per conigli operistici per il coniglio È stato gentilmente fornito da Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germania. Inoltre, ringraziamo tutti i membri del Dipartimento di Virologia Molecolare e Medicina della Ruhr University Bochum per il loro sostegno e discussione. Le cifre 1-7 sono state generate con BioRender.com.

NOTA: tutti gli esperimenti vengono eseguiti in condizioni BSL-2. Tutti i materiali che entrano in contatto con l'RNA del virus dell'epatite E o il virus infettivo devono essere sciacquati correttamente con il 4% di Kohrsolin FF da un contenitore di rifiuti all'interno del cofano prima dello smaltimento.
1. Preparazione plasmide
<ol><li>Inoculare 200 mL Di lB contenente 100 g/mL ampicillina con Escherichia coli JM109 trasformato che incorpora una codifica plasmidper la sequenza full...

A partire dalla preparazione del plasmide, i rendimenti del DNA dovrebbero superare i 150 ng/L per poter eseguire la linearizzazione multipla dallo stesso stock di plasmide, il che riduce al minimo il rischio di mutagenesi indotta da batteri di sequenze di genoma cruciali. Inoltre, è importante controllare il digest di restrizione per la linearizzazione plasmidcompleta completa da elettroforesi gel (Figura 8b). Una mancanza di DNA plasmide linearizzato indurrebbe l'amplificazione del cerchi...

