Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Vi er takknemlige til Suzanne Emerson for hepatitt E virus p6 klone. HEV-spesifikk kanin hyperimmun serum ble vennlig levert av Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Videre takker vi alle medlemmer av Institutt for molekylær og medisinsk virologi ved Ruhr University Bochum for deres støtte og diskusjon. Tall 1-7 ble generert med BioRender.com.

MERK: Alle eksperimenter utføres under BSL-2 tilstand. Alle materialer som kommer i kontakt med hepatitt E virus RNA eller smittsomme virus må skylle riktig med 4% Kohrsolin FF fra en avfallsbeholder inne i panseret før avhending.
1. Plasmid forberedelse
<ol><li>Inokulere 200 ml LB medium som inneholder 100 μg/ml ampicillin med forvandlet Escherichia coli JM109 som inneholder en plasmidkoding for hev gt3 Kernow-C1p6-sekvensen i full lengde (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]<sup cl...

Fra og med plasmidpreparatet bør DNA-utbytter overstige 150 ng/μL for å kunne utføre flere linearisering fra samme plasmidlager, noe som minimerer risikoen for bakterier-indusert mutagenese av avgjørende genomsekvenser. Videre er det viktig å sjekke begrensningen fordøye for fullstendig plasmid linearisering av gelelektroforese (Figur 8b). Mangel på linearisert plasmid DNA ville indusere rullende sirkel forsterkning forårsaker in vitro transkripsjon å være mindre effektiv. I tille...

Hepatitt E er en ganske undervurdert sykdom med økende prevalens over hele verden. Om lag 20 millioner infeksjoner resulterer i mer enn 70.000 dødsfall per år1. Det underliggende middelet, Hepatitt E-viruset (HEV), ble nylig omplassert og er nå klassifisert i familien Hepeviridae, inkludert slektene Orthohepevirus og Piscihepevirus. HEV av forskjellig opprinnelse er klassifisert i arten Orthohepevirus A-D inkludert isolater fra mennesker, svin, kaniner, rotter, fugler og andre pattedyr2. I dag har åtte forskjellige genotyper (GT) av det positivorienterte, entrådete RNA-viruset blitt identifisert2. Selv om de varierer i sin sekvensidentitet, overføringsveier og geografisk fordeling, er deres genomiske struktur svært bevart. Mer spesifikt er 7,2 kbp HEV-genomet delt inn i 3 store åpne leserammer (ORF1-3). Mens ORF1 koder alle enzymer som trengs for en vellykket replikering i vertscellen, koder ORF2 capsid-proteinet, og ORF3-proteinet fungerer som en funksjonell iionkanal som kreves for montering og frigjøring av smittsomme partikler3. Når slippes ut i basal eller apical lumen HEV finnes i begge, quasienveloped og ikke-innhyllet / nakne arter avhengig av om viruset stammer fra blod eller avføring, henholdsvis4,5.
Mens GT1 og GT2 hovedsakelig finnes i utviklingsland utelukkende infisere mennesker6 via fekal-muntlig rute, GT3, GT4 og GT7 hovedsakelig forekommer i utviklede land1,,7 med en rekke arter som fungerer som reservoarer, F.eks. svin 8 , rotte9, kylling10,11, hjort12, mongoose13, bat14, kanin15,16, villsvin17 og mange flere7,18,19, gir bevis på zoonosis7,20,21,22.8 I tillegg til utilstrekkelige sanitære forhold23 og forurensede matvarer12,24,25,26, overføring via blodoverføring og organtransplantasjoner er også mulig27,28. HEV er en vanlig årsak til levercirrhose og leversvikt29 spesielt hos pasienter med eksisterende leversykdom, immunkompromitterte individer (genotype 3, 4 og 7) og gravide kvinner (genotype 1). Det er også ekstrahepatiske manifestasjoner som hematopoietisk sykdom30,31,32, nevrologiske lidelser33 og nyreskade34.
Til dags dato er det off-label stoffet ribavirin (RBV) behandling av valget for mange smittede pasienter35,36. Det er imidlertid rapportert tilfeller av behandlingssvikt og dårlige kliniske langsiktige resultater. Behandlingssvikt har vært knyttet til viral mutagenese og økt viral heterogenitet hos kronisk infiserte pasienter37,,38,,39. Tvert imot, en nylig europeisk retrospektiv multisenter studie var ikke i stand til å korrelere polymerase mutasjoner til RBV behandlingssvikt40. I kliniske observasjoner og in vitro eksperimenter, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, sink salter46 og silvestrol47,48 har også vist antivirale effekter. Likevel gjenstår en bestemt HEV-behandling å bli funnet, hemmet av mangel på kunnskap om HEV livssyklusen og dens patogenese. Derfor er et robust cellekultursystem for virologiske studier og utvikling av nye antivirale legemidler raskt nødvendig49.
Dessverre, som andre hepatittvirus, er HEV vanskelig å forplante seg i konvensjonelle cellelinjer og utvikler seg vanligvis veldig sakte fører til lave virusbelastninger. Likevel, noen grupper var i stand til å øke virusbelastninger ved generering av celle linje subclones50 eller justering av media kosttilskudd51. Nylig generering av cDNA kloner52 og tilpasning av primære pasient isolater ved passering53,54 ytterligere forbedret HEV forplantning i cellekultur55. I denne protokollen brukte vi genomet til en cellekultur tilpasset Kernow-C1-stamme (referert til som p6_WT)54 og en mutant stamme som huser en replikeringsfremmende mutasjon (referert til som p6_G1634R)37. Kernow-C1 er den mest brukte belastningen i HEV cellekultur og er i stand til å produsere høy viral belastning. Ved å vurdere virale RNA-kopinumre kan HEV-replikering overvåkes in vitro. Likevel tillater disse teknikkene ikke vurdering av antall smittsomme partikler som produseres. Derfor har vi etablert en immunofluorescensfarging for å bestemme Focus Forming Units (FFU/ml).
Her beskrevne metode56 kan brukes til å produsere smittsomme viruspartikler i full lengde som er i stand til å infisere en rekke celletyper fra ulike opprinnelser, inkludert primærceller og pattedyrcellelinjer. Dette er en grunnleggende forutsetning for å tyde viktige aspekter ved HEV-infeksjon og tropisme. Det er ikke behov for inokulasjon med vanligvis begrensede pasientisolater. Produksjonen av smittsomme HEV-partikler fra plasmider utgjør en uendelig kilde, noe som gjør denne protokollen sammenlignbar effektiv. I tillegg kan dette systemet brukes til omvendt genetikk slik at studiet av in vivo identifisert genom endring og deres innvirkning på HEV replikering og fitness. Denne teknikken overvinner mange begrensninger, og kan bane vei for narkotikautvikling, mutagenese studier og evaluering av virus-vert interaksjoner som begrensning eller oppføring faktorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatitt E-virus er den viktigste årsaken til levercirrhose og leversvikt med økende prevalens over hele verden. Enkelttrådet RNA-virus overføres hovedsakelig av blodoverføringer, utilstrekkelige sanitære forhold og forurensede matvarer. Til dags dato er off-label stoffet ribavirin (RBV) behandling av valget for mange pasienter. Likevel gjenstår en spesifikk HEV-behandling å bli identifisert. Så langt har kunnskapen om HEV livssyklus og patogenese blitt sterkt hemmet på grunn av mangel på et effektivt HEV cellekultursystem. Et robust cellekultursystem er avgjørende for studiet av den virale livssyklusen som også inkluderer viral patogenese. Med metoden beskrevet her kan man produsere virale titers på opptil 3 x 106 fokusformingsenhet / ml (FFU / ml) av ikke-innkapslede HEV og opptil 5 x 104 FFU / ml innhyllet HEV. Ved hjelp av disse partiklene er det mulig å infisere en rekke celler av forskjellig opprinnelse, inkludert primærceller og menneskelige, samt dyrecellelinjer. Produksjonen av smittsomme HEV-partikler fra plasmider utgjør en uendelig kilde, noe som gjør denne protokollen svært effektiv.

I denne protokollen beskriver vi produksjonen av høy titer smittsom HEVcc. Det første trinnet er å isolere plasmid DNA (pBluescript_SK_HEVp654 og pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figur 8a), som deretter er linearisert ved begrensning fordøyelse og renset for in vitro transkripsjon (Figur 1). En vellykket linearisering kan verifiseres ved å sammenligne ikke-fordøyd plasmid-DNA med fordøyd plasmid-DNA ved hjelp ...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Beskrevet her er en effektiv metode for hvordan å produsere høy viral titer bestander av hepatitt E virus (HEV) å effektivt infisere hepatoma celler. Med den presenterte metoden kan både ikke-innkapslede, samt innhyllede viruspartikler høstes og brukes til å inokulere ulike cellelinjer.

En cellekulturmodell for produksjon av høytitre hepatitt E Virus aksjer

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatitt E-virusforskning har blitt hindret av mangelen på et effektivt cellekultursystem. Våre teknikker overvinne disse begrensningene banet vei for narkotika design og vaksine utvikling. Med denne protokollen er vi i stand til å produsere smittsomme høytitrevirus av både ikke-konvolutt- og konvolutt-HEV-partikler, noe som letter infeksjonen av en rekke celler.Gjennomføring av denne protokollen krever tilgang til et BSA-2-anlegg og erfaring med grunnleggende cellekulturteknikker. For å linearisere plasmid-DNA, bland 10 mikrogram av mal-DNA med 10 mikroliter buffer og to mikroliter av Micrococcus luteus begrensningsenzymet og juster det endelige volumet til 100 mikroliter med vann. Deretter inkubere løsningen i en time ved 37 grader Celsius og bekreft linearisering av plasmid ved agarose gel elektroforese i henhold til standardprotokoller.Etter plasmid DNA-isolasjon og linearisering kan suksessen til lineariseringen verifiseres ved å sammenligne det ikke-fordøyde plasmid-DNA med det fordøyde plasmid-DNA ved gelelektroforese. For in vitro transkripsjon av renset, full-lengde hepatitt E virus DNA, bland to mikrogram av den lineariserte DNA-malen med de riktige reagenser og bruk kjernefritt vann for å bringe det endelige volumet av løsningen til 100 mikroliter. Etter grundig blanding, inkuber løsningen i to timer ved 37 grader Celsius.Etter to timer, legg til ytterligere to mikroliter T7 RNA polymerase til røret. Bland deretter reaksjonen og inkuber røret ved 37 grader Celsius i ytterligere to timer. På slutten av inkubasjonen fordøyer du den første DNA-malen med 7,5 mikroliter av DNAer med grundig blanding og inkuber i 37 grader Celsius i 30 minutter.Etter ekstraksjon, kontroller nøye RNA integritet og utbytte ved agarose gel elektroforese i henhold til standardprotokoller. Ved lav RNA-abundancy bør distinkte bånd, i stedet for et uskarpt smør, observeres. Noen trinn krever rask utførelse og derfor grundig forberedelse.Vær også spesielt oppmerksom på RNA integritet og celle levedyktighet. For å forberede menneskelige leverkreftceller for cellekultur-avledet hepatitt E virusproduksjon, frø cellene i 20 milliliter av komplett DMEM på en 15 centimeter kollagen belagt kultur rett og inkubere på 37 grader Celsius til de når 90% samløpet. På slutten av kulturen, vask cellene med 10 milliliter PBS før du løsner dem fra cellekulturplaten med tre milliliter på 0,05% Trypsin-EDTA ved 37 grader Celsius.Resuspend de frittliggende cellene i 10 milliliter med komplett DMEM og overføre cellene til en 50 milliliter konisk rør for telling. Overfør fem ganger 10 til de seks cellene til et nytt 50 milliliter rør og vask cellene to ganger med 35 milliliter PBS per vask. Etter den andre vasken, legg cellene på is uten å fjerne det overnaturlige.For elektroporering av målcellene, supplere 384 mikroliter cytomix med to millimolar ATP og fem millimolar glutation, deretter lagre på is inntil videre bruk. Skift forsiktig ut det overnaturlige med hele 400 mikroliter oppløsning. Tilsett fem mikrogram renset viral genomisk RNA til cellene og overfør cellesuspensjonen til en fire millimeter cuvette for elektroporasjon ved 975 mikrofarad og 270 volt i 20 millisekunder.Etter elektroporasjon, bruk en Pasteur pipette for å overføre cellene så raskt som mulig til 11 milliliter komplett DMEM og frø 10 milliliter av elektroporerte celler til en 10 centimeter kultur rett belagt med kollagen. Deretter legger du til 1,3 ganger 10 til de femte cellene i 300 mikroliter av middels jevnt på et deksel som glir i en brønn av en kollagenbelagt 24 mikrotiterplate og plasserer platen og parabolen i cellekulturinkubatoren i 24 timer. Neste dag, erstatt supernatant i parabolen med 10 milliliter frisk DMEM og returnere parabolen til cellekulturinkubatoren i ytterligere seks dager.På dag fem til syv, avhengig av celletettheten, utfør immunofluorescerende farging av transfection-kontrollen for å tillate beregning av antall celler som uttrykker målproteinet av interesse normalisert til det totale antall celler. Vellykket elektroporasjon kan overvåkes ved immunofluorescerende flekker av transfection-kontrollen. Transfiseringseffektiviteten bør overstige 40%En replikering mangelfull mutant kan tjene som en negativ kontroll for å bekrefte spesifisiteten av fargingen.For å høste ekstracellulære cellekultur-avledet hepatitt E viruspartikler, på dag seks, filtrere supernatant gjennom en 0,45 mikroliter mesh for å fjerne eventuelle celle rusk og lagre høstet ekstracellulær celle kultur-avledet hepatitt E virus på fire grader Celsius. For intracellulær cellekultur-avledet hepatitt E virus partikkel høsting, vaske celler med PBS og løsne cellene med 1,5 milliliter på 0,05% Trypsin-EDTA ved 37 grader Celsius. Når cellene har løsnet, stopp reaksjonen med 8,5 milliliter DMEM og overfør cellefjæringen til et 50 milliliter rør for sentrifugering.Tilsett 1,6 milliliter DMEM komplett medium per elektroporasjon til individuelle to milliliter reaksjonsrør og bruk 800 mikroliter av mediet for å gjenbruke cellene, og dermed overføre cellene til rørene. Frys cellene ut i flytende nitrogen, og tin deretter cellene på is tre ganger før høy hastighet sentrifugering de resulterende lysates i 10 minutter ved 10, 000 ganger g. Deretter overfører supernativa til nye rør uten å forstyrre celleavfallpellets for minus 80 grader Celsius lagring.For å vurdere titers av de nyproduserte intra og ekstracellulære hepatitt E viruslagrene, frø to ganger 10 til de fire cellene per 100 mikroliter mem per brønn inn i de 60 senterbrønnene til en kollagenbelagt 96-brønns mikrotiterplate og fyll de ytterste brønnene med 100 mikroliter PBS per brønn. Etter 24 timer ved 37 grader Celsius, tilsett 50 mikroliter ekstracellulære viruspartikkelsupernatant til den første raden av celler. Etter grundig blanding fortynnes brønninnholdet seks ganger med en en til tre konsentrasjon per brønn ved å overføre 50 mikroliter supernatant fra forrige til neste rad med celler i duplikat til siste rad med celler.For å infisere cellene med intracellulære cellekultur-avledede hepatitt E-viruspartikler, tilsett 25 mikroliter av den intracellulære viruspartikkelen supernatant til den øverste raden av celler og bland godt før de fortynner cellene seks ganger med ett til fem forhold med 25 mikroliter fortynning i duplikat som vist. Plasser deretter platen i cellekulturinkubatoren i syv dager før immunofluorescent farging i henhold til protokollen i manuskriptet. Etter inkubasjon og immunfarging kan platene analyseres ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi.Etter immunstaining kan den endelige titeren av intra- og ekstracellulære partikler beregnes ved hjelp av riktig formel som angitt. Etter målcelleinfeksjonen med cellekulturavledede E-viruspartikler ved seriell fortynning, kan titre mellom en gang 10 til femte og tre ganger 10 til de seks fokusdannende enhetene per milliliter forventes fra cellekulturene infisert med de ikke-innkapslede intracellulære cellekultur-avledede hepatitt E-viruspartiklene. I kulturer infisert med innhyllede ekstracellulære cellekultur-avledet hepatitt E viruspartikler, titers mellom en ganger 10 til den andre og en ganger 10 til fjerde fokus forming enheter per milliliter forventes.I tillegg er forholdet mellom genomkopier og ikke-innkapslede intracellulære smittsomme viruspartikler vanligvis lavere enn det som er observert for ekstracellulære cellekultur-avledede hepatitt E-viruspartikkelinfiserte kulturer, noe som tyder på en høyere spesifikk infeksinasjon av de ikke-innhyllede hepatitt E-virusartene. Viral partikkelproduksjon og målcelleinfeksjon krever en full viral livssyklus, og kan gi ny innsikt i virusvertsinteraksjoner. Denne protokollen kan endres for å utføre replikering kinetikk eller å produsere partikler som kan brukes i infeksjonsanalyser.Mesteparten av vår forskning er for tiden avhengig av smittsomme partikler, både i innhyllet og ikke-innhyllet HEV. Og artikler som bruker våre teknikker blir for tiden publisert.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyclin-regulert Cell Linje Produserer Høy titer lentiviral vektorer som spesifikt retter dendrittiske celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

En protokoll for Analysere Hepatitt C-virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Rask, sikker og enkel manuell sengen nukleinsyre utvinning for påvisning av Virus i hele blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Lever på-Chip" kulturer av primære hepatocytter og Kupffer celler for hepatitt B-smitte

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kylling primære Bursal-celle kultur modell å studere Bursal infeksjonssykdommer Virus patogenesen

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...