Name: a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

Biz hepatit E virüs p6 klon için Suzanne Emerson için müteşekkiriz. HEV'ye özgü tavşan hiperimmün serumu Almanya Friedrich Loeffler Enstitüsü'nde Rainer Ulrich tarafından sağlandı. Ayrıca Ruhr Üniversitesi Bochum Moleküler ve Tıbbi Viroloji Bölümü'nün tüm üyelerine destek ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Şekil 1-7 BioRender.com ile oluşturuldu.

NOT: Tüm deneyler BSL-2 koşulu altında gerçekleştirilir. Hepatit E virüsü RNA veya enfeksiyöz virüs ile temas eden tüm malzemeler, imha edilmeden önce kaputun içindeki bir atık kabından %4 Kohrsolin FF ile düzgün bir şekilde durulanmalıdır.
1. Plazmid hazırlığı
<ol><li>Dönüştürülmüş Escherichia coli JM109 ile 100 μg/mL ampisilin içeren 200 mL LB orta tam uzunlukta HEV gt3 Kernow-C1p6 dizisi için plazmid kodlama içeren (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013...

Plazmid hazırlığından başlayarak, aynı plazmid stoğundan birden fazla doğrusallaştırma yapabilmek için DNA verimleri 150 ng/μL'yi aşmalıdır, bu da önemli genom dizilerinin bakteri kaynaklı mutagenezi riskini en aza indirir. Ayrıca jel elektroforezi ile komple plazmid linelizasyonu için restriksiyon sindiriminin kontrol etmek önemlidir (Şekil 8b). Lineerleştirilmiş plazmid DNA eksikliği in vitro transkripsiyon daha az verimli neden haddeleme daire amplifikasyon neden o...

Hepatit E, dünya çapında yaygınlığı artan oldukça hafife alınmış bir hastalıktır. Yaklaşık 20 milyon enfeksiyon yılda 70.000'den fazla ölümle sonuçlanır1. Altta yatan ajan, Hepatit E virüsü (HEV), yakın zamanda yeniden atandı ve şimdi cins Orthohepevirus ve Piscihepevirus dahil olmak üzere aile Hepeviridae içinde sınıflandırılır. Çeşitli kökenlerden HEV insanlar, domuz, tavşan, sıçan, kuş ve diğer memeliler 2 izole de dahil olmak üzere orthohepevirus A-D türleri içindesınıflanır. Şu anda, sekiz farklı genotip (GT) pozitif odaklı, tek iplikçikli RNA virüsü tespit edilmiştir2. Dizikimlikleri, iletim yolları ve coğrafi dağılımları farklılık belirtse ler de genomik yapıları son derece korunmuştur. Daha spesifik olan 7.2 kbp HEV genomu 3 ana açık okuma çerçevesine (ORF1-3) ayrılmıştır. ORF1 konak hücre içinde başarılı bir çoğaltma için gerekli tüm enzimleri kodlarken, ORF2 capsid proteinini kodlar ve ORF3 proteini enfeksiyöz partiküllerin toplanması ve serbest bırakılması için gerekli olan işlevsel bir iyon kanalı olarak çalışır3. Bir kez bazal veya apikal lümen HEV içine yayımlanan her iki, yarı ve zarflı olmayan / çıplak türler virüs kan veya dışkı, sırasıyla4,5kaynaklı olup olmadığına bağlı olarak var .
GT1 ve GT2 daha çok gelişmekte olan ülkelerde bulunurken, sadece dışkı-oral yol ileinsanlara 6 bulaştıran, GT3, GT4 ve GT7 ağırlıklı olarak gelişmiş ülkelerde meydana1,7 rezervuarlar olarak hizmet veren türlerin çeşitliile,örneğin, domuz8, sıçan9, tavuk10,11, geyik12, firavun faresi13, yarasa14, tavşan15,16, yaban domuzu17 ve daha birçok7,18,19, zoonoz kanıt sağlayan7,20,21,22. Yetersiz sıhhi koşullara ek olarak23 ve kontamine gıda ürünleri12,24,25,26, kan transfüzyonu ve organ nakli ile iletim demümkündür 27,28. HEV karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliği nin sık görülen bir nedenidir29 özellikle önceden var olan karaciğer hastalığı olan hastalarda, bağışıklık sistemi zayıf bireylerde (genotip 3, 4 ve 7) ve gebe kadınlarda (genotip 1). Not, hematopoetik hastalık30gibi ekstrahepatik belirtileri de vardır30 ,31,32, nörolojik bozukluklar33 ve böbrek hasarı34.
Bugüne kadar, off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok enfekte hastalar için tercih edilen tedavi35,36. Ancak, tedavi başarısızlığı ve kötü klinik uzun vadeli sonuçlar vakaları bildirilmiştir. Tedavi yetmezliği viral mutagenez ve kronik enfekte hastalarda artmış viral heterojenite ile bağlantılı olmuştur37,38,39. Aksine, yakın zamanda yapılan bir Avrupa retrospektif çok merkezli çalışma da polimeraz mutasyonlarını RBV tedavi yetmezliği40ile ilişkilendiremedi. Klinik gözlemler ve in vitro deneylerde, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, çinko tuzları 46 ve silvestrol47 47,48 de antiviral etkileri göstermiştir. Bununla birlikte, hev yaşam döngüsü ve patogenezi hakkında bilgi eksikliği engel, belirli bir HEV tedavisi bulunabilir kalır. Bu nedenle, virolojik çalışmalar ve yeni antiviral ilaçların geliştirilmesi için sağlam bir hücre kültür sistemi acilen ihtiyaç vardır49.
Ne yazık ki, diğer hepatit virüsleri gibi, HEV konvansiyonel hücre hatlarında yaymak zordur ve genellikle çok yavaş düşük viral yüklere yol ileir. Yine de, bazı gruplar hücre hattı subklonlar üretimi tarafından viral yükleri artırmak başardık50 veya medya takviyeleri ayarı51. Son zamanlarda cDNA klonlar üretimi52 ve primer hastanın adaptasyon geçerek izole53,54 hücre kültüründe daha iyi HEV yayılımı55. Bu protokolde, kernow-C1 suş adapte bir hücre kültürünün genomu kullanılan (p6_WT olarak anılacaktır)54 ve bir mutant suş bir çoğaltma arttırıcı mutasyon barındıran (p6_G1634R olarak anılacaktır)37. Kernow-C1 HEV hücre kültüründe en sık kullanılan suşudur ve yüksek viral yükler üretebilme yeteneğine sahiptir. Viral RNA kopya sayıları değerlendirilerek, HEV replikasyonu in vitro olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknikler üretilen enfeksiyöz partikül sayısının değerlendirilmesini izin vermez. Bu nedenle Odak Şekillendirme Birimlerini (FFU/mL) belirlemek için immünoresans boyama sistemi kurduk.
Burada açıklanan yöntem56 birincil hücreler ve memeli hücre hatları da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden hücre türleri çeşitli enfekte yeteneğine sahip tam uzunlukta bulaşıcı viral parçacıklar üretmek için kullanılabilir. Bu HEV enfeksiyonu ve tropizm önemli yönlerini deşifre etmek için temel bir ön koşuldur. Genellikle sınırlı hasta izole ile aşılama için gerek yoktur. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü nispeten verimli kılar. Buna ek olarak, bu sistem in vivo tanımlanan genom değişimi ve HEV replikasyon ve fitness üzerindeki etkileri çalışma sağlayan ters genetik için kullanılabilir. Bu teknik birçok sınırlamanın üstesinden gelmekte ve ilaç gelişimi, mutagenez çalışmaları ve kısıtlama veya giriş faktörleri gibi virüs-konak etkileşimlerinin değerlendirilmesi için yol olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m mesh</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td>Harvest extracellular Virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % Histofix</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>P087.4</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>Virus harvesting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td>Selection of transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140965001</td>
			<td>in vitro transcription and electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Figure Generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140922001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli JM109</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15710049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140957001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Braun</td>
			<td>184238001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-03</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5G</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31095-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100&#215;)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included in R0198L</td>
			<td>Linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740588.250</td>
			<td>Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740948.250</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>gibco</td>
			<td>70011051</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)</td>
			<td>Todt et.al</td>
			<td></td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td>
			<td>Shukla et al.</td>
			<td>GenBank accession no. JQ679013</td>
			<td>Virus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 1E6</td>
			<td>LS-Bio</td>
			<td>C67675</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody 8282</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo m7G Cap Analog</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1711</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>A998.3</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin (RNase inhibitor)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody donkey anti-mouse 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>included in P2077</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low IgG</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1921005PJ</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11140949001</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for producing high titer hepatitis e virus stocks

Hepatit E virüsü karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliğinin önde gelen nedenidir ve dünya çapında yaygınlığı artmaktadır. Tek iplikçikli RNA virüsü ağırlıklı olarak kan transfüzyonu, yetersiz sıhhi koşullar ve kontamine gıda ürünleri ile bulaşır. Bugüne kadar off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok hasta için tercih edilen tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, belirli bir HEV tedavisi tespit edilmeyi sürdürebilir. Şimdiye kadar, HEV yaşam döngüsü ve patogenez hakkında bilgi ciddi verimli bir HEV hücre kültür sisteminin eksikliği nedeniyle engel olmuştur. Güçlü bir hücre kültür sistemi de viral patogenez içeren viral yaşam döngüsünün çalışma için gereklidir. Burada açıklanan yöntemle 3 x 106 odak şekillendirme ünitesi/mL(FFU/mL) zarfsız HEV ve 5 x 104 FFU/mL'ye kadar zarflı HEV viral titreler üretilebilir. Bu parçacıkları kullanarak, birincil hücreler ve insan da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden gelen hücrelerin çeşitli enfekte etmek mümkündür, yanı sıra hayvan hücre hatları. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü son derece verimli hale getirir.

Bu protokolde, yüksek titreen enfeksiyöz HEVcc üretimini açıklıyoruz. İlk adım plazmid DNA izole etmektir (pBluescript_SK_HEVp654 ve pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Şekil 8a), daha sonra kısıtlama sindirim tarafından doğrusallaştırılmış ve in vitro transkripsiyon için saflaştırılmış (Şekil 1). Başarılı bir doğrusallaştırma jel elektroforez kullanılarak sindirilmiş olmayan plazmid-DNA...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks at JoVE.com

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Burada açıklanan hepatit E virüsü (HEV) yüksek viral titresi üretmek için nasıl etkili bir yöntemdir verimli hepatoma hücreleri enfekte etmektir. Sunulan yöntemle, hem zarfsız, hem de zarflı viral parçacıklar hasat edilebilir ve çeşitli hücre hatları aşılamak için kullanılabilir.

Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatit E virüs araştırmaları, etkin bir hücre kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmiştir. Tekniklerimiz bu sınırlamaların üstesinden gelerek ilaç tasarımı ve aşı geliştirmenin önünü açarak. Bu protokol ile, çeşitli hücrelerin enfeksiyonunu kolaylaştırarak, hem zarf dışı hem de zarf hev partiküllerinin enfeksiyöz yüksek titrevirüslerini üretebiliyoruz.Bu protokolün uygulanması için bsa-2 tesisine erişim ve temel hücre kültürü teknikleri ile deneyim gerekir. Plazmid DNA'sını doğrusallaştırmak için şablon DNA'sının 10 mikrogramını 10 mikrolitre tampon ve iki mikrolitre Micrococcus luteus restriksiyon enzimiyle karıştırın ve son hacmi suyla birlikte 100 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra 37 santigrat derece bir saat için çözüm kuluçka ve standart protokollere göre agarose jel elektroforez ile plazmid doğrusalizasyon onaylamak.Plazmid DNA izolasyonu ve lineerizasyondan sonra, doğrusallaştırmanın başarısı sindirilmemiş plazmid DNA'sı jel elektroforezile sindirilmiş plazmid DNA'sı ile karşılaştırılarak doğrulanabilir. Saflaştırılmış, tam uzunlukta hepatit E virüs DNA'sının in vitro transkripsiyonu için, doğrusaldna şablonunun iki mikrogramını uygun reaktiflerle karıştırın ve çözeltinin son hacmini 100 mikrolitreye getirmek için çekirdeksiz su kullanın. Iyice karıştırdıktan sonra, 37 santigrat derece iki saat boyunca çözelti kuluçka.İki saat sonra, tüpe iki mikrolitre T7 RNA polimeraz ekleyin. Sonra reaksiyonu karıştırın ve tüpü 37 derecede iki saat daha kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 7,5 mikrolitre DNA ile ilk DNA şablonunu 30 dakika boyunca 37 derece boyunca iyice karıştırArak ve kuluçkaya yatırArak sindirin.Ekstraksiyondan sonra, standart protokollere göre agarose jel elektroforezi ile RNA bütünlüğünü ve verimini dikkatlice kontrol edin. Düşük RNA bolluğu durumunda bulanık yayma yerine farklı bantlar gözlenmelidir. Bazı adımlar hızlı yürütme ve bu nedenle ayrıntılı hazırlık gerektirir.Ayrıca, RNA bütünlüğü ve hücre canlılığı için özel dikkat edin. Hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs üretimi için insan karaciğer kanseri hücreleri hazırlamak için, 15 santimetre kollajen kaplı kültür çanak üzerine tam DMEM 20 mililitre hücreleri tohum ve 37 santigrat derece de inkübat onlar% 90 biraraya ulaşana kadar. Kültürün sonunda, hücreleri hücre kültür plakasından 37 santigrat derecede %0.05 Tripsin-EDTA ile ayırmadan önce 10 mililitre PBS ile yıkayın.Tam DMEM 10 mililitre müstakil hücreleri resuspend ve sayma için 50 mililitrekonik tüp içine hücreleri aktarın. Altı hücreye beş kez 10'u yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri yıkama başına 35 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, supernatant çıkarmadan buz hücreleri yerleştirin.Hedef hücrelerin elektroporasyonu için, iki milimolar ATP ve beş milimolar glutatyon ile sitomix ek 384 mikrolitre, daha sonra daha fazla kullanım akadar buz üzerinde saklamak. Supernatant'ı 400 mikrolitre çözeltinin tamamıyla dikkatlice değiştirin. Hücrelere saflaştırılmış viral genomik RNA beş mikrogram ekleyin ve 20 milisaniye için 975 mikrofarad ve 270 volt elektroporasyon için dört milimetrelik bir cuvette hücre süspansiyon aktarın.Elektroporasyondan sonra, hücreleri mümkün olan en kısa sürede 11 mililitre tam DMEM'e aktarmak için pasteur pipeti kullanın ve 10 mililitre elektroporated hücreyi kollajenle kaplanmış 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, kollajen kaplı 24 mikrotiter plaka bir kuyuda bir kapak kayma üzerine orta 300 mikrolitre beşinci hücrelere 1,3 kez 10 ekleyin ve 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka ve çanak yerleştirin. Ertesi gün, taze DMEM 10 mililitre ile çanak supernatant değiştirin ve ek bir altı gün için hücre kültürü kuluçka için çanak dönmek.Beşinci günden 7'ye kadar, hücre yoğunluğuna bağlı olarak, transfeksiyon kontrolünün immünororesan boyamasını gerçekleştirerek, hedef proteini ifade eden hücre sayısının toplam hücre sayısına normalleştirilmesini sağlar. Başarılı elektroporasyon transfeksiyon kontrolünün immünoresan boyama ile izlenebilir. Transfeksiyon verimliliği aşmalıdır 40% Bir çoğaltma eksik mutant boyama özgüllüğünü doğrulamak için olumsuz bir kontrol olarak hizmet verebilir.Hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs partiküllerini hasat etmek için, altıncı günde, süpernatant'ı 0,45 mikrolitrelik bir kafesten filtreleyin, herhangi bir hücre enkazını çıkarın ve hasat edilen hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüsünü dört santigrat derecede saklayın. Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık hasadı için, hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 1,5 mililitre ile 37 santigrat derecede %0,05 Tripsin-EDTA ile ayırın. Hücreler ayrıldığında, 8.5 mililitre DMEM ile reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu santrifüj için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tek tek iki mililitre reaksiyon tüpleri için elektroporasyon başına tam orta 1.6 mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için orta 800 mikrolitre kullanın, böylece tüplere hücreleri aktarArak. Hücreleri sıvı nitrojenle dondurun ve daha sonra yüksek hızda 10 dakika 10 dakika boyunca 10 dakika, 000 kez g'de santrifüj etmeden önce hücreleri buzüzerinde üç kez eritin. Sonra eksi 80 santigrat depolama için hücre enkaz pelet rahatsız etmeden yeni tüpler içine supernatants aktarın.Yeni üretilen intra ve ekstrasellüler hepatit E virüs stoklarının titrelerini değerlendirmek için, kollajen kaplı 96 kuyulu mikrotiter plakanın 60 merkez kuyusuna her 100 mikrolitre mem başına dört hücreye iki kez 10 tohum tohumu ve en dış kuyuları kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile doldurun. 37 santigrat derecede 24 saat sonra, hücrelerin ilk satırına 50 mikrolitre ekstrasellüler virüs parçacığı ekselansları ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, seri hücrelerin son satırına kadar yinelenen hücrelerin önceki bir sonraki satıra supernatant 50 mikrolitre aktararak kuyu başına bir ila üç konsantrasyon altı kez seyreltin.Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile hücreleri enfekte etmek için, hücrelerin üst satırına hücre içi virüs parçacığı supernatant 25 mikrolitre ekleyin ve seri olarak bir ila beş oranında hücreleri altı kez seyreltme önce iyice karıştırın 25 kopya seyreltme çoğaltılması olarak gösterilmiştir. Daha sonra yazıdaki protokole göre immünofloresan boyama önce yedi gün boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka ve immün boyama sonrasında, plakalar immünfloresans mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir.İmmünleledikten sonra hücre içi ve hücre dışı partiküllerin son titreci belirtildiği gibi uygun formül kullanılarak hesaplanabilir. Seri seyreltme ile hücre kültürü kaynaklı E virüs parçacıkları ile hedef hücre enfeksiyonu sonra, mililitre başına altı odak oluşturan birimleri bir kez 10 ila üç kez arasında titreler olmayan zarflı hücre içi hücre kültürü türevi hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte hücre kültürleri beklenebilir. Zarflı hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte kültürlerde, mililitre başına birim oluşturan dördüncü odak 10 bir kez 10 ve bir kez arasında titrebekleniyor.Buna ek olarak, genom kopyaları ve zarfsız hücre içi enfeksiyöz virüs parçacıkları arasındaki oran tipik olarak hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık enfekte kültürleriçin gözlenenden daha düşüktür, bu da zarfsız hepatit E virüs türlerinin daha yüksek spesifik bir enfekteliği düşündürmektedir. Viral parçacık üretimi ve hedef hücre enfeksiyonu tam bir viral yaşam döngüsü gerektirir, ve virüs-host etkileşimleri içine yeni anlayışlar sağlayabilir. Bu protokol çoğaltma kinetik gerçekleştirmek veya enfeksiyon tahlilleri kullanılabilecek parçacıklar üretmek için değiştirilebilir.Araştırmalarımızın çoğu şu anda hem zarflı hem de zarfsız HEV'de bulunan enfeksiyöz partiküllere bağlıdır. Ve tekniklerimizi kullanan makaleler şu anda yayınlanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...