Name: embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00
Duration: 5 min 59 s
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Diese Arbeit wurde teilweise durch UCSD-Startup-Fonds unterstützt, die an O.S.A. gerichtet waren.

1. C. quinquefasciatus Kolonieaufzucht
<ol><li>Richten Sie mehrere Kolonien von C. quinquefasciatus-Erwachsenen in Käfigen von Insektenschlafsälen ein. HINWEIS: Die Kolonien wurden von Dr. Laura Harrington an der Cornell University20zur Verfügung gestellt. Detaillierte Protokolle für die Aufzucht von Culex-Moskitos finden Sie in anderer Literatur21.<ol>
<li>Halten Sie die Moskitos bei 25 ± 1 ° C bei 30% Luftfeuchtigkeit mit einem Tag:Nacht-Zyklus von 12:12 h.</li>
		<li>20% ige Zuckerlösung ad libitum bereitstellen, indem Sie einen Zuckerlösungsbehälter mit einem Docht in den Käfig einführen oder Wattebällchen mit der Zuckerlösung sättigen und in den Käfig legen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie Moskitos sich mindestens 3 Tage vor der Blutfütterung paaren (Abbildung 2A).</li>
</ol>2. Sammlung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium
<ol><li>Nach 3-6 Tagen nach der Eklosion den Weibchen 1-2 ml eines citrierten Rinderblutmehls durch eine synthetische Membran zuführen und in einem Blutfütterungssystem auf ca. 40 °C erhitzt werden (Abbildung 2B). Es gibt auch alternative Blutfütterungsprotokolle, die für Culex-Moskitos verwendet werden können (z. B. siehe Referenz21). HINWEIS: C. quinquefasciatus ist bekannt für eine Vorliebe für Vogelblut. Einige Labore verwenden betäubte lebende Vögel oder Vogelblut für ihre Blutmahlzeitquelle21,22,23. Kolonien können jedoch trainiert / ausgewählt werden, um sich von Rinderblut oder kleinen Nagetieren zu ernähren, wenn dieses Merkmal über mehrere Generationen hinweg ausgewählt wird.<ol>
<li>Lassen Sie die Weibchen mindestens 3 Tage nach der Blutfütterung ruhen, um sich einer Oogenese und Eireifung zu unterziehen, bevor sie die Eiablage für Mikroinjektionsexperimente induzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen Sie am Tag der embryonalen Mikroinjektionen einen Eiablagebecher mit organisch infundiertem Eiablagewasser. Eiablagewasser sollte durch Fermentieren von Kaninchenkot (50 g / L), Zersetzen von Gras (4,5 g / L) oder Fischfutter (25 g / L) in Wasser im Laufe von 5 oder mehr Tagen24,25hergestellt werden.</li>
	<li>Legen Sie den Eiablagebecher in den Käfig und stellen Sie den gesamten Käfig an einen dunklen Ort (Abbildung 2C).</li>
	<li>Überprüfen Sie den Becher alle 30 Minuten auf Eierflöße.<ol>
<li>Wenn Eierflöße vorhanden sind, sammeln Sie die Flöße, indem Sie sie mit einem Pinsel schaufeln und auf ein nasses Filterpapier legen (Abbildung 2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ausrichtung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium
<ol><li>Trennen Sie die Eier von den Flößen, indem Sie auf das Floß drücken und die Eier einzeln mit einem feinen Pinsel und einer Zette auseinander necken (Abbildung 2E).</li>
	<li>Richten Sie einzelne Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, der über die Oberseite eines Glasobjektträgers gelegt wird (Abbildung 2F).</li>
	<li>Versuchen Sie beim Ausrichten, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu richten, um die Zugänglichkeit zu erleichtern. HINWEIS: Eine alternative Methode zur Ausrichtung der Eizellen ohne doppelseitiges Klebeband finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Nasonia vitripennis Embryo-Mikroinjektionsprotokoll26.</li>
	<li>Eier mit der Halogenkohlenstoffölmischung abdecken. HINWEIS: Die Halocarbon-Mischung kann im Voraus hergestellt werden, indem zwei Halogenkohlenstoffreagenzien und Wasser (9:1:20, Halogenkohlenstoff 700: Halogenkohlenstoff 27: Reinstwasser) sanft gemischt und dann über Nacht bei 25οC inkubiert wird, um die Wassersättigung des Halogenkohlenwasserstofföls zu erleichtern.</li>
</ol>4. Nadelvorbereitung für Mikroinjektionen
<ol><li>Erzeugen Sie die Aluminosilikatkapillarglasnadeln mit einem Glasmikropipettenzieher.<ol>