L'epatite E è una malattia abbastanza sottovalutata con una crescente prevalenza in tutto il mondo. Circa 20 milioni di infezioni provocano più di 70.000 decessi all'anno1. L'agente sottostante, il virus dell'epatite E (HEV), è stato riassegnato di recente ed è ora classificato all'interno della famiglia Hepeviridae tra cui i generi Orthohepevirus e Piscihepevirus. HEV di varie origini sono classificati all'interno della specie Orthohepevirus A-D compresi isolati da esseri umani, suini, conigli, ratti, uccelli e altri mammiferi2. Attualmente, sono stati identificati otto diversi genotipi (GT) del virus dell'RNA a singolo filamento positivo e a filamentosingolo 2. Sebbene differiscano nella loro identità di sequenza, nelle vie di trasmissione e nella distribuzione geografica, la loro struttura genomica è altamente conservata. Più specifico, il genoma HEV da 7,2 kbp è diviso in 3 grandi frame di lettura aperti (ORF1-3). Mentre ORF1 codifica tutti gli enzimi necessari per una replicazione di successo all'interno della cellula ospite, ORF2 codifica la proteina capside, e la proteina ORF3 opera come un canale ionico funzionale necessario per l'assemblaggio e il rilascio di particelle infettive3. Una volta rilasciato nel lume basale o apicale HEV esiste in entrambe, quasiavvolto e non-avvolto/nudo specie a seconda se il virus proviene da sangue o feci, rispettivamente4,5.
Mentre GT1 e GT2 si trovano principalmente nei paesi in via di sviluppo che infettano esclusivamente gli,esseri umani6 attraverso la via fecale-orale, GT3, GT4 e GT7 si verificano prevalentemente nei paesi sviluppati1,7 con una varietà di specie che servono come serbatoi, ad esempio, suini8, ratto9, pollo10,11, cervo12, mangusta13, pipistrello14, coniglio15,16, cinghiale17 e molti altri7,18,19, fornendo prove di zoonosi7,20,21. Oltre a condizioni sanitarie inadeguate23 e prodotti alimentari contaminati12,24,25,26, trasmissione tramite trasfusione di sangue e trapianti di organi è possibile anche27,28. HEV è una causa comune di cirrosi epatica e insufficienza epatica29 soprattutto nei pazienti con malattia epatica preesistente, individui immunocompromessi (genotipo 3, 4 e 7) e donne incinte (genotipo 1). Da notare, ci sono anche manifestazioni extraepatiche come la malattia ematopoietica30,31,32, disturbi neurologici33 e lesioni renali34.
Ad oggi, il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti infetti35,36. Tuttavia, sono stati segnalati casi di fallimento del trattamento e scarsi esiti clinici a lungo termine. Il fallimento del trattamento è stato collegato alla mutagenesi virale e all'aumento dell'eterogeneità virale nei pazienti cronicamente infetti37,38,39. Al contrario, un recente studio multicentrico retrospettivo europeo non è stato in grado di correlare le mutazioni della polimerasi al fallimento del trattamento RBV40. Nelle osservazioni cliniche e negli esperimenti in vitro, l'interferone41,42,43, il sofosbuvir44,45, i sali di zinco46 e la silvestrol47,48 hanno anche mostrato effetti antivirali. Ciò nonostante, rimane un trattamento specifico HEV, ostacolato dalla mancanza di conoscenza circa il ciclo di vita HEV e la sua patogenesi. Pertanto, è urgentemente necessario un solido sistema di coltura cellulare per gli studi virologici e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali49.
Sfortunatamente, come altri virus dell'epatite, HEV è difficile da propagare nelle linee cellulari convenzionali e di solito progredisce molto lentamente portando a bassi carichi virali. Tuttavia, alcuni gruppi sono stati in grado di aumentare i carichi virali con la generazione di subcloni linea cellulare50 o la regolazione dei supplementi multimediali51. Recentemente la generazione di cloni cDNA52 e l'adattamento del paziente primario isola passando53,54 ulteriormente migliorato la propagazione HEV nella coltura cellulare55. In questo protocollo, abbiamo usato il genoma di una coltura cellulare adattata ceppo Dikernow-C1 (noto come p6_WT)54 e un ceppo mutante che ospita una mutazione che migliora la replicazione (indicata come p6_G1634R)37. Kernow-C1 è il ceppo più usato nella coltura cellulare HEV ed è in grado di produrre carichi virali elevati. Valutando i numeri di copia dell'RNA virale, la replicazione HEV può essere monitorata in vitro. Tuttavia, queste tecniche non consentono la valutazione del numero di particelle infettive prodotte. Pertanto, abbiamo stabilito una colorazione immunofluorescenza per determinare le unità di formatura a fuoco (FFU/mL).
Il metodo qui descritto56 può essere utilizzato per produrre particelle virali infettive a tutta lunghezza che sono in grado di infettare una varietà di tipi di cellule provenienti da diverse origini, tra cui cellule primarie e linee cellulari di mammiferi. Questo è un prerequisito fondamentale per decifrare aspetti importanti dell'infezione e del tropismo HEV. Non è necessario l'inoculazione con isolati di pazienti solitamente limitati. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo relativamente efficiente. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per la genetica inversa che consente lo studio dell'alterazione del genoma identificato in vivo e il loro impatto sulla replicazione e la forma fisica dell'HEV. Questa tecnica supera molti limiti e, può tracciare la strada per lo sviluppo di farmaci, gli studi di mutagenesi e la valutazione delle interazioni virus-ospite come fattori di restrizione o di ingresso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Il virus dell'epatite E è la principale causa di cirrosi epatica e insufficienza epatica con crescente prevalenza in tutto il mondo. Il virus dell'RNA a singolo filamento è trasmesso prevalentemente da trasfusioni di sangue, condizioni sanitarie inadeguate e prodotti alimentari contaminati. Ad oggi il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti. Tuttavia, resta da identificare un trattamento specifico heV. Finora, le conoscenze sul ciclo di vita e sulla patogenesi HEV sono state gravemente ostacolate a causa della mancanza di un efficiente sistema di coltura cellulare HEV. Un robusto sistema di coltura cellulare è essenziale per lo studio del ciclo di vita virale che include anche la patogenesi virale. Con il metodo qui descritto si possono produrre titer virali fino a 3 x 106 messa a fuoco formando unità/mL (FFU/mL) di HEV non invilita e fino a 5 x 104 FFU/mL di HEV inviluppo. Utilizzando queste particelle, è possibile infettare una varietà di cellule di origini diverse, tra cui cellule primarie e umane, così come linee cellulari animali. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo estremamente efficiente.

In questo protocollo, descriviamo la produzione di alto titro infettivo HEVcc. Il primo passaggio consiste nell'isolare il DNA plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), che viene quindi linearizzato dalla digestione delle restrizioni e purificato per latrascrizionein vitro ( Figura 1 ). Una linearizzazione di successo può essere verificata confrontando il plasmide-DNA non digeri...

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A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Descritto qui è un metodo efficace su come produrre elevati stock di titro virale del virus dell'epatite E (HEV) per infettare in modo efficiente le cellule dell'epatoma. Con il metodo presentato, sia le particelle virali non avvolte, sia le particelle virali avvolte possono essere raccolte e utilizzate per inoculare varie linee cellulari.

Un modello di coltura cellulare per la produzione di titoli di epatite ad alto tire e virus

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

La ricerca sul virus dell'epatite E è stata ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura cellulare. Le nostre tecniche superano questi limiti aprendo la strada alla progettazione di farmaci e allo sviluppo di vaccini. Con questo protocollo, siamo in grado di produrre virus infettivi ad alto formicolio di particelle HEV non avvolte e avvolte, facilitando l'infezione di una varietà di cellule.L'esecuzione di questo protocollo richiede l'accesso a una struttura BSA-2 e l'esperienza con le tecniche di coltura cellulare di base. Per linearizzare il DNA plasmide, mescolare 10 microgrammi del DNA template con 10 microlitri di tampone e due microlitri dell'enzima di restrizione Micrococcus luteus e regolare il volume finale a 100 microlitri con acqua. Quindi incubare la soluzione per un'ora a 37 gradi Celsius e confermare la linearizzazione del plasmide mediante elettroforesi del gel di agarosio secondo protocolli standard.Dopo l'isolamento e la linearizzazione del DNA plasmide, il successo della linearizzazione può essere verificato confrontando il DNA plasmide non digerito con il DNA plasmide digerito per elettroforesi gel. Per la trascrizione in vitro del DNA del virus dell'epatite E purificato e a figura intera, mescolare due microgrammi del modello di DNA linearizzato con i reagenti appropriati e utilizzare acqua priva di nucleo per portare il volume finale della soluzione a 100 microlitri. Dopo un'accurata miscelazione, incubare la soluzione per due ore a 37 gradi Celsius.Dopo due ore, aggiungere altri due microlitri di T7 RNA polimerasi al tubo. Quindi mescolare la reazione e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per altre due ore. Alla fine dell'incubazione, digerire il modello di DNA iniziale con 7,5 microlitri di DNA con miscelazione approfondita e incubare per 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'estrazione, controllare attentamente l'integrità e la resa dell'RNA mediante elettroforesi del gel di agarosio secondo protocolli standard. Nel caso di bassa abundancy RNA, si dovrebbero osservare bande distinte, piuttosto che uno striscio sfocato. Alcuni passaggi richiedono un'esecuzione rapida e quindi una preparazione approfondita.Inoltre, prestare particolare attenzione all'integrità dell'RNA e alla vitalità cellulare. Per preparare le cellule tumorali del fegato umano per la produzione di virus dell'epatite E derivata dalla coltura cellulare, seminare le cellule in 20 millilitri di DMEM completo su un piatto di coltura rivestito di collagene di 15 centimetri e incubare a 37 gradi Celsius fino a raggiungere il 90% di confluenza. Alla fine della coltura, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS prima di staccarle dalla piastra di coltura cellulare con tre millilitri dello 0,05%Trypsin-EDTA a 37 gradi Celsius.Rimospendare le cellule staccate in 10 millilitri di DMEM completo e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri per il conteggio. Trasferire cinque volte 10 alle sei celle in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavare le celle due volte con 35 millilitri di PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, posizionare le cellule sul ghiaccio senza rimuovere il supernatante.Per l'elettroporazione delle cellule bersaglio, integrare 384 microlitri di citomix con due ATP millimolare e cinque glutationi millimolari, successivamente conservare sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Sostituire con cura il supernatante con tutti i 400 microlitri di soluzione. Aggiungere cinque microgrammi di RNA genomico virale purificato alle cellule e trasferire la sospensione cellulare in una cuvetta di quattro millimetri per l'elettroporazione a 975 microfarad e 270 volt per 20 millisecondi.Dopo l'elettroporazione, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cellule il più rapidamente possibile in 11 millilitri di DMEM completo e seminare 10 millilitri delle cellule elettroporate in un piatto di coltura di 10 centimetri rivestito di collagene. Successivamente, aggiungere 1,3 per 10 alla quinta cella in 300 microlitri di mezzo uniformemente su un coperchio scivolare in un pozzo di una piastra da 24 microtiter rivestita di collagene e posizionare la piastra e il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il supernatante nel piatto con 10 millilitri di DMEM fresco e restituire il piatto all'incubatore di coltura cellulare per altri sei giorni.Il quinto e settimo giorno, a seconda della densità cellulare, eseguire la colorazione immunofluorescente del controllo della trasfezione per consentire il calcolo del numero di cellule che esprimono la proteina bersaglio di interesse normalizzata al numero totale di cellule. L'elettroporazione riuscita può essere monitorata mediante colorazione immunofluorescente del controllo della trasfezione. L'efficienza di trasfezione deve superare il 40%Un mutante carente di replicazione può servire come controllo negativo per confermare la specificità della colorazione.Per raccogliere particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare, il sesto giorno, filtrare il supernatante attraverso una rete da 0,45 microliter per rimuovere eventuali detriti cellulari e conservare il virus dell'epatite E derivato dalla coltura cellulare extracellulare raccolto a quattro gradi Celsius. Per la raccolta di particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare, lavare le cellule con PBS e staccare le cellule con 1,5 millilitri dello 0,05%Tripside-EDTA a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con 8,5 millilitri di DMEM e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri per la centrifugazione.Aggiungere 1,6 millilitri di mezzo completo DMEM per elettroporazione a singoli due tubi di reazione millilitro e utilizzare 800 microlitri del mezzo per rimescolare le celle, trasferendo così le cellule ai tubi. Congelare le cellule in azoto liquido e successivamente scongelare le cellule sul ghiaccio tre volte prima che l'alta velocità centrifughi i lisati risultanti per 10 minuti a 10.000 volte g. Quindi trasferire i supernatanti in nuovi tubi senza disturbare i pellet di detriti cellulari per uno stoccaggio di meno 80 gradi Celsius.Per valutare i titoli delle scorte di virus dell'epatite E intra ed extracellulare di nuova produzione, seminare due volte 10 alle quattro cellule per 100 microlitri di MEM per pozzo nei 60 pozzi centrale di una piastra microtitere a 96 possiedi rivestita di collagene e riempire i pozzi più esterni con 100 microlitri di PBS per pozzo. Dopo 24 ore a 37 gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri di supernatante di particelle del virus extracellulare alla prima fila di cellule. Dopo aver accuratamente miscelato, diluire in serie il contenuto del pozzo sei volte a una concentrazione da uno a tre per pozzo trasferendo 50 microlitri di supernatante dalla riga precedente a quella successiva di cellule in duplicato fino all'ultima riga di cellule.Per infettare le cellule con particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare, aggiungere 25 microlitri del supernatante di particelle del virus intracellulare alla riga superiore delle cellule e mescolare ben prima di diluire serialmente le cellule sei volte a un rapporto uno-cinque con 25 microlitri di diluizione in duplicato come dimostrato. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per sette giorni prima della colorazione immunofluorescente secondo il protocollo nel manoscritto. Dopo l'incubazione e la colorazione immunitaria, le piastre possono essere analizzate utilizzando la microscopia ad immunofluorescenza.Dopo aver immunosottento il ttare finale delle particelle intra ed extracellulari può essere calcolato utilizzando la formula appropriata come indicato. Dopo l'infezione cellulare bersaglio con particelle del virus E derivate dalla coltura cellulare per diluizione seriale, ci si può aspettare che dalle colture cellulari infettate dalle particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare non avvolte si possano aspettare tiche di formatura a fuoco per millilitro. Nelle colture infettate da particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare avvolte, sono previsti formicolii tra uno per 10 e il secondo e uno per 10 alla quarta unità di formazione di messa a fuoco per millilitro.Inoltre, il rapporto tra le copie del genoma e le particelle di virus infettivi intracellulari non avvolte è tipicamente inferiore a quello osservato per le colture infettate da particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare, suggerendo una maggiore infettività specifica delle specie di virus dell'epatite E non avvolte. La produzione di particelle virali e l'infezione cellulare bersaglio richiedono un ciclo di vita virale completo e possono fornire nuove informazioni sulle interazioni virus-ospite. Questo protocollo può essere modificato per eseguire cinetica di replicazione o per produrre particelle che possono essere utilizzate nei test di infezione.La maggior parte delle nostre ricerche attualmente dipende da particelle infettive, sia nell'HEV avvolto che in quello non avvolto. E articoli che utilizzano le nostre tecniche sono attualmente in fase di pubblicazione.

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An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Un modello di cultura Bursal-cellula primaria di pollo Ex Vivo per studiare la patogenesi Virus bursite infettiva

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...