Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
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Estamos agradecidos a Suzanne Emerson por el clon del virus de la hepatitis E p6. Suero hiperinmune de conejo específico de HEV fue amablemente proporcionado por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemania. Además, agradecemos a todos los miembros del Departamento de Virología Molecular y Médica de la Universidad del Ruhr Bochum por su apoyo y discusión. Las figuras 1-7 se generaron con BioRender.com.

NOTA: Todos los experimentos se realizan bajo la condición BSL-2. Todos los materiales que entren en contacto con el ARN del virus de la Hepatitis E o el virus infeccioso deben enjuagarse correctamente con un 4% de Kohrsolin FF desde un contenedor de residuos dentro de la campana antes de su eliminación.
1. Preparación de Plásmido
<ol><li>Inocular 200 ml de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con Escherichia coli JM109 transformada incorporando una codificación de plá...

A partir de la preparación del plásmido, los rendimientos del ADN deben superar los 150 ng/L para poder realizar una linealización múltiple desde el mismo stock de plásmido, lo que minimiza el riesgo de mutagénesis inducida por bacterias de secuencias genomas cruciales. Además, es importante comprobar el resumen de restricción para la linealización completa del plásmido por electroforesis de gel(Figura 8b). La falta de ADN plásmido linealizado induciría la amplificación del cír...

La hepatitis E es una enfermedad bastante subestimada con una prevalencia cada vez mayor en todo el mundo. Alrededor de 20 millones de infecciones provocan más de 70.000 muertes al año1. El agente subyacente, el virus de la hepatitis E (HEV), fue reasignado recientemente y ahora se clasifica dentro de la familia Hepeviridae incluyendo los géneros Orthohepevirus y Piscihepevirus. HEV de diversos orígenes se clasifican dentro de la especie Orthohepevirus A-D incluyendo aislados de humanos, cerdos, conejos, ratas, aves y otros mamíferos2. En la actualidad, se han identificado ocho genotipos diferentes (GT) del virus de ARN de una sola cadena de orientación positiva2. Aunque difieren en su identidad de secuencia, rutas de transmisión y distribución geográfica, su estructura genómica es altamente conservada. Más específico, el genoma HEV de 7,2 kbp se divide en 3 marcos de lectura abiertos principales (ORF1-3). Mientras ORF1 codifica todas las enzimas necesarias para una replicación exitosa dentro de la célula huésped, ORF2 codifica la proteína capsid, y la proteína ORF3 funciona como un canal iónico funcional necesario para el montaje y liberación de partículas infecciosas3. Una vez liberado en el lumen basal o apical HEV existe en ambas especies, casi biseladas y no envueltas/desnudas dependiendo de si el virus se origina en sangre o heces, respectivamente4,5.
Mientras que GT1 y GT2 se encuentran principalmente en los países en desarrollo que infectan únicamente a los seres humanos6 a través de la vía fecal-oral, GT3, GT4 y GT7 se producen predominantemente en los países desarrollados1,,7 con una variedad de especies que sirven como reservorios, por ejemplo, cerdo8, rata9, pollo10,11, ciervo12, mangosta13, murciélago14, conejo15,16, jabalí17 y muchos más7,18,19, proporcionando evidencia de zoonosis7,20,21,22. Además de las condiciones sanitarias inadecuadas23 y los productos alimenticios contaminados12,24,25,26, la transmisión a través de transfusión de sangre y trasplantes de órganos también es posible27,28. El HEV es una causa frecuente de cirrosis hepática e insuficiencia hepática29, especialmente en pacientes con enfermedad hepática preexistente, individuos inmunocomprometidos (genotipo 3, 4 y 7) y mujeres embarazadas (genotipo 1). Cabe destacar que también hay manifestaciones extrahepáticas como la enfermedad hematopoyética30,31,32, trastornos neurológicos33 y lesión renal34.
Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes infectados35,36. Sin embargo, se han notificado casos de insuficiencia del tratamiento y malos resultados clínicos a largo plazo. La insuficiencia del tratamiento se ha relacionado con la mutagénesis viral y el aumento de la heterogeneidad viral en pacientes infectados crónicamente37,38,39. Por el contrario, un reciente estudio multicéntrico retrospectivo europeo no fue capaz de correlacionar las mutaciones de la polimerasa con la falla del tratamiento con RBV40. En observaciones clínicas y experimentos in vitro, el interferón41,42,43, sofosbuvir44,45, sales de zinc46 y silvestrol47,48 también han mostrado efectos antivirales. No obstante, queda por encontrar un tratamiento específico para el HEV, obstaculizado por la falta de conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y su patogénesis. Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de cultivo celular robusto para estudios virológicos y el desarrollo de nuevos medicamentos antivirales49.
Desafortunadamente, al igual que otros virus de la hepatitis, el HEV es difícil de propagar en las líneas celulares convencionales y por lo general progresa muy lentamente, lo que conduce a bajas cargas virales. Sin embargo, algunos grupos fueron capaces de aumentar las cargas virales mediante la generación de subclones de línea celular50 o el ajuste de los suplementos de medios51. Recientemente la generación de clones de ADNc52 y la adaptación de aislados primarios de pacientes mediante la transmisiónde 53,,54 mejoraron aún más la propagación del HEV en el cultivo celular55. En este protocolo, utilizamos el genoma de un cultivo celular adaptado a la cepa Kernow-C1 (denominada p6_WT)54 y una cepa mutante que alberga una mutación que mejora la replicación (denominada p6_G1634R)37. Kernow-C1 es la cepa más utilizada en el cultivo celular HEV y es capaz de producir altas cargas virales. Mediante la evaluación de los números de copia de ARN viral, la replicación de HEV se puede monitorear in vitro. Sin embargo, estas técnicas no permiten evaluar el número de partículas infecciosas que se producen. Por lo tanto, hemos establecido una tinción de inmunofluorescencia para determinar las unidades formadoras de enfoque (FFU/ml).
El método56 descrito aquí se puede utilizar para producir partículas virales infecciosas de longitud completa que son capaces de infectar una variedad de tipos de células de diversos orígenes, incluyendo células primarias y líneas celulares de mamíferos. Este es un requisito previo fundamental para descifrar aspectos importantes de la infección por HEV y el tropismo. No hay necesidad de inoculación con aislados de pacientes generalmente limitados. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea comparativamente eficiente. Además, este sistema se puede utilizar para la genética inversa que permite el estudio de la alteración del genoma identificado in vivo y su impacto en la replicación y la aptitud del HEV. Esta técnica supera muchas limitaciones y, puede buscar el camino para el desarrollo de fármacos, estudios de mutagénesis y la evaluación de interacciones virus-huésped como restricciones o factores de entrada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

El virus de la hepatitis E es la principal causa de cirrosis hepática e insuficiencia hepática con una prevalencia creciente en todo el mundo. El virus del ARN de una sola cadena se transmite predominantemente por transfusiones de sangre, condiciones sanitarias inadecuadas y productos alimenticios contaminados. Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes. No obstante, queda por identificar un tratamiento específico para el HEV. Hasta ahora, el conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y la patogénesis se ha visto gravemente obstaculizado debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular HEV. Un sistema de cultivo celular robusto es esencial para el estudio del ciclo de vida viral que también incluye la patogénesis viral. Con el método descrito aquí se pueden producir títulos virales de hasta 3 x 106 unidad de formación de enfoque/ ml (FFU/ml) de HEV no envolvente y hasta 5 x 104 FFU/ml de HEV envuelto. Usando estas partículas, es posible infectar una variedad de células de diversos orígenes incluyendo células primarias y humanas, así como líneas celulares animales. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea extremadamente eficiente.

En este protocolo, describimos la producción de HEVcc infeccioso de alto título. El primer paso es aislar el ADN plásmido (pBluescript_SK_HEVp654 y pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que luego se linealiza mediante la digestión de restricción y se purifica para la transcripción in vitro (Figura 1). Una linealización exitosa se puede verificar comparando el plásmido-ADN no digerido con el plásmido-A...

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A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Aquí se describe un método eficaz sobre cómo producir altas existencias de título virales del virus de la hepatitis E (HEV) para infectar eficientemente las células del hepatoma. Con el método presentado, tanto las partículas virales no envueltas, como las envueltas, pueden ser cosechadas y utilizadas para inocular varias líneas celulares.

Un modelo de cultivo celular para producir acciones de virus de la hepatitis E de alto título

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

La investigación del virus de la hepatitis E se ha visto obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular eficiente. Nuestras técnicas superan estas limitaciones allanando el camino hacia el diseño de fármacos y el desarrollo de vacunas. Con este protocolo, somos capaces de producir virus infecciosos de alto título de partículas HEV no envolventes y envolventes, facilitando la infección de una variedad de células.La ejecución de este protocolo requiere acceso a una instalación de BSA-2 y experiencia con técnicas básicas de cultivo celular. Para linealizar el ADN plásmido, mezcle 10 microgramos del ADN de la plantilla con 10 microlitros de tampón y dos microlitros de la enzima de restricción Micrococcus luteus y ajuste el volumen final a 100 microlitros con agua. Luego incubar la solución durante una hora a 37 grados Celsius y confirmar la linealización del plásmido por electroforesis de gel de agarosa de acuerdo con los protocolos estándar.Después del aislamiento y linealización del ADN plásmido, el éxito de la linealización se puede verificar comparando el ADN plásmido no digerido con el ADN plásmido digerido por electroforesis de gel. Para la transcripción in vitro del ADN del virus E de hepatitis E purificado y de longitud completa, mezcle dos microgramos de la plantilla de ADN linealizado con los reactivos adecuados y utilice agua sin núcleo para llevar el volumen final de la solución a 100 microlitros. Después de una mezcla minuciosa, incubar la solución durante dos horas a 37 grados centígrados.Después de dos horas, agregue dos microlitros adicionales de ARN polimerasa T7 al tubo. A continuación, mezcle la reacción e incubar el tubo a 37 grados centígrados durante otras dos horas. Al final de la incubación, digiere la plantilla de ADN inicial con 7,5 microlitros de ADN con mezcla exhaustiva e incuba durante 37 grados Centígrados durante 30 minutos.Después de la extracción, compruebe cuidadosamente la integridad del ARN y el rendimiento por electroforesis de gel de agarosa de acuerdo con los protocolos estándar. En el caso de la baja ANNa abundancy, se deben observar bandas distintas, en lugar de un frotis borroso. Algunos pasos requieren una ejecución rápida y, por lo tanto, una preparación exhaustiva.Además, preste especial atención a la integridad del ARN y a la viabilidad celular. Para preparar las células cancerosas del hígado humano para la producción de virus de la hepatitis E derivada del cultivo celular, sembrar las células en 20 mililitros de DMEM completo en un plato de cultivo recubierto de colágeno de 15 centímetros e incubar a 37 grados centígrados hasta que alcancen el 90% de confluencia. Al final del cultivo, lavar las células con 10 mililitros de PBS antes de separarlas de la placa de cultivo celular con tres mililitros de 0.05%Trypsin-EDTA a 37 grados Celsius.Resuspender las células separadas en 10 mililitros de DMEM completo y transferir las células a un tubo cónico de 50 mililitros para el recuento. Transfiera cinco veces 10 a las seis células a un nuevo tubo de 50 mililitros y lave las células dos veces con 35 mililitros de PBS por lavado. Después del segundo lavado, coloque las células sobre hielo sin quitar el sobrenadante.Para la electroporación de las células diana, suplemento 384 microlitros de citomix con dos ATP milimolar y glutatión de cinco mililitros, posteriormente almacenar en hielo hasta su uso posterior. Sustituya cuidadosamente el sobrenadante por 400 microlitros completos de solución. Añadir cinco microgramos de ARN genómico viral purificado a las células y transferir la suspensión celular a una cubeta de cuatro milímetros para electroporación a 975 microfaradio y 270 voltios durante 20 milisegundos.Después de la electroporación, utilice una pipeta Pasteur para transferir las células lo más rápido posible a 11 mililitros de DMEM completo y semillas de 10 mililitros de las células electroporadas en un plato de cultivo de 10 centímetros recubierto con colágeno. A continuación, añadir 1,3 veces 10 a las quintas células en 300 microlitros de medio uniformemente en un resbalón de cubierta en un pozo de una placa de 24 microtíteres recubierto de colágeno y colocar el plato y el plato en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante en el plato con 10 mililitros de DMEM fresco y devuelva el plato a la incubadora de cultivo celular durante seis días adicionales.En el día cinco a siete, dependiendo de la densidad celular, realizar la tinción inmunofluorescente del control de transfección para permitir el cálculo del número de células que expresan la proteína diana de interés normalizada al número total de células. La electroporación exitosa puede ser monitoreada por tinción inmunofluorescente del control de transfección. La eficiencia de la transfección debe exceder 40%A de replicación deficiente mutante puede servir como un control negativo para confirmar la especificidad de la tinción.Para cosechar partículas del virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular extracelular, el día seis, filtre el sobrenadante a través de una malla de 0,45 microlitros para eliminar cualquier residuo celular y almacenar el virus de la hepatitis E derivado del cultivo celular extracelular cosechado a cuatro grados Centígrados. Para la recolección de partículas del virus de la hepatitis E derivada del cultivo de células intracelulares, lave las células con PBS y desasocie las células con 1,5 mililitros de 0,05% de Tripppsin-EDTA a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 8,5 mililitros de DMEM y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros para centrifugación.Añadir 1,6 mililitros de DMEM medio completo por electroporación a tubos de reacción individuales de dos mililitros y utilizar 800 microlitros del medio para resuspend las células, transfiriendo así las células a los tubos. Congele las células en nitrógeno líquido y, posteriormente, descongele las células sobre hielo tres veces antes de centrifugar a alta velocidad los lisatos resultantes durante 10 minutos a 10.000 g. A continuación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos sin molestar los pellets de desechos celulares durante menos 80 grados centígrados de almacenamiento.Para evaluar los títulos de las existencias de virus de hepatitis E intra y extracelular de recién producido, se siembra dos veces 10 a las cuatro células por cada 100 microlitros de MEM por pozo en los 60 pozos centrales de una placa de microtíter de 96 pozos recubierta de colágeno y llene los pozos más exteriores con 100 microlitros de PBS por pozo. Después de 24 horas a 37 grados Celsius, agregue 50 microlitros de sobrenadante de partículas de virus extracelulares a la primera fila de células. Después de mezclar a fondo, diluir en serie el contenido del pozo seis veces a una concentración de uno a tres por pozo mediante la transferencia de 50 microlitros de sobrenadantes de la fila anterior a la siguiente de celdas duplicadas hasta la última fila de celdas.Para infectar las células con partículas del virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular intracelular, agregue 25 microlitros del sobrenadante de partículas del virus intracelular a la fila superior de células y mezcle bien antes de diluir en serie las células seis veces a una proporción de uno a cinco con 25 microlitros de dilución duplicados como se ha demostrado. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante siete días antes de la tinción inmunofluorescente de acuerdo con el protocolo en el manuscrito. Después de la incubación y la tinción inmunitaria, las placas se pueden analizar mediante microscopía de inmunofluorescencia.Después de la inmunosuchación, el título final de las partículas intra y extracelulares se puede calcular utilizando la fórmula adecuada como se indica. Después de la infección celular diana con partículas del virus E derivadas del cultivo celular por dilución en serie, se pueden esperar titers entre uno por 10 y tres veces 10 a las seis unidades formadoras de enfoque por mililitro de las partículas de virus E derivadas del cultivo celular no envueltas. En cultivos infectados con partículas de virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular extracelular envueltas, se esperan títulos entre uno por 10 y uno por segundo y uno por 10 al cuarto foco formando unidades por mililitro.Además, la relación entre las copias del genoma y las partículas de virus infecciosos intracelulares no envueltas es típicamente inferior a la observada para los cultivos infectados por partículas E de cultivo celular extracelular, lo que sugiere una mayor infectividad específica de la especie del virus de la hepatitis E no envuelta. La producción de partículas virales y la infección de células diana requieren un ciclo de vida viral completo, y pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones virus-huésped. Este protocolo se puede modificar para realizar la cinética de replicación o para producir partículas que se pueden utilizar en ensayos de infección.La mayor parte de nuestra investigación actualmente depende de partículas infecciosas, tanto en el HEV envuelto como no envuelto. Y los artículos que utilizan nuestras técnicas se están publicando actualmente.

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