<li>Legen Sie ein Aluminosilikatkapillarglas in einen Nadelzieher, gemäß den Anweisungen aus der Bedienungsanleitung des Nadelziehers. HINWEIS: Quarz- und Borosilikatkapillarnadeln können ebenfalls verwendet werden, aber für dieses Experiment wird Aluminosilikat wegen seiner relativen Erschwinglichkeit und Haltbarkeit bevorzugt.</li>
		<li>Stellen Sie Heat auf 516, Velocity auf 100, Delay auf 70, Pull auf 97 und Pressure auf 500 am Nadelzieher ein.</li>
		<li>Aktivieren Sie den Nadelzieher gemäß den Anweisungen des Abziehers und wiederholen Sie ihn nach Bedarf für zusätzliche Nadeln. HINWEIS: Während des Injektionsprozesses werden Nadeln oft verstopft oder versehentlich gebrochen, daher wird dringend empfohlen, zusätzliche Nadeln für ein einzelnes Experiment zu ziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichten Sie die Nadelspitze, indem Sie die Spitze der gezogenen Nadel auf der rotierenden Diamantschleifplatte vorsichtig berühren, für ca. 10 s in einem Winkel von 50°. HINWEIS: Wenn Sie die Nadel anfassen, wird sie geöffnet, damit Flüssigkeit durchfließen kann, während gleichzeitig eine schärfere Spitze für ein leichteres Eindringen in den Embryo entsteht. Ein Beispiel für eine richtige Nadel kann in einem früheren Artikel26gesehen werden.</li>
	<li>Lagern Sie gezogene und abgeschränkte Nadeln, indem Sie sie in Linien aus Modellierton in einer Petrischale einbetten. HINWEIS: Um die beste Qualität für Nadelspitzen zu gewährleisten, sollten Nadeln so nah wie möglich am Zeitpunkt der Injektion frisch gezogen und abgeschrächt werden.</li>
</ol>5. Einlegen des Injektionsgemisches
<ol><li>Bereiten Sie die Injektionsmischung aus Genommodifikationsreagenzien (z. B. 200 ng / μL sgRNA und 200 ng / μL Cas9-Mischung) oder bevorzugten Injektionslösungen vor und halten Sie sie auf Eis. HINWEIS: Diese Mischung kann zubereitet werden, während auf die Eizellen gewartet wird. Weitere Details zur Cas9- und sgRNA-Produktion und -Vorbereitung für die Mikroinjektion finden Sie in früheren Publikationen27,28,29,30.</li>
	<li>Laden Sie 2 μL Injektionsmischung mit einer Mikroladerspitze in die Injektionsnadel.</li>
</ol>6. Mikroinjektion eingerichtet
<ol><li>Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist.</li>
	<li>Legen Sie den Glasträger mit den ausgerichteten Eiern auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops.</li>
	<li>Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und dem zusammengesetzten Mikroskop so aus, dass sie in einem Winkel von 25-35 ° auf das hintere Ende des Embryos zielt.</li>
</ol>7. Mikroinjektion des Embryos (Abbildung 2G)
<ol><li>Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung mit einer Menge von etwa 10% des Volumens des Embryos (700-800 pL abhängig von der Größe der Eier). HINWEIS: Bei der Injektion sollte das Ei leicht anschwellen, aber wenn zu viel Flüssigkeit injiziert wird, können Eier platzen oder zytoplasmatische Flüssigkeit kann austreten.</li>
	<li>Injizieren Sie etwa 20 Eier gleichzeitig, stoppen Sie dann und führen Sie Embryo-Genesungsverfahren durch. HINWEIS: Während der Injektion besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Nadeln entweder verstopfen oder brechen. Wenn ein Verstopfung auftritt, der durch einen Mangel an Injektionsflüssigkeit, die durch die Nadel fließt, festgestellt werden kann, versuchen Sie entweder, die Nadel mit der Reinigungsfunktion des elektronischen Mikroinjektors zu reinigen oder versuchen Sie, die Nadel neu zu entränken. Wenn keiner der beiden Schritte funktioniert, wechseln Sie schnell zu einer neuen Nadel und stellen Sie sicher, dass die vorbereiteten Eier feucht bleiben.</li>
</ol>8. Embryonenentstehung und Schlüpfen
<ol><li>Lassen Sie die Eier mindestens 5 Minuten ungestört. Entfernen Sie das Halogenkohlenwasserstofföl innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig, indem Sie es leicht mit einem sauberen Pinsel bürsten(Abbildung 2H).</li>
