Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Suzanne Emerson för hepatit E-viruset p6 klon. HEV-specifika kanin hyperimmune serum tillhandahölls vänligt av Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Dessutom tackar vi alla medlemmar i institutionen för molekylär och medicinsk virologi vid Ruhruniversitetet Bochum för deras stöd och diskussion. Siffrorna 1-7 genererades med BioRender.com.

ALLA experiment utförs under BSL-2-tillstånd. Allt material som kommer i kontakt med hepatit E-virus RNA eller smittsamma virus måste sköljas ordentligt med 4% Kohrsolin FF från en avfallsbehållare inuti huven före bortskaffande.
1. Plasmid förberedelse
<ol><li>Inokulera 200 ml LB medium som innehåller 100 μg/mL ampicillin med transformerad Escherichia coli JM109 som innehåller en plasmidkodning för full längd HEV gt3 Kernow-C1p6 sekvens (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]...

Från och med plasmidpreparatet bör DNA-avkastningen överstiga 150 ng/μL för att kunna utföra flera linjäriseringar från samma plasmidlager, vilket minimerar risken för bakterieinducerad mutagenes av avgörande genomsekvenser. Dessutom är det viktigt att kontrollera begränsningen sammandrag för fullständig plasmid linjärisering av gel elektrofores (figur 8b). En brist på linjäriserad plasmid DNA skulle inducera rullande cirkel förstärkning orsakar in vitro transkription vara...

Hepatit E är en ganska underskattad sjukdom med ökande prevalens över hela världen. Omkring 20 miljoner infektioner resulterar i mer än 70.000 dödsfall per år1. Det underliggande medlet, hepatit E-virus (HEV), omplacerades nyligen och klassificeras nu inom familjen Hepeviridae inklusive släktena Orthohepevirus och Piscihepevirus. HEV av olika ursprung klassificeras inom arten Orthohepevirus A-D inklusive isolat från människor, svin, kaniner, råttor, fåglar och andra däggdjur2. För närvarande har åtta olika genotyper (GT) av det positiva, enkelsträngade RNA-viruset identifierats2. Även om de skiljer sig åt i sin sekvensidentitet, överföringsvägar och geografisk fördelning, är deras genomiska struktur mycket bevarad. Mer specifikt är 7,2 kbp HEV-genomet indelat i 3 stora öppna läsramar (ORF1-3). Medan ORF1 kodar alla enzymer som behövs för en lyckad replikering i värdcellen kodar ORF2 capsidproteinet och ORF3-proteinet fungerar som en funktionell jonkanal som krävs för montering och frisättning av infektiösa partiklar3. När de släpps ut i den basala eller apikala lumen HEV finns i båda, quasienveloped och icke-höljeförsedd / naken art beroende på om viruset kommer från blod eller avföring,respektive 4,5.
Medan GT1 och GT2 huvudsakligen finns i utvecklingsländer som enbart infekterar människor6 via fekal-oral väg, GT3, GT4 och GT7 förekommer främst i utvecklade länder1,7 med en mängd olika arter som fungerar som reservoarer, t.ex., svin8,råtta9,kyckling10,,11, rådjur12, mongoose13,fladdermus14,kanin15,,16, vildsvin17 och många fler7,,18,19, som visar zoonos7,,20,,21,22. Förutom otillräckliga sanitära förhållanden23 och förorenade livsmedelsprodukter12,,24,,25,26,överföring via blodtransfusion och organtransplantationer är också möjligt27,28. HEV är en vanlig orsak till levercirros och leversvikt29 särskilt hos patienter med redan existerande leversjukdom, immunkomprometterade individer (genotyp 3, 4 och 7) och gravida kvinnor (genotyp 1). Observera att det också finns extrahepatiska manifestationer som hematopoietisk sjukdom30,,31,32, neurologiska sjukdomar33 och njurskada34.
Hittills är off-label drogen ribavirin (RBV) behandling av val för många infekterade patienter35,36. Fall av behandlingssvikt och dåliga kliniska långsiktiga resultat har dock rapporterats. Behandlingssvikt har kopplats till viral mutagenesis och ökad viral heterogenitet hos kroniskt infekterade patienter37,38,39. Tvärtom kunde en nyligen genomförd europeisk retrospektiv multicenterstudie inte korrelera polymerasmutationer med RBV-behandlingssvikt40. I kliniska observationer och in vitro-experiment, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinksalter46 och silvestrol47,48 har också visat antivirala effekter. Icke desto mindre återstår en specifik HEV behandling att finna, hämmas av bristen på kunskap om HEV livscykel och dess patogenes. Därför behövs ett robust cellodlingssystem för virologiska studier och utveckling av nya antivirala läkemedel49.
Tyvärr, liksom andra hepatit virus, HEV är svårt att sprida sig i konventionella cellinjer och oftast fortskrider mycket långsamt leder till låga virusbelastningar. Ändå, vissa grupper kunde öka virusbelastningar av generering av cellinje subkloner50 eller justering av media kosttillskott51. Nyligen generering av cDNA kloner52 och anpassning av primära patienten isolat genom att passera53,54 ytterligare förbättrad HEV förökning i cellkultur55. I detta protokoll använde vi arvsmassan hos en cellkultur anpassad Kernow-C1 stam (kallad p6_WT)54 och en mutant stam som hyser en replikeringshöjande mutation (kallad p6_G1634R)37. Kernow-C1 är den mest använda stammen i HEV cellkultur och kan producera höga virusbelastningar. Genom att bedöma virala RNA-kopieringsnummer kan HEV-replikation övervakas in vitro. Dessa tekniker tillåter dock inte bedömning av antalet smittsamma partiklar som produceras. Därför har vi etablerat en immunofluorescensfärgning för att bestämma Fokusbildande enheter (FFU/mL).
Den här beskrivna metoden56 kan användas för att producera full längd infektiösa viruspartiklar som kan infektera en mängd olika celltyper från olika ursprung, inklusive primära celler och däggdjurs cellinjer. Detta är en grundläggande förutsättning för att dechiffrera viktiga aspekter av HEV-infektion och tropism. Det finns inget behov av inokulering med vanligtvis begränsade patientisolat. Produktionen av infektiösa HEV-partiklar från plasmider utgör en oändlig källa, vilket gör detta protokoll jämförbart effektivt. Dessutom kan detta system användas för omvänd genetik som möjliggör studier av in vivo-identifierade genomförändringar och deras inverkan på HEV-replikation och kondition. Denna teknik övervinner många begränsningar och, kan väg vägen för läkemedelsutveckling, mutagenesis studier och utvärdering av virus-värd interaktioner såsom begränsning eller faktorer inträde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatit E-virus är den främsta orsaken till levercirros och leversvikt med ökande prevalens över hela världen. Det ensträngade RNA-viruset överförs huvudsakligen genom blodtransfusioner, otillräckliga sanitära förhållanden och förorenade livsmedelsprodukter. Hittills off-label drogen ribavirin (RBV) är behandling av val för många patienter. En specifik HEV-behandling återstår dock att identifiera. Hittills har kunskapen om HEV livscykel och patogenes allvarligt hämmats på grund av bristen på en effektiv HEV cell kultursystem. Ett robust cellodlingssystem är viktigt för studiet av den virala livscykeln som även omfattar viruspatogenesen. Med den metod som beskrivs här kan man producera virala titrar på upp till 3 x 106 fokusbildande enhet/ml (FFU/mL) av icke-höljeförsörda HEV och upp till 5 x 104 FFU/ml omsluten HEV. Med hjälp av dessa partiklar är det möjligt att infektera en mängd olika celler av olika ursprung, inklusive primära celler och mänskliga, samt djurcellslinjer. Produktionen av infektiösa HEV-partiklar från plasmider utgör en oändlig källa, vilket gör detta protokoll ytterst effektivt.

I detta protokoll beskriver vi produktionen av hög titer infektiös HEVcc. Det första steget är att isolera plasmid-DNA (pBluescript_SK_HEVp654 och pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, figur 8a), som sedan linjäriseras genom restförsmältning och renas för in vitro-transkription (figur 1). En framgångsrik linjärisering kan verifieras genom att jämföra den icke-smälta plasmid-DNA till smält plasmid-DNA med hj?...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Beskrivs här är en effektiv metod för hur man producerar hög viral titer lager av hepatit E-virus (HEV) för att effektivt infektera hepatoma celler. Med den presenterade metoden kan både icke-hölje, samt höljes virala partiklar skördas och användas för att inokukulera olika cellinjer.

En cell kultur modell för att producera hög titer hepatit E-virus lager

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatit E-virusforskningen har hämmats av att det saknas ett effektivt cellodlingssystem. Våra tekniker övervinna dessa begränsningar banar väg för läkemedelsdesign och vaccin utveckling. Med detta protokoll kan vi producera infektiösa hög titervirus av både icke-kuvert- och kuvert-HEV-partiklar, vilket underlättar infektionen hos en mängd olika celler.Utförande av detta protokoll kräver tillgång till en BSA-2-anläggning och erfarenhet med grundläggande cellkultur tekniker. För att linjärisera plasmid-DNA: t, blanda 10 mikrogram av mallen DNA med 10 mikroliter av buffert och två mikroliter av Micrococcus luteus restriktionsenzym och justera den slutliga volymen till 100 mikroliter med vatten. Sedan inkubera lösningen i en timme vid 37 grader Celsius och bekräfta linjärisering av plasmiden genom agarosgelelektrofores enligt standardprotokoll.Efter plasmid DNA-isolering och linearization, kan framgången av linearizationen verifieras, genom att jämföra det non-smälta plasmid-DNAen till det smälta plasmid-DNA vid gelelektrofores. För in vitro-transkription av det renade, fullängdsvirus-DNA-viruset med hepatit E- typ, blanda två mikrogram av den linjäriserade DNA-mallen med lämpliga reagenser och använd nucleusfritt vatten för att få lösningens slutliga volym till 100 mikroliter. Efter noggrann blandning, inkubera lösningen i två timmar vid 37 grader Celsius.Efter två timmar, tillsätt ytterligare två mikroliter av T7 RNA-polymeras till röret. Blanda sedan reaktionen och inkubera röret vid 37 grader Celsius i ytterligare två timmar. I slutet av inkubationen, smälta den ursprungliga DNA-mallen med 7,5 mikroliter av DNAs med grundlig blandning och inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter.Efter extraktionen, kontrollera noggrant RNA-integriteten och avkastningen genom agarosgelelektrofores enligt standardprotokoll. När det gäller låg RNAs abundancy, distinkta band, snarare än en suddig utstryk bör iakttas. Vissa steg kräver snabb körning och därför grundliga förberedelser.Också, ägna särskild uppmärksamhet åt RNA integritet och cellens livskraft. För att förbereda mänskliga levercancerceller för cellodling-derived hepatit E virusproduktion, utsäde cellerna i 20 milliliter av komplett DMEM på en 15 centimeter kollagen belagda kultur skålen och inkubera på 37 grader Celsius tills de når 90%confluency. I slutet av kulturen, tvätta cellerna med 10 milliliter PBS innan lossnar dem från cellodlingsplattan med tre milliliter på 0,05%Trypsin-EDTA vid 37 grader Celsius.Resuspend de fristående cellerna i 10 milliliter av komplett DMEM och överföra cellerna i en 50 milliliter koniska röret för räkning. Överför fem gånger 10 till de sex cellerna till ett nytt 50 milliliter rör och tvätta cellerna två gånger med 35 milliliter PBS per tvätt. Efter den andra tvätten, placera cellerna på is utan att ta bort supernatanten.För elektroporation av målcellerna, komplettera 384 mikroliter av cytomix med två millimolar ATP och fem millimolar glutation, därefter lagra på is tills vidare användning. Byt försiktigt ut supernatanten mot hela 400 mikroliter av lösning. Tillsätt fem mikrogram renat virusgenomisk RNA till cellerna och överför cellupphängningen till en fyra millimeters cuvette för elektroporation vid 975 microfarad och 270 volt för 20 millisekunder.Efter elektroporation, använd en Pasteur pipetter för att överföra cellerna så snabbt som möjligt i 11 milliliter av komplett DMEM och utsäde 10 milliliter av de elektroporerade cellerna till en 10 centimeter kultur skålen belagda med kollagen. Därefter lägger du till 1,3 gånger 10 till de femte cellerna i 300 mikroliter medium jämnt på en täcksli i en brunn av en kollagenbelagd 24 mikrotiterplatta och placera tallriken och skålen i cellkulturinkubatorn i 24 timmar. Nästa dag, ersätta supernatant i skålen med 10 milliliter färsk DMEM och returnera skålen till cellkulturen inkubatorn i ytterligare sex dagar.På dag fem till sju, beroende på cellens densitet, utföra immunofluorescerande färgning av transfektionen kontroll för att möjliggöra beräkning av antalet celler som uttrycker målet protein av intresse normaliseras till det totala antalet celler. Framgångsrik elektroporation kan övervakas genom immunofluorescerande färgning av transfektionskontrollen. Transfektionseffektiviteten bör överstiga 40%A replikeringsbrist mutant kan fungera som en negativ kontroll för att bekräfta specificiteten hos färgningen.För att skörda extracellulära cellodlingsbaserade hepatit E-viruspartiklar filtrerar du supernatanten på dag sex genom ett 0,45 mikroliternät för att ta bort eventuellt cellskräp och förvara det skördade extracellulära hepatitE-viruset vid fyra grader Celsius. För intracellulär odlingshärledd hepatit E-viruspartikelskörd, tvätta celler med PBS och lösgöra cellerna med 1,5 milliliter på 0,05%Trypsin-EDTA vid 37 grader Celsius. När cellerna har lossnat, stoppa reaktionen med 8,5 milliliter DMEM och överföra cellupphängningen till ett 50 milliliterrör för centrifugeringen.Tillsätt 1,6 milliliter DMEM komplett medium per elektroporation till enskilda två milliliter reaktionsrör och använd 800 mikroliter av mediet för att återanvända cellerna, vilket överför cellerna till rören. Frys ut cellerna i flytande kväve, och därefter tina cellerna på is tre gånger innan hög hastighet centrifugera den resulterande lysates i 10 minuter vid 10,000 gånger g. Överför sedan supernatanterna till nya rör utan att störa cellskräppellets för minus 80 grader Celsius lagring.För att bedöma titers av de nyproducerade intra och extracellulära hepatit E virus lager, utsäde två gånger 10 till de fyra cellerna per 100 mikroliter av MEM per väl in i 60 centrum brunnarna i ett kollagen-belagda 96-väl mikrotiter platta och fylla de yttersta brunnarna med 100 mikroliter PBS per brunn. Efter 24 timmar vid 37 grader Celsius, tillsätt 50 mikroliter av extracellulära virus partikel supernatant till den första raden av celler. Efter att ha blandat noggrant, späds det för seriellt ut brunnsinnehållet sex gånger vid en en till tre koncentration per brunn genom att överföra 50 mikroliter av supernatant från föregående till nästa rad celler i två exemplar fram till den sista cellraden.För att infektera cellerna med intracellulära cellodlingsbaserade hepatit E-viruspartiklar, tillsätt 25 mikroliter av den intracellulära viruspartikelns supernatant till den översta cellraden och blanda väl innan cellerna seriellt späds sex gånger vid ett ett till fem-förhållande med 25 mikroliter utspädning i duplikat som visats. Placera sedan plattan i cellkulturinkubatorn i sju dagar före immunofluorescerande färgning enligt protokollet i manuskriptet. Efter inkubation och immunfärgning kan plattorna analyseras med hjälp av immunofluorescensmikroskopi.Efter immunostaining den slutliga titer av intra och extracellulära partiklar kan beräknas med hjälp av lämplig formel som anges. Efter målet cell infektion med cell odling-härledda E viruspartiklar genom seriell utspädning, titers mellan en gånger 10 till den femte och tre gånger 10 till de sex fokus bildar enheter per milliliter kan förväntas från de cellkulturer som smittats med den icke-hölje intracellulära cell kultur-härledda hepatit E virus partiklar. I kulturer infekterade med höljesbaserade extracellulära cellodlingsbaserade hepatit E-viruspartiklar förväntas titers mellan en gång 10 till den andra och en gång 10 till den fjärde fokusformningsenheter per milliliter.Dessutom är förhållandet mellan genomet kopior och icke-omslutna intracellulära infektiösa viruspartiklar typiskt lägre än den som observerats för extracellulära cell kultur-härledda hepatit E virus partikel infekterade kulturer, vilket tyder på en högre specifik smittsamhet av de icke-hölje hepatit E virusarter. Viral partikelproduktion och målcellsinfektion kräver en fullständig viral livscykel, och kan ge nya insikter i virus-värd interaktioner. Detta protokoll kan ändras för att utföra replikeringskinetik eller för att producera partiklar som kan användas i infektionsanalyser.Merparten av vår forskning beror för närvarande på smittsamma partiklar, både i den omslutna och icke-omslutna HEV. Och artiklar som använder våra tekniker publiceras för närvarande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyklin-reglerade cellinje ger hög-titer lentivirusvektorer som specifikt riktar dendritiska celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ett protokoll för Analysera hepatit C-virus replikering

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

”Levern-på-ett-Chip” kulturer av primära hepatocyter och Kupffers celler för hepatit B virusinfektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kyckling primära Bursal-cellkultur modell att studera Bursal infektionssjukdom Virus patogenes

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...