Name: embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par des fonds de démarrage de l’UCSD dirigés vers O.S.A.

1. Élevage de colonies de C. quinquefasciatus
<ol><li>Installez plusieurs colonies d’adultes de C. quinquefasciatus dans des cages à insectes. NOTE: Les colonies ont été fournies par la Dre Laura Harrington à l’Université Cornell20. Des protocoles détaillés pour l’élevage des moustiques Culex peuvent être trouvés dans d’autrespublications 21.<ol>
<li>Maintenez les moustiques à 25 ± 1 °C à 30% d’humidité avec un cycle jour/nuit de 12:12 h.</li>
		<li>Fournissez une solution de sucre à 20% ad libitum en introduisant un récipient de solution de sucre avec une mèche dans la cage ou en saturant des boules de coton avec la solution de sucre et en la plaçant dans la cage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laissez les moustiques s’accoupler pendant au moins 3 jours avant l’alimentation sanguine (Figure 2A).</li>
</ol>2. Collection d’embryons de C. quinquefasciatus au stade pré-blastodermique
<ol><li>Après 3 à 6 jours après l’eclosion, fournir aux femelles 1 à 2 mL d’une farine de sang bovine citrée à travers une membrane synthétique et chauffée à environ 40 °C dans un système d’alimentation sanguine (Figure 2B). Il existe également d’autres protocoles d’alimentation sanguine qui peuvent être utilisés pour les moustiques Culex (par exemple, voir ref21). REMARQUE: C. quinquefasciatus est connu pour une préférence pour le sang aviaire. Certains laboratoires utilisent des oiseaux vivants anesthésiés ou du sang aviaire pour leur source de farine de sang21,22,23. Cependant, les colonies peuvent être entraînées/sélectionnées pour se nourrir de sang bovin ou de petits rongeurs si cette caractéristique est sélectionnée pour plusieurs générations.<ol>
<li>Laissez les femelles se reposer pendant au moins 3 jours après l’alimentation sanguine pour subir une oogenèse et une maturation des œufs avant d’induire une ponte pour des expériences de micro-injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour des microinjections embryonnaires, créez une tasse de ponte avec de l’eau de ponte infusée organiquement. L’eau de ponte doit être faite en fermentant les excréments de lapin (50 g / L), en décomposant l’herbe (4,5 g / L) ou la nourriture pour poissons (25 g / L) dans l’eau au cours de 5 jours ou plus24,25.</li>
	<li>Placez la coupe de ponte dans la cage et placez la cage entière dans un endroit sombre (Figure 2C).</li>
	<li>Après toutes les 30 minutes, vérifiez la tasse pour les radeaux d’œufs.<ol>
<li>Si des radeaux d’œufs sont présents, ramassez les radeaux en les ramassant avec un pinceau et placez-les sur un papier filtre humide (Figure 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alignement des embryons au stade pré-blastodermique de C. quinquefasciatus
<ol><li>Séparez les œufs des radeaux en appuyant sur le radeau et en les séparant individuellement à l’aide d’un pinceau à pointe fine et d’une pince (Figure 2E).</li>
	<li>Aligner les œufs individuels sur une fine bande de ruban adhésif double face placée sur le dessus d’une glissière de verre (Figure 2F).</li>
	<li>Tout en alignant, essayez de pointer le côté antérieur de chaque œuf dans la même direction pour une accessibilité plus facile. REMARQUE: Une méthode alternative d’alignement des ovules sans ruban adhésif double face peut être trouvée dans un protocole de micro-injection embryonnaire de Nasonia vitripennis précédemment publié26.</li>
	<li>Couvrir les œufs avec le mélange d’huile d’halocarbure. REMARQUE: Le mélange d’halocarbures peut être préparé à l’avance en mélangeant doucement deux réactifs halocarbonés et de l’eau (9:1:20, halocarbure 700: halocarbone 27: eau ultrapure), puis en incubant le mélange pendant la nuit à25°Cpour faciliter la saturation en eau de l’huile d’halocarbure.</li>
</ol>4. Préparation à l’aiguille pour les microinjections
<ol><li>Générez les aiguilles de verre capillaire aluminosilicate à l’aide d’un arracheur de micropipette en verre.<ol>
<li>Placez un verre capillaire aluminosilicate dans un arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions du manuel d’utilisation de l’arracheur d’aiguilles. REMARQUE: Des aiguilles capillaires en quartz et en borosilicate peuvent également être utilisées, mais pour cette expérience, l’aluminosilicate est préféré en raison de son prix relativement abordable et de sa durabilité.</li>
		<li>Réglez la chaleur sur 516, la vitesse sur 100, le retard sur 70, la traction sur 97 et la pression sur 500 sur l’arracheur d’aiguilles.</li>
		<li>Activez l’arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions de l’arracheur et répétez au besoin pour des aiguilles supplémentaires. REMARQUE: Pendant le processus d’injection, les aiguilles se bouchent souvent ou se cassent accidentellement, par conséquent, il est fortement recommandé de tirer des aiguilles supplémentaires pour une seule expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biseautez la pointe de l’aiguille en touchant doucement la pointe de l’aiguille tirée sur la plaque abrasive diamantée rotative pendant environ 10 s à un angle de 50°. REMARQUE: Le biseautage de l’aiguille l’ouvre pour permettre au liquide de circuler tout en créant une pointe plus nette pour une pénétration plus facile dans l’embryon. Un exemple d’aiguille appropriée peut être vu dans un article précédent26.</li>
	<li>Rangez les aiguilles tirées et biseautées en les incorporant dans des lignes d’argile de modéliste dans une boîte de Pétri. REMARQUE: Pour assurer la meilleure qualité pour les pointes d’aiguilles, les aiguilles doivent être fraîchement tirées et biseautées aussi près que possible du moment de l’injection.</li>
</ol>5. Chargement du mélange d’injection
<ol><li>Préparer le mélange injectable composé de réactifs de modification du génome (p. ex., 200 ng/μL d’ARNs sg et 200 ng/μL de mélange Cas9), ou de solutions d’injection préférées et le conserver sur la glace. REMARQUE: Ce mélange peut être préparé en attendant que les œufs soient pondus. Plus de détails sur la production de Cas9 et d’ARNg et la préparation à la microinjection peuvent être trouvés dans les publications précédentes27,28,29,30.</li>
	<li>Chargez 2 μL de mélange d’injection dans l’aiguille d’injection à l’aide d’une pointe de microchargeur.</li>
</ol>6. Mise en place de la micro-injection
<ol><li>Placez l’aiguille d’injection remplie dans un micromanipulateur mis en place relié à un micro-injecteur électronique.</li>
	<li>Placez la lame de verre contenant les œufs alignés sur la scène d’un microscope composé.</li>
	<li>À l’aide du micromanipulateur et du microscope composé, alignez l’aiguille pour viser l’extrémité postérieure de l’embryon à un angle de 25 à 35 °.</li>
</ol>7. Microinjection embryonnaire (Figure 2G)
<ol><li>Insérez soigneusement l’aiguille dans l’embryon et injectez le mélange à une quantité d’environ 10% du volume de l’embryon (700-800 pL selon la taille des ovules). REMARQUE: Lors de l’injection, l’œuf devrait légèrement gonfler, cependant, si trop de liquide est injecté, les œufs peuvent éclater ou le liquide cytoplasmique peut s’échapper.</li>
	<li>Injectez environ 20 ovules à la fois, puis arrêtez et effectuez des procédures de récupération d’embryons. REMARQUE: Lors de l’injection, il y a un risque élevé que les aiguilles se bouchent ou se cassent. Si un bouchon se produit, ce qui peut être déterminé par un manque de liquide d’injection circulant à travers l’aiguille, essayez soit de nettoyer l’aiguille avec la fonction de nettoyage sur le micro-injecteur électronique, soit d’essayer de re-biseauter l’aiguille. Si aucune des deux étapes ne fonctionne, changez rapidement pour une nouvelle aiguille tout en vous assurant que les œufs préparés restent humidifiés.</li>
</ol>8. Récupération et éclosion des embryons
<ol><li>Laissez les œufs intacts pendant au moins 5 min. Dans les 20 minutes suivant l’injection, retirez soigneusement l’huile d’halocarbure en brossant légèrement avec un pinceau propre(Figure 2H).</li>
	<li>Soulevez doucement les œufs à l’aide d’un pinceau et placez-les dans une tasse d’eau double distillée(Figure 2I). Prenez soin de garder les œufs à la surface de l’eau.</li>
	<li>Vérifiez les œufs tous les jours pendant 7 jours pour l’éclosion (Figure 2J).</li>
	<li>Suivre les procédures normales d’élevagelarvaire 21.</li>
</ol>9. Dépistage de la modification du génome
<ol><li>Dépister les moustiques injectés pour les phénotypes mutants à l’aide d’un stéréoscope (Figure 2K).<ol>
<li>Vérifier les mutations qui n’ont pas un phénotype facilement reconnaissable, par amplification PCR, dosage de l’endonucléase I T7 et séquençage par sous-clonage de la région cible31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre en place des croisements supplémentaires entre les individus injectés pour détecter les mutations héréditaires dans la lignée germinale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Avec les efforts récents pour générer des outils génétiquement modifiés pour la lutte contre les moustiques vecteurs, il est nécessaire de développer et d’optimiser les protocoles de micro-injection embryonnaires pour les vecteurs communs de la maladie des moustiques. Bien que des méthodes aient été développées pour les moustiques Aedes et Anophèles, un protocole conçu spécifiquement pour Culex a été peu exploré. En général, les protocoles d’injection d’embryons de moustiques peuvent être divisés en 3 étapes générales: 1) la collecte et la préparation d’embryons, 2) l’injection d’embryons et 3) la récupération post-injection. Afin de générer avec succès des mutants, les trois étapes doivent être optimisées pour l’espèce cible. Ce protocole modifié pour la microinjection embryonnaire est spécifique à la réussite de l’ingénierie du génome des moustiques Culex.
La maximisation de la collecte d’embryons est un goulot d’étranglement courant dans les protocoles de micro-injection d’embryons. Afin d’augmenter le nombre d’œufs collectés en peu de temps, les moustiques ont été limités à partir d’un substrat de ponte pendant 2-3 jours après le repas de sang. Il est important de noter que C. quinquefasciatus a tendance à préférer les sources de sang aviaire aux sources de mammifères ou à l’alimentation membranaire avec du sang de mammifères. Cependant, de nombreux chercheurs ont du mal à acquérir une source fiable d’oiseaux vivants ou de sang aviaire pour l’alimentation sanguine, de sorte que les stocks de laboratoire peuvent être adaptés pour se nourrir de sources de sang plus accessibles. Il est également crucial d’utiliser de l’eau riche en nutriments pour le substrat de ponte, car elle fournit des signaux de ponte pour C. quinquefasciatus et la plupart des autres vecteurs Culex. Il existe de nombreuses méthodes pour générer de l’eau riche en nutriments, qui peuvent devoir être optimisées entre les laboratoires pour s’assurer qu’un nombre approprié d’œufs sont disponibles pour la micro-injection. Par exemple, alors que cette méthode a été la plus efficace avec des excréments de lapin fermentés dans de l’eau désionisée pendant 5 jours ou plus, d’autres chercheurs ont plus de succès avec l’herbe ou la nourriture pour poissons comme source de nutriments et certains même avec de l’eau distillée21.
Étant donné que les moustiques Culex pondent des groupes d’œufs dans des radeaux, la collecte des œufs est assez simple. Les œufs peuvent simplement être ramassés en ramassant tout le radeau avec un pinceau. La séparation des ovules est plus compliquée, mais essentielle pour une injection réussie. Les œufs peuvent être soigneusement séparés du radeau en appliquant une légère pression vers le bas entre les œufs avec un pinceau ou une pince. Avec un peu de pratique, plusieurs utilisateurs ont pu séparer de manière fiable des œufs uniques des radeaux d’œufs. Après avoir séparé chaque œuf, les œufs sont alignés dans la même orientation sur du ruban adhésif double face, ce qui stabilise les œufs pendant la microinjection. Les œufs sont injectés dans l’extrémité postérieure effilée et l’ajout d’huile d’halocarbure maintient les œufs humides pendant la manipulation.
Pour limiter les dommages embryonnaires pendant la microinjection, les aiguilles d’injection doivent être d’une force appropriée et biseautées à un angle approprié. Les aiguilles en aluminosilicate biseautées pendant 10 secondes à un angle de 50° ont eu les meilleurs résultats, mais les aiguilles en borosilicate et en quartz peuvent également fonctionner, même si elles peuvent être moins durables et plus chères. De plus, un biseautage approprié de l’aiguille facilite une meilleure circulation des mélanges Cas9 et sgRNA et crée un point plus net pour une pénétration plus facile dans l’embryon. Dans de nombreux cas, le biseautage est également un moyen efficace de réparer rapidement les aiguilles obstruées au lieu de passer du temps et des efforts à remplacer les aiguilles obstruées.
Après l’injection, les œufs doivent rester intacts pendant au moins 5 minutes, l’huile d’halocarbure étant retirée immédiatement après en la brossant doucement avec un pinceau propre. Après le retrait de l’huile d’halocarbure, les œufs injectés peuvent être placés dans l’eau pour éclore, ce qui se produit généralement dans les 3 jours suivant l’injection. Avec de la pratique et un nombre suffisant d’œufs, ce protocole peut obtenir des mutations somatiques et germinales cohérentes chez C. quinquefasciatus et est suffisamment polyvalent pour être facilement adaptable aux autres moustiques Culex.

C. quinquefasciatus, communément appelé le moustique domestique du sud, est un vecteur compétent de nombreux agents pathogènes, y compris le virus du Nil occidental (VNO), l’encéphalite japonaise, l’encéphalite de Saint-Louis et l’encéphalite équine de l’Est. En particulier, depuis qu’il a été détecté pour la première fois à New York en 1999, le VNO est devenu une maladie à transmission vectorielle majeure dans l’ensemble de la partie continentale des États-Unis (US) avec plus de 50 000 cas humains signalés entraînant environ 2 300 décès entre 1999 et 20181 ainsi que plus de 4 500 cas équins signalés entre 2008 et 20192. De plus, au moins 23 espèces d’oiseaux trouvées en Amérique du Nord ont été touchées par des infections par le VNO, avec au moins 12 espèces classées comme irrécupérables à la suite du VNO3. L’impact du VNO sur les populations humaines, équines et aviaires est dû au comportement alimentaire opportuniste de ses vecteurs. En règle générale, les oiseaux sont les principaux hôtes du VNO, et les humains et les chevaux sont des hôtes accidentels ou sans issue. Certains agents pathogènes vecteurs par C. quinquefasciatus n’infectent que les oiseaux tels que le parasite du paludisme aviaire, Plasmodium relictum. À Hawaï, C. quinquefasciatus est un vecteur principal du paludisme aviaire et a provoqué l’extinction de nombreuses espèces d’oiseaux indigènes4,5.
Pour lutter contre les maladies transmises par C. quinquefasciatus,les chercheurs et les organismes de lutte antivectorielle ont utilisé des outils de lutte contre la population de moustiques couramment établis tels que l’application d’insecticides6,cependant, ces méthodes sont coûteuses, non spécifiques à l’espèce, et ont une efficacité limitée car la résistance aux insecticides est élevée dans de nombreuses populations de C. quinquefasciatus 6,7,8,9. D’autres techniques de contrôle, telles que les stratégies de contrôle de la population basées sur Wolbachiaont été développées ces dernières années10,11, mais les coûts de condition physique associés à l’infection à Wolbachia limitent la faisabilité de cette approche pour ce vecteur12. Il existe également des méthodes de contrôle génétiques qui ont été développées chez d’autres espèces de moustiques telles que Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 et Anopheles stephensi16, y compris le développement de moustiques résistants aux agents pathogènes17,18,19, qui pourraient également être développés pour C. quinquefasciatus si les outils d’ingénierie du génome requis sont développé pour cette espèce. Cependant, la biologie de C. quinquefasciatus diffère considérablement des autres moustiques vecteurs Aedes et Anophèles, ce qui a rendu difficile le développement de technologies génétiques similaires dans ce vecteur. Avec l’avènement des technologies d’ingénierie du génome basées sur CRISPR, l’ingénierie du génome de précision est devenue de plus en plus triviale, abordable et adaptable et a par conséquent conduit au développement de nouveaux outils génétiques dans une grande variété d’espèces.
Pour générer des mutations avec les technologies basées sur CRISPR, un mélange de protéine Cas9 et d’ARN guide synthétique (SGRNA), complémentaire aux loci souhaités, est microinjecté dans des embryons au stade pré-blastoderme. Étant donné que les femelles de C. quinquefasciatus pondent leurs œufs en groupes attachés dans une structure de radeau flottant (Figure 1), par opposition à l’ovoïposion d’œufs individuels, un trait des moustiques Aedes et Anophèles, les microinjections embryonnaires sont de plus en plus compliquées chez cette espèce. Les larves de Culex émergent également de la face antérieure de chaque œuf, qui est en contact avec la surface de l’eau (Figure 1), de sorte que l’orientation de l’œuf après manipulation est importante chez cette espèce. Nous décrivons ici un protocole détaillé conçu pour la microinjection de la protéine Cas9 et de l’ARNg dans des embryons de C. quinquefasciatus. Ce protocole a été conçu pour s’adapter aux caractéristiques propres à la biologie Culex afin d’améliorer la survie des embryons et les taux de mutation du génome à travers certaines étapes qui sont essentielles pour la collecte et la survie des ovules en temps opportun.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus est vecteur d’un large éventail de maladies à transmission vectorielle telles que le paludisme aviaire, le virus du Nil occidental (VNO), l’encéphalite japonaise, l’encéphalite équine de l’Est, la filariose lymphatique et l’encéphalite de Saint-Louis. Notamment, le paludisme aviaire a joué un rôle majeur dans l’extinction de nombreuses espèces endémiques d’oiseaux insulaires, tandis que le VNO est devenu une maladie à transmission vectorielle importante aux États-Unis. Pour mieux comprendre la biologie de C. quinquefasciatus et élargir sa boîte à outils de contrôle génétique, nous devons développer des méthodes plus efficaces et abordables pour l’ingénierie du génome chez cette espèce. Cependant, certains traits biologiques uniques aux moustiques Culex, en particulier leurs radeaux d’œufs, ont rendu difficile l’exécution des procédures de micro-injection requises pour l’ingénierie du génome. Pour relever ces défis, nous avons développé un protocole de micro-injection embryonnaire optimisé qui se concentre sur l’atténuation des obstacles techniques associés aux caractéristiques uniques des moustiques Culex. Ces procédures démontrent des méthodes optimisées pour la collecte des ovules, la séparation des radeaux d’œufs et d’autres procédures de manipulation essentielles à la réussite de la microinjection chez C. quinquefasciatus. Lorsqu’elles sont associées à la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9, ces procédures nous permettent d’obtenir des mutations germinales spécifiques au site, efficaces et héréditaires, qui sont nécessaires pour effectuer une ingénierie génomique avancée et développer des technologies de contrôle génétique dans ce vecteur de maladie important, mais actuellement sous-étudié.

Dans des expériences publiées précédemment, cette méthode a été utilisée pour générer avec succès des mutations somatiques et germinales d’un gène essentiel au développement de la pigmentation des yeux foncés, le blanc (CPIJ005542)30 (tableau 1). Les mutations somatiques générées par CRISPR/Cas9 ont été notées par dépistage de la perte de pigmentation dans les yeux nymphaux des individus injectés (G0). Les mutations somatiques étaient généralement présentes sous forme de phénotypes en mosaïque où certaines cellules, mais pas toutes, ont le phénotype mutant. Par exemple, des mutations somatiques du gène blanc ont abouti à un mélange d’ommatidies avec des phénotypes dépourvus de pigmentation et de ceux avec un phénotype pigmenté de type sauvage30. Cependant, lorsqu’il y a eu une mutation germinale du gène blanc, la génération suivante (G1)a hérité du phénotype complet des yeux blancs. Les taux de mutation germinale ont été déterminés en croisant les individus de la mosaïque G0 et en marquant pour une progéniture aux yeux complètement blancs (G1). Ces expériences ont abouti à un taux de survie embryonnaire de 64% à 82%, ainsi qu’à un taux de mutagénèse somatique de 37% à 57% et à un taux de mutagénèse germinale de >61% (Tableau 1). En multiplexant les sgRNA pour cibler plusieurs loci dans le même gène, les taux de mutagénèse somatique et germinale ont augmenté jusqu’à 86% (Tableau 1). En outre, pendant de nombreuses générations, des stocks homozygotes viables de mutants blancs ont été conservés avec succès en laboratoire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figure 1 : Radeau d’œufs de C. quinquefasciatus et morphologie d’un seul œuf. Vues dorsales (A), latérales (B) et ventrales (C) des radeaux d’œufs C quinquefasciatus. Les femelles de C. quinquefasciatus pondent leurs œufs, la face antérieure la plus bulbeuse touchant la surface de l’eau tandis que la face postérieure la plus pointue loin de la surface de l’eau (D). A- antérieur; P- postérieur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figure 2 : Chronologie de création des mutants de C. quinquefasciatus par microinjection. Chronologie de la préparation de la colonie de C. quinquefasciatus et de la collecte d’embryons pour la microinjection (A-D). Les œufs collectés sont ensuite séparés (E) alignés dans la même orientation et recouverts d’huile halocarbonée (F). Les œufs sont ensuite injectés (G) et laissés au repos pendant au moins 5 min avant de retirer l’huile d’halocarbure (H). Les œufs sont ensuite transférés dans une source d’eau propre (I) pour l’éclosion (J) et examinés pour les phénotypes mutants (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Survie</td>
			<td colspan="3">Mosaïcisme somatique (G0)</td>
			<td>Mutagénèse germinale (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARNg</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>G1 mutants (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>arNNc-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Taux de survie et de mutation des embryons injectés avec des ARNg simples et multiplexés ciblant le blanc. Le tableau est réimprimé avec l’autorisation de30

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

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