	<li>Heben Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse doppelt destilliertes Wasser (Abbildung 2I). Achten Sie darauf, die Eier auf der Wasseroberfläche zu halten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Eier täglich für 7 Tage auf Schlüpfen (Abbildung 2J).</li>
	<li>Befolgen Sie die normalen Larvenaufzuchtverfahren21.</li>
</ol>9. Screening auf Genomveränderung
<ol><li>Screenen Sie die injizierten Moskitos mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen (Abbildung 2K).<ol>
<li>Verifizierung von Mutationen, die keinen leicht erkennbaren Phänotyp aufweisen, durch PCR-Amplifikation, T7-Endonuklease-I-Assay und Sequenzierung durch Subklonierung der Zielregion31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie zusätzliche Kreuzungen zwischen injizierten Individuen ein, um vererbbare Mutationen innerhalb der Keimbahn zu erkennen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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Mit den jüngsten Bemühungen, gentechnisch veränderte Werkzeuge für die Kontrolle von Mückenvektoren zu entwickeln, besteht die Notwendigkeit, Embryo-Mikroinjektionsprotokolle für häufige Mückenkrankheitsvektoren zu entwickeln und zu optimieren. Obwohl Methoden für Aedes- und Anopheles-Moskitos entwickelt wurden, wurde ein speziell für Culex entwickeltes Protokoll minimal erforscht. Im Allgemeinen können die Injektionsprotokolle für Moskito-Embryonen in 3 allgemeine Schritte unterteilt werden: 1) Embryo-Entnahme und -Vorbereitung, 2) Embryo-Injektion und 3) Wiederherstellung nach der Injektion. Um erfolgreich Mutanten zu erzeugen, müssen alle drei Schritte für die Zielspezies optimiert werden. Dieses modifizierte Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen ist spezifisch für das erfolgreiche Genom-Engineering von Culex-Moskitos.
Die Maximierung der Embryonentnahme ist ein häufiger Engpass bei Mikroinjektionsprotokollen für Embryonen. Um die Anzahl der in kurzer Zeit gesammelten Eier zu erhöhen, wurden Moskitos für 2-3 Tage nach der Blutmahlzeit von einem Eiablagesubstrat eingeschränkt. Es ist wichtig zu beachten, dass C. quinquefasciatus dazu neigt, Vogelblutquellen im Gegensatz zu Säugetierquellen oder Membranfütterung mit Säugetierblut zu bevorzugen. Viele Forscher haben jedoch Schwierigkeiten, eine zuverlässige Quelle für lebende Vögel oder Vogelblut für die Blutfütterung zu erhalten, so dass Laborbestände angepasst werden können, um sich von leichter zugänglichen Blutquellen zu ernähren. Es ist auch wichtig, nährstoffreiches Wasser für das Eiablagesubstrat zu verwenden, da es Eiablagehinweise für C. quinquefasciatus und die meisten anderen Culex-Vektoren liefert. Es gibt viele Methoden, um nährstoffreiches Wasser zu erzeugen, das möglicherweise zwischen den Laboren optimiert werden muss, um sicherzustellen, dass eine angemessene Anzahl von Eiern für die Mikroinjektion zur Verfügung steht. Während diese Methode beispielsweise bei Kaninchenkot, der 5 oder mehr Tage lang in entionisiertem Wasser fermentiert wurde, am erfolgreichsten war, haben andere Forscher mehr Erfolg mit Gras- oder Fischfutter als Nährstoffquelle und einige sogar mit destilliertem Wasser21.
Da Culex-Moskitos Gruppen von Eiern in Flößen legen, ist das Sammeln von Eiern ziemlich einfach. Eier können einfach gesammelt werden, indem das gesamte Floß mit einem Pinsel geschöpft wird. Die Trennung der Eier ist komplizierter, aber für eine erfolgreiche Injektion unerlässlich. Eier können vorsichtig vom Floß getrennt werden, indem mit Pinsel oder Sparzette sanfter Abwärtsdruck zwischen den Eiern ausgeübt wird. Mit etwas Übung waren mehrere Benutzer zuverlässig in der Lage, einzelne Eier von Eierflößen zu trennen. Nach dem Trennen jedes Eies werden die Eier in der gleichen Ausrichtung auf doppelseitigem Klebeband ausgerichtet, das die Eier während der Mikroinjektion stabilisiert. Eier werden in das sich verjüngende hintere Ende injiziert und die Zugabe von Halogenkohlenstofföl hält die Eier während der Manipulation feucht.
Um Embryoschäden während der Mikroinjektion zu begrenzen, müssen Injektionsnadeln von angemessener Stärke sein und in einem geeigneten Winkel abgeschrägt sein. Aluminosilikatnadeln, die 10 Sekunden lang in einem Winkel von 50 ° abgeschrächt wurden, hatten die besten Ergebnisse, aber auch Borosilikat- und Quarznadeln können funktionieren, obwohl sie weniger haltbar und teurer sein können. Darüber hinaus erleichtert die richtige Nadelfass einen besseren Fluss der Cas9- und sgRNA-Mischungen und schafft einen schärferen Punkt für ein leichteres Eindringen in den Embryo. In vielen Fällen ist das Abfasen auch eine effiziente Möglichkeit, verstopfte Nadeln schnell zu reparieren, anstatt Zeit und Mühe damit zu verbringen, verstopfte Nadeln zu ersetzen.
Nach der Injektion sollten die Eier mindestens 5 Minuten ungestört bleiben, wobei das Halogenkohlenstofföl unmittelbar danach durch sanftes Abbürsten mit einem sauberen Pinsel entfernt werden sollte. Nach dem Entfernen des Halogenkohlenwasserstofföls können die injizierten Eier zum Schlüpfen in Wasser gelegt werden, was typischerweise innerhalb von 3 Tagen nach der Injektion geschieht. Mit Übung und ausreichender Anzahl von Eiern kann dieses Protokoll konsistente somatische und Keimbahnmutationen bei C. quinquefasciatus erreichen und ist vielseitig genug, dass es leicht an andere Culex-Moskitos angepasst werden kann.

C. quinquefasciatus, allgemein bekannt als die südliche Hausmücke, ist ein kompetenter Vektor zahlreicher Krankheitserreger, darunter West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, Saint Louis-Enzephalitis und Östliche Pferdeenzephalitis. Insbesondere seit seiner ersten Erkennung in New York im Jahr 1999 hat sich WNV zu einer der wichtigsten vektorübertragenen Krankheiten in den kontinentalen Vereinigten Staaten (USA) entwickelt, mit über 50.000 gemeldeten menschlichen Fällen, die zwischen 1999 und 2018 zu rund 2.300 Todesfällenführten 1 sowie über 4.500 gemeldeten Pferdefällen zwischen 2008 und 20192. Darüber hinaus sind mindestens 23 in Nordamerika vorkommende Vogelarten von WNV-Infektionen betroffen, wobei mindestens 12 Arten aufgrund von WNV3als unwiederbringlich eingestuft wurden. Die Auswirkungen von WNV auf Menschliche, Pferde- und Vogelpopulationen sind auf das opportunistische Fressverhalten seiner Vektoren zurückzuführen. Typischerweise sind Vögel die primären Wirte für WNV, und Menschen und Pferde sind zufällige oder Sackgassenwirte. Einige von C. quinquefasciatus vektorisierten Krankheitserreger infizieren nur Vögel wie den Vogelmalariaparasiten Plasmodium relictum. In Hawaii ist C. quinquefasciatus ein Hauptvektor der Vogelmalaria und hat das Aussterben vieler einheimischer Vogelarten verursacht4,5.
Um Krankheiten zu kontrollieren, die von C. quinquefasciatusübertragen werden, haben Forscher und Vektorkontrollbehörden häufig etablierte Instrumente zur Kontrolle der Mückenpopulation wie die Anwendung von Insektiziden6verwendet, diese Methoden sind jedoch kostspielig, nicht artspezifisch und haben eine begrenzte Wirksamkeit, da die Resistenz gegen Insektizide in vielen C. quinquefasciatus-Populationen hoch ist6,7,8,9. Andere Kontrolltechniken, wie Wolbachia-basiertePopulationskontrollstrategien, wurden in den letzten Jahrenentwickelt 10,11, aber die mit wolbachia-Infektion verbundenen Fitnesskosten begrenzen die Machbarkeit dieses Ansatzes für diesen Vektor12. Es gibt auch genetisch basierte Bekämpfungsmethoden, die bei anderen Mückenarten wie Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 und Anopheles stephensi16 entwickelt wurden , einschließlich der Entwicklung von pathogenresistenten Moskitos17,18,19, die auch für C. quinquefasciatus entwickelt werden könnten, wenn die erforderlichen Genom-Engineering-Werkzeuge entwