Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Мы благодарны Сюзанне Эмерсон за клон вируса гепатита Е p6. HEV-специфический кролик гипериммун сыворотки любезно предоставлена Райнер Ульрих, Фридрих Loeffler институт, Германия. Кроме того, мы благодарим всех членов кафедры молекулярной и медицинской вирусологии Рурского университета Бохума за их поддержку и обсуждение. Цифры 1-7 были получены с BioRender.com.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты выполняются в состоянии BSL-2. Все материалы, которые соприкасаются с вирусом гепатита Е РНК или инфекционным вирусом, должны быть промыты должным образом с 4% Kohrsolin FF из контейнера для отходов внутри капота до удаления.
1. Плазмидная подготовка
...

Начиная с плазмидной подготовки, урожайность ДНК должна превышать 150 нг/МЛ, чтобы иметь возможность выполнять несколько линейных данных из одного и того же плазмидного запаса, что сводит к минимуму риск индуцированного бактериями мутагенеза важнейших последовательностей генома. Кром?...

Гепатит Е является довольно недооцененным заболеванием с ростом распространенности во всем мире. Около 20 миллионов случаев инфицирования приводят к более чем 70 000 случаев смерти в год1. Основной агент, вирус гепатита Е (HEV), был недавно переназначен и в настоящее время классифицируется в семье Hepeviridae в том числе рода ортохерепвирус и Piscihepevirus. HEV различного происхождения классифицируются в пределах видов Orthohepevirus A-D в том числе изоляты от людей, свиней, кроликов, крыс, птиц и других млекопитающих2. В настоящее время выявлено восемь различных генотипов (GT) положительно-ориентированного одноцепоченого РНК-вируса2. Хотя они отличаются по последовательности идентичности, маршрутов передачи и географического распределения, их геномная структура очень сохраняется. Более конкретный, геном 7.2 kbp HEV делится на 3 основных открытых считывания кадров (ORF1-3). В то время как ORF1 кодирует все ферменты, необходимые для успешной репликации в клетке-хозяине, ORF2 кодирует капсидный белок, а белок ORF3 работает как функциональный ионный канал, необходимый для сборки и высвобождения инфекционных частиц3. После выпуска в базальных или апических просвета HEV существует в обоих, quasienveloped и не-окутанных / голых видов в зависимости от того, вирус происходит от крови или кала, соответственно4,5.
В то время как GT1 и GT2 в основном встречаются в развивающихся странах, заражая людей6 только по фекально-устному маршруту, GT3, GT4 и GT7 преимущественно встречаются в развитых странах1,7 с различными видами, служащими в качестве резервуаров, например, свиньи8, крыса9, курица10,11, олени12, мангуста13, летучая мышь14, кролик15,16, дикий кабан17 и многое другое7,18,19, предоставляя доказательства зооноза7,20,21,22. Помимо неадекватных санитарных условий23 и загрязненных пищевых продуктов12,,24,25,,26, передача через переливание крови и трансплантации органов также возможно27,28., HEV является распространенной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности29 особенно у пациентов с уже существующими заболеваниями печени, иммунокомпромиссных лиц (генотип 3, 4 и 7) и беременных женщин (генотип 1). Следует отметить, Есть также экстра-епатические проявления, такие как гематопоэтическое заболевание30,31,32, неврологические расстройства33 и почечной травмы34.
