Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

우리는 E형 간염 바이러스 p6 클론에 대한 수잔 에머슨에 감사드립니다. HEV 특이토끼 하이퍼면역 혈청은 독일 프리드리히 로플러 연구소인 라이너 울리히(Rainer Ulrich)가 친절하게 제공했습니다. 또한, 우리는 그들의 지원과 토론에 대한 루르 대학 보훔에서 분자 및 의학 바이러스학과의 모든 구성원에게 감사드립니다. 도 1-7은 BioRender.com 생성되었다.

참고: 모든 실험은 BSL-2 조건하에서 수행됩니다. E형 간염 바이러스 RNA 또는 전염성 바이러스와 접촉하는 모든 물질은 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 4% Kohrsolin FF로 올바르게 헹구어야 합니다.
1. 플라스미드 준비
<ol><li>100 μg/mL 암피실린을 함유한 이노큐레이트 200 mL LB 배지는 전신 HEV gt3 Kernow-C1p6 서열(pBluescript_SK_HEVp6[JQ679013]54 또는 pBluescript_SK_HEVp6-G...

플라스미드 제제를 시작으로, DNA 수율은 150 ng/μL을 초과하여 동일한 플라스미드 스톡에서 다중 선형화를 수행할 수 있어야 하며, 이는 중요한 게놈 서열의 박테리아 유발 돌연변이 발생 위험을 최소화합니다. 더욱이, 겔 전기포에 의한 완전한 플라스미드 선형화에 대한 제한 다이제스트를 확인하는 것이중요하다(도 8b). 선형화된 플라스미드 DNA의 부족은 생체 외 전사가 덜 ?...

E형 간염은 전 세계적으로 보급이 증가하는 상당히 과소 평가된 질병입니다. 대략 2천만 개의 감염은1년에70,000의 죽음 귀착됩니다. 기본 에이전트, E형 간염 바이러스 (HEV), 최근에 재할당되고 지금 제네라 Orthohepevirus 및 Piscihepevirus를 포함하여 가족 Hepeviridae 안에 분류됩니다. 다양한 기원의 HEV는 인간, 돼지, 토끼, 쥐, 조류 및 기타 포유동물2로부터분리된 것을 포함하여 종 오르토헤페바이러스 A-D 종 내에서 분류된다. 현재, 양성 지향성, 단일 좌초 RNA 바이러스의 8가지 상이한 유전자형(GT)이2로확인되었다. 그들은 그들의 순서 정체성, 전송 경로 및 지리적 분포에서 다르지만, 그들의 게놈 구조는 높게 보존됩니다. 보다 구체적으로, 7.2 kbp HEV 게놈은 3개의 주요 개방 판독 프레임(ORF1-3)으로 나뉩니다. ORF1은 숙주 세포 내에서 성공적인 복제에 필요한 모든 효소를 인코딩하는 동안, ORF2는 캡시드 단백질을 인코딩하고, ORF3 단백질은 전염성 입자의 조립 및 방출에 필요한 기능성 이온 채널로작동한다 3. 일단 기저 또는 어형 루멘 HEV에 방출되면 바이러스가 혈액 또는 대변에서 유래하는지 여부에 따라 준 봉투 및 비 봉투 / 벌거 벗은 종, 각각4,,5에존재한다.
GT1과 GT2는 주로 개발 도상국에서 발견 되 고 만 인간을,감염6 배설물 구두 경로 통해, GT3, GT4 및 GT7은 주로 선진국 에서 발생,71,,7 저수지로 봉사 하는 종의 다양한, 예를 들어, 돼지8,쥐9,닭10,,11,사슴12,몽구스13,박쥐14,토끼15,,16,야생 멧돼지17 그리고 더 많은7,,18,,19,동물원의 증거를제공,20, 20.2122 부적절한 위생조건(23)과 오염된식품(12,,24,,,25,26)이외에 수혈 및 장기 이식을 통한 전송도27,,28로가능하다. HEV는 간경변과 간 부전의 일반적인원인(특히 기존 간질환 환자, 면역손상형 3, 4, 7) 및 임산부(유전자형 1)를 가진 환자에서 특히 있다. ,참고로, 조혈질환(30,30,31,32)신경장애(33) 및신장손상(34)과같은 외형증상도 있다.
현재까지, 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 감염된 환자에 대한 선택의치료입니다 35,,36. 그러나, 치료 실패와 가난한 임상 장기 결과의 경우 보고 되었습니다. 치료 실패는 만성 감염 환자에서 바이러스 돌연변이 발생 및 증가 된 바이러스 성 이질성에 연결되었습니다37,,38,,39. 반대로, 최근 유럽의 회고전 다중센터 연구는 중합효소 돌연변이를 RBV 치료실패(40)와상관연관시킬 수 없었다. 임상 관찰 및 체외 실험에서 인터페론41,,42,,43,소파부비르44,,45,아연 염46 및 실베스트롤47,,48도 항바이러스 효과를 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 발견 될 남아, HEV 라이프 사이클및 그것의 병인에 대 한 지식의 부족에 의해 방해. 따라서, 바이러스학 연구 및 새로운 항바이러스 약물의 개발을 위한 견고한 세포 배양 시스템이 절실히 필요하다49.
불행히도, 다른 간염 바이러스와 마찬가지로 HEV는 기존의 세포주에서 전파하기가 어렵고 일반적으로 바이러스 부하가 적기 때문에 매우 느리게 진행됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 그룹 셀 주 subclones의 생성에 의해 바이러스 부하를 높일 수 있었다50 또는 미디어 보충제의 조정51. 최근에는 cDNA클론(52)의 생성과 1차 환자의 적응이53,,54로 세포배양에서HEV 전파를 더욱 개선하여 분리한다. 본 프로토콜에서, 우리는 Kernow-C1 균주(p6_WT라고 함)및 복제 강화 돌연변이(p6_G1634R라고 함)를 수용하는 돌연변이 균주(p6_G1634R)를 적응한 세포 배양의 게놈을 사용했다.37 Kernow-C1은 HEV 세포 배양에서 가장 자주 사용되는 변형이며 높은 바이러스 부하를 생성 할 수 있습니다. 바이러스 RNA 복사 번호를 평가함으로써 HEV 복제를 시험관 내에서 모니터링할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 생성되는 전염성 입자의 수의 평가를 허용하지 않습니다. 따라서, 우리는 초점 성형 단위 (FFU/mL)를 결정하기 위하여 면역 형광 염색을 설치했습니다.
본 설명된방법(56)은 1차 세포 및 포유류 세포주를 포함한 다양한 기원으로부터 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있는 전신 전염성 바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이것은 HEV 감염과 트로피주의의 중요한 측면을 해독하기 위한 근본적인 전제 조건입니다. 일반적으로 제한된 환자 격리를 가진 접종을 위한 필요가 없습니다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 포즈, 이 프로토콜을 비교적 효율적으로. 또한, 이 시스템은 생체 내에서 확인된 게놈 변경 및 HEV 복제 및 적합성에 미치는 영향을 연구가능하게 하는 역유전학에 사용될 수 있다. 이 기술은 많은 한계를 극복하고, 약물 개발, 돌연변이 발생 연구 및 제한 또는 진입 요인과 같은 바이러스 호스트 상호 작용의 평가를 위한 길을 길수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

E형 간염 바이러스는 전 세계적으로 증가하는 보급과 간 간 경변및 간 부전의 주요 원인입니다. 단일 좌초 RNA 바이러스는 주로 수혈, 부적절한 위생 조건 및 오염된 식품에 의해 전달됩니다. 현재까지 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 환자를위한 선택의 치료입니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 확인 될 남아. 지금까지 HEV 수명 주기 및 병인에 대한 지식은 효율적인 HEV 세포 배양 시스템의 부족으로 인해 심각하게 방해받고 있습니다. 강력한 세포 배양 시스템은 또한 바이러스성 병인을 포함하는 바이러스성 생활 주기의 연구 결과에 필수적입니다. 여기에 설명된 방법을 통해 최대 3 x 106 초점 성형 장치/mL(FFU/mL)의 바이러스 성 티터를 생성할 수 있으며, 봉투에 싸인 HEV의 최대 5 x 104 FFU/mL을 생성할 수 있다. 이러한 입자를 이용하여, 동물 세포주뿐만 아니라 1차 세포 및 인간을 포함한 다양한 기원의 세포를 감염시킬 수 있다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 제기, 이는이 프로토콜을 매우 효율적으로.

이 프로토콜에서, 우리는 높은 티터 전염성 HEVcc의 생산을 설명합니다. 첫 번째 단계는 플라스미드 DNA(pBluescript_SK_HEVp654 및 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, 도 8a)를분리하는 것으로, 그 후 제한 소화에 의해 선형화되고 체외 전사용 정제(도1)이다. 성공적인 선형화는 젤 전기포고를 사용하여 소화되지 않은 플라스미드-DNA와 비?...

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A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

여기에 설명된 이종세포를 효율적으로 감염시키기 위해 E형 간염 바이러스(HEV)의 높은 바이러스 성 티터 스톡을 생성하는 방법에 대한 효과적인 방법이 기재되어 있다. 제시된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 모두 수확하고 다양한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있다.

높은 티더 E 바이러스 주식을 생산하기위한 세포 배양 모델

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

E형 간염 바이러스 연구는 효율적인 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해되었습니다. 우리의 기술은 약물 설계 및 백신 개발에 길을 포장 이러한 한계를 극복. 이 프로토콜을 통해, 우리는 다양한 세포의 감염을 용이하게, 비 봉투 와 봉투 HEV 입자 모두의 전염성 높은 티터 바이러스를 생성 할 수 있습니다.이 프로토콜을 실행하려면 BSA-2 시설에 대한 액세스및 기본 세포 배양 기술에 대한 경험이 필요합니다. 플라스미드 DNA를 선형화하려면 템플릿 DNA 10마이크로그램을 10마이크로리터의 완충제와 마이크로코코커스 루테우스 제한 효소의 2마이크로리터를 혼합하고 최종 부피를 물과 함께 100 마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 37°C에서 1시간 동안 용액을 배양하고 표준 프로토콜에 따라 아가로즈 젤 전기포에 의한 플라스미드의 선형화를 확인한다.플라스미드 DNA 절연 및 선형화 후, 비소화 플라스미드 DNA를 겔 전기포진에 의한 소화된 플라스미드 DNA와 비교하여 선형화의 성공을 확인할 수 있다. 정제된 전신 E형 간염 바이러스 DNA의 체외 전사를 위해, 선형화된 DNA 템플릿의 2마이크로그램을 적절한 시약과 혼합하고 핵없는 물을 사용하여 용액의 최종 부피를 100 마이크로리터로 가져옵니다. 철저한 혼합 후, 섭씨 37도에서 2 시간 동안 용액을 배양하십시오.2 시간 후에, 튜브에 T7 RNA 폴리머라제의 추가 2개의 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 반응을 혼합하고 또 다른 2 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 초기 DNA 템플릿을 7.5 마이크로리터의 DNA로 소화하고 30분 동안 섭씨 37도에 대한 철저한 혼합 및 인큐베이션을 사용한다.추출 후 표준 프로토콜에 따라 아가로즈 젤 전기포에 의해 RNA 무결성 및 수율을 신중하게 확인합니다. 낮은 RNA 분다시의 경우, 흐린 얼룩이 아닌 뚜렷한 밴드를 관찰해야 한다. 일부 단계에는 빠른 실행이 필요하므로 철저한 준비가 필요합니다.또한 RNA 무결성 및 세포 생존 가능성에 특별한주의를 기울입니다. 세포 배양 유래 E형 간염 바이러스 생산을 위한 인간 간암 세포를 준비하기 위하여는, 완전한 DMEM의 20 밀리리터에 있는 세포를 15센티미터 콜라겐 코팅 배양 접시에 종자하고 90%의 합류에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양의 끝에서, 37섭씨에서 0.05%의 트립신-EDTA의 3밀리리터로 세포 배양 판에서 분리하기 전에 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척하십시오.완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 분리 된 세포를 다시 중단하고 계산을위한 50 밀리리터 원판 튜브로 세포를 전송합니다. 5회 10번을 6개의 세포로 새로운 50밀리리터 튜브로 옮기고 세척당 PBS 35밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 상체를 제거하지 않고 얼음에 세포를 배치합니다.대상 세포의 전기 화의 경우, 2 밀리머 ATP와 5 밀리머 글루타티온과 사이토 믹스의 384 마이크로 리터를 보충, 이후 추가 사용까지 얼음에 저장. 상체를 전체 400 마이크로리터용 으로 신중하게 교체하십시오. 5마이크로그램의 정제된 바이러스 게놈 RNA를 세포에 추가하고 세포 현탁액을 975 마이크로패드및 20밀리초 동안 전기 포기화를 위한 4mm 큐벳으로 전달합니다.전기화 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포를 가능한 한 빨리 완전한 DMEM의 11 밀리리터로 옮기고 전기 화 세포의 10 밀리리터를 콜라겐으로 코팅한 10센티미터 배양 접시로 전달합니다. 다음으로, 콜라겐 코팅 24 마이크로티터 플레이트의 한 웰에 있는 커버 슬립에 배지 300 마이크로리터에 1.3배 10배를 추가하고 24시간 동안 세포 배양 배양에 접시와 접시를 놓는다. 다음 날, 신선한 DMEM의 10 밀리리터로 요리의 상체를 교체하고 추가 6 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.5~7일째, 세포 밀도에 따라, 총 수의 세포 수로 정규화된 관심의 표적 단백질을 표현하는 세포의 수를 계산할 수 있도록 형질 조절의 면역형 염색을 수행한다. 성공적인 전기기화는 경질 제어의 면역 형광 염색에 의해 감시될 수 있다. 상기 전환 효율은 40%를 초과해야 하며, 복제 결핍 돌연변이제는 염색의 특이성을 확인하기 위한 부정적인 제어역할을 할 수 있다.세포외 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자를 수확하기 위해, 6일째에 0.45 마이크로리터 메쉬를 통해 초신수를 걸러서 세포 이물질을 제거하고 수확된 세포 세포 배양-E형 간염 바이러스를 섭씨 4도에서 저장한다. 세포 내 세포 배양 유래 E형 간염 바이러스 입자 수확을 위해 PBS로 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 0.05 %의 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터로 세포를 분리하십시오. 세포가 분리되면, DMEM의 8.5 밀리리터로 반응을 멈추고 원심분리를 위해 50 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.개별 2 밀리리터 반응 튜브에 전기 화당 DMEM 의 1.6 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단하는 매체의 800 마이크로 리터를 사용하여 세포를 튜브로 이송합니다. 액체 질소에서 세포를 동결하고, 그 후 10, 000 g에서 10 분 동안 결과 용액을 원심 분리하기 전에 얼음에 세포를 세 번 해동. 그런 다음 수퍼네티츠를 영하 80도 저장을 위해 셀 파편 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮기십시오.새로 생산된 인트라 및 세포외 E형 간염 바이러스 주식의 티터를 평가하기 위해, 콜라겐 코팅 96웰 마이크로티터 플레이트의 60중앙 우물에 잘 100 마이크로리터 당 MEM의 100 마이크로리터 당 4개의 세포에 2회 10번 시드하고, 100마이크로리터의 PBS마이크로리터로 가장 바깥쪽 우물을 채웁니다. 섭씨 37도에서 24시간 후, 세포의 첫 번째 행에 세포외 바이러스 입자 수퍼나티 50마이크로리터를 추가합니다. 철저하게 혼합한 후, 전세에서 다음 줄까지 셀의 50마이크로리터를 복제하여 전월체의 마이크로리터를 이전에서 다음 줄로 전송하여 웰당 1~3개의 농도로 우물 내용을 6회 연속적으로 희석시켜 세포의 마지막 행까지 복제한다.세포 내 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자로 세포를 감염시키기 위해, 세포 내 바이러스 입자 의 마이크로리터 25마이크로리터를 세포의 맨 위 줄에 추가하고 연속적으로 희석25 마이크로리터를 사용하여 1~5비율로 세포를 연속적으로 희석하기 전에 잘 혼합한다. 그런 다음 원고의 프로토콜에 따라 면역 형광 염색 전에 7 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 배양 및 면역 염색에 이어, 플레이트는 면역형광 현미경검사를 사용하여 분석될 수 있다.내 세포 및 세포 외 입자의 최종 티터를 면역 염색 한 후 표시된 대로 적절한 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 연쇄 희석에 의한 세포 배양 유래 E 바이러스 입자를 대상으로 표적 세포 감염 후, 1회 10~5회 및 3회 사이에 밀리리터당 6개의 초점 형성 단위에서 비-포위된 세포 내 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자에 감염된 세포 배양으로부터 기대할 수 있다. 포위된 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자에 감염된 배양에서, 1회 10~20일 사이, 10~10회 사이에 글리리터당 제4 초점 형성 단위가 예상된다.또한, 게놈 사본과 비포위된 세포내 전염성 바이러스 입자 사이의 비율은 전형적으로 세포외 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자 감염 배양에 대해 관찰된 것보다 낮으며, 비봉투형 E형 간염 바이러스 종의 더 높은 특이적 감염성을 시사한다. 바이러스 성 입자 생산 및 표적 세포 감염은 완전한 바이러스 성 수명 주기를 필요로하며 바이러스 호스트 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 복제 역학을 수행하거나 감염 분석에서 사용할 수 있는 입자를 생성하도록 수정할 수 있습니다.우리의 연구의 대부분은 현재 포위된 HEV에서 전염되는 입자에 달려 있습니다. 그리고 우리의 기술을 사용하는 기사는 현재 게시되고있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

연구

면역학 및 감염병학

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...