На сегодняшний день, вне этикетки препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих инфицированных пациентов35,36. Тем не менее, случаи отказа лечения и плохих клинических долгосрочных исходов были зарегистрированы. Неудача лечения была связана с вирусным мутагенезом и повышенной вирусной неоднородностью у хронически инфицированных пациентов37,,38,,39. Напротив, недавнее европейское ретроспективное многоцентровое исследование не смогло соотнести мутации полимеразы с неудачей леченияРБВ 40. В клинических наблюдениях и экспериментах в пробирке интерферон41,,42,,43,софосбувир44,,45,соли цинка46 и силвестрол47,48 также показали противовирусные эффекты. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит найти, препятствует отсутствие знаний о жизненном цикле HEV и его патогенеза. Таким образом, надежная система клеточной культуры для вирусологических исследований и разработки новых противовирусных препаратов срочно необходимо49.
К сожалению, как и другие вирусы гепатита, HEV трудно размножаться в обычных клеточных линий и обычно прогрессирует очень медленно, что приводит к низкой вирусной нагрузки. Тем не менее, некоторые группы смогли повысить вирусные нагрузки путем генерации подклонов клеточной линии50 или корректировки медиа-добавок51. Недавно генерация клонов кДНА52 и адаптация первичных изолятов пациента путем прохождения53,54 дальнейшего улучшения распространения HEV в клеточной культуре55. В этом протоколе мы использовали геном клеточной культуры, адаптированной штаммом Kernow-C1 (именуемым p6_WT)54, и штаммом мутанта, укрывающим мутацию, повышающую репликацию (называемую p6_G1634R)37. Kernow-C1 является наиболее часто используемым штаммом в культуре HEV клеток и способен производить высокие вирусные нагрузки. Оценивая вирусные номера копий РНК, репликация HEV может контролироваться in vitro. Тем не менее эти методы не позволяют оценить количество производимых инфекционных частиц. Таким образом, мы установили иммунофлуоресценции окрашивания для определения фокус формирования единиц (FFU/mL).
Описанный здесь метод56 может быть использован для производства полнометражных инфекционных вирусных частиц, способных инфицировать различные типы клеток различного происхождения, включая первичные клетки и клеточные линии млекопитающих. Это является фундаментальным условием для расшифровки важных аспектов инфекции HEV и тропизма. Нет необходимости в прививке с обычно ограниченными изолятами пациента. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол сравнительно эффективным. Кроме того, эта система может быть использована для обратной генетики, позволяющей изучать изменение генома in vivo и их влияние на репликацию и пригодность HEV. Этот метод преодолевает многие ограничения и, может путь путь для разработки лекарств, mutagenesis исследований и оценки вирус-хозяин взаимодействий, таких как ограничения или факторы входа.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Вирус гепатита Е является основной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности с ростом распространенности во всем мире. Одноцепочечный РНК-вирус в основном передается при переливании крови, неадекватных санитарных условиях и загрязненных пищевых продуктах. На сегодняшний день не по этикетке препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих пациентов. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит определить. До сих пор знания о жизненном цикле HEV и патогенеза были серьезно затруднены из-за отсутствия эффективной системы культуры Клеток HEV. Надежная система клеточной культуры имеет важное значение для изучения вирусного жизненного цикла, который также включает вирусный патогенез. С методом описанным здесь одно может произвести вирусные titers up to 3 x 106 блока фокусим формирования/mL (FFU/mL) non-enveloped HEV и up to 5 x 104 FFU/mL окутанного HEV. Используя эти частицы, можно заразить различные клетки различного происхождения, включая первичные клетки и человека, а также линии клеток животных. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол чрезвычайно эффективным.

В этом протоколе мы описываем производство высокотер инфекционных HEVcc. Первый шаг заключается в том, чтобы изолировать плазмид ДНК (pBluescript_SK_HEVp654 и pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Рисунок 8a), который затем линейный ограничения пищеварения и очищены для in vitro тра...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Описанный здесь является эффективным методом о том, как производить высокие вирусные титр запасов вируса гепатита Е (HEV), чтобы эффективно заразить клетки гепатомы. С представленным методом, как неохотные, так и окутанные вирусные частицы могут быть собраны и использованы для прививки различных клеточных линий.

Модель клеточной культуры для производства высокой тетер гепатита E Вирус Запасы

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Исследования вируса гепатита Е сдерживаются отсутствием эффективной системы клеточной культуры. Наши методы преодолевают эти ограничения, прокладывая путь к разработке лекарств и разработке вакцин. С помощью этого протокола, мы можем производить инфекционные вирусы с высоким содержанием titer как не-конверт и конверт HEV частиц, облегчая инфекцию различных клеток.Выполнение этого протокола требует доступа к объекту BSA-2 и опыта работы с основными методами клеточной культуры. Для линейной плазмидной ДНК смешайте 10 микрограммов шаблонной ДНК с 10 микролитров буфера и двумя микролитров фермента ограничения Micrococcus luteus и отрегулируйте конечный объем до 100 микролитров с водой. Затем инкубировать раствор в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию и подтвердить линейность плазмиды электрофорезом агарозного геля в соответствии со стандартными протоколами.После плазмидной изоляции ДНК и линейности, успех линейности может быть проверен путем сравнения неусвоенной плазмидной ДНК с переваренной плазмидной ДНК гель-электрофорезом. Для транскрипции в пробирке очищенной, полнометражной ДНК вируса гепатита Е смешайте два микрограмма линейного шаблона ДНК с соответствующими реагентами и используйте воду без ядра, чтобы довести конечный объем раствора до 100 микролитров. После тщательного смешивания, инкубировать раствор в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.Через два часа добавьте в трубку еще два микролитров РНК-полимеразы Т7. Затем смешайте реакцию и инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение еще двух часов. В конце инкубации, переварить первоначальный шаблон ДНК с 7,5 микролитров ДНК с тщательной смешивания и инкубации на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.После экстракции тщательно проверяйте целостность РНК и урожайность по агарозовому гель-электрофорезу в соответствии со стандартными протоколами. В случае низкого уровня РНК следует соблюдать различные полосы, а не размытый мазок. Некоторые шаги требуют быстрого выполнения и, следовательно, тщательной подготовки.Также обратите особое внимание на целостность РНК и жизнеспособность клеток. Для подготовки раковых клеток печени человека для производства вируса гепатита Е, полученного из клеточной культуры, семенной клетки в 20 миллилитров полного DMEM на 15-сантиметровый коллаген покрытием культуры блюдо и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут 90% слияния. В конце культуры, мыть клетки с 10 миллилитров PBS, прежде чем отделить их от пластины клеточной культуры с тремя миллилитров 0,05%Трипсин-ЭДТА при 37 градусов по Цельсию.Resuspend отдельных клеток в 10 миллилитров полного DMEM и передачи клеток в 50 миллилитров конической трубки для подсчета. Передача пять раз 10 до шести клеток в новую 50 миллилитровую трубку и мыть клетки два раза с 35 миллилитров PBS за стирку. После второй стирки поместите клетки на лед, не удаляя супернатанта.Для электропорации клеток-мишеней дополнить 384 микролитров цитомикса двумя миллимолярными АТФ и пятью миллимолярной глутатионом, впоследствии хранить на льду до дальнейшего использования. Тщательно замените супернатант на все 400 микролитров раствора. Добавьте пять микрограммов очищенной вирусной геномной РНК в клетки и перенесите подвесную клетку на четырехмиллиметровый кювет для электропорации при 975 микрофарадах и 270 вольт в течение 20 миллисекунд.После электропорации используйте пипетку Pasteur, чтобы как можно быстрее перенести клетки в 11 миллилитров полного DMEM и семени 10 миллилитров электропомерных клеток в 10-сантиметровую культурную тарелку, покрытую коллагеном. Затем добавьте 1,3 раза 10 к пятым клеткам в 300 микролитров среды равномерно на крышку скольжения в одном колодец коллагена покрытием 24 микротитр пластины и место пластины и блюдо в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день замените супернатант в блюде 10 миллилитров свежего DMEM и верните блюдо в инкубатор клеточной культуры еще на шесть дней.На пятый-седьмой день, в зависимости от плотности клеток, выполняют иммунофлуоресцентное окрашивание трансфекции, чтобы позволить вычислить количество клеток, выражаюющих целевой белок интереса нормализуется до общего количества клеток. Успешное электропорирование может контролироваться иммунофлуоресцентным окрашиванием контроля трансфекции. Эффективность трансфекции должна превышать 40%A репликации дефицит мутант может служить отрицательным контролем, чтобы подтвердить специфику окрашивания.Чтобы собрать частицы вируса гепатита Е, полученные из внеклеточной культуры, на шестой день фильтруем супернатант через сетку микролитров 0,45, чтобы удалить любой клеточный мусор и хранить собранный внеклеточный вирус гепатита Е, полученный из клеток, при четырех градусах Цельсия. Для внутриклеточной клеточной культуры, полученной от вируса гепатита Е, мыте клетки с помощью PBS и отсоедините клетки с 1,5 миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА при 37 градусах цельсия. Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с 8,5 миллилитров DMEM и передачи подвески клетки на 50 миллилитров трубки для центрифугации.Добавьте 1,6 миллилитров DMEM полной среды на электропорацию в отдельные две миллилитровые реакционной трубки и используйте 800 микролитров среды для повторного перерасхода клеток, тем самым перенося клетки в трубки. Заморозить клетки в жидком азоте, а затем разморозить клетки на льду три раза до высокой скорости центрифугирования в результате лизатов в течение 10 минут при 10000 раз г. Затем перенесите супернатанты в новые трубки, не нарушая гранулы клеточного мусора при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для оценки титров недавно произведенных внутриклеточных запасов вируса гепатита Е, семена в два раза от 10 до четырех клеток на 100 микролитров MEM на скважину в 60 центральных скважин коллагена покрытием 96-ну микротитр пластины и заполнить внешние скважины с 100 микролитров PBS на скважину. Через 24 часа при 37 градусах Цельсия добавьте в первый ряд клеток 50 микролитров сверхклеточной частицы вируса. После тщательного смешивания, последовательно разбавить содержимое хорошо шесть раз на один-три концентрации на колодец путем передачи 50 микролитров супернатанта из предыдущего в следующий ряд клеток в дублировать до последнего ряда клеток.Чтобы заразить клетки частицами вируса гепатита Е внутриклеточной клеточной культуры, добавьте 25 микролитров супернатанта внутриклеточной вирусной частицы в верхний ряд клеток и смешайте задолго до того, как серийно разбавляют клетки шесть раз при соотношении один к пяти с 25 микролитров разбавления в дубликате, как это было продемонстрировано. Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение семи дней до иммунофлуоресцентного окрашивания в соответствии с протоколом в рукописи. После инкубации и иммунного окрашивания пластины могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.После иммуностимации окончательный рейтер внутриклеточных частиц может быть рассчитан с использованием соответствующей формулы, как указано. После инфекции целевой клетки с клеточной культурой полученных частиц вируса Е путем последовательного разбавления, титеры от одного раза 10 до пятого и три раза от 10 до шести единиц фокуса формирования на миллилитр можно ожидать от клеточных культур, инфицированных не-окутанных внутриклеточной клеточной культуры полученных частиц вируса гепатита Е. В культурах, инфицированных окутанными частицами вируса гепатита Е, полученными из внеклеточной клеточной культуры, ожидается, что титр будет от одного раза 10 до второго и один раз от 10 до четвертого фокуса, образуя единицы на миллилитр.Кроме того, соотношение между копиями генома и неокуленными внутриклеточными частицами инфекционных вирусов, как правило, ниже, чем у внутриклеточных культур, полученных от вируса гепатита Е, инфицированных культурами, что свидетельствует о более высокой специфической инфекционности неокуленных видов вируса гепатита Е. Производство вирусных частиц и целевая клеточная инфекция требуют полного вирусного жизненного цикла и могут дать новое представление о взаимодействии с вирусом-хозяином. Этот протокол может быть изменен для выполнения репликации кинетики или для производства частиц, которые могут быть использованы в анализе инфекции.Большинство наших исследований в настоящее время зависит от инфекционных частиц, как в окутанных и не окутанных HEV. И статьи с использованием наших методов в настоящее время публикуются.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Тетрациклин-регулируемой клеточная линия продуцирует высоким титром лентивирусных векторов, которые специально направлены дендритных клеток

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

«Печени на чипе» культур первичных гепатоцитов и клеток Купфера для инфицирования вирусом гепатита B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Ex Vivo курица первичной Bursal клеточной культуры модель для изучения патогенеза вирус инфекционного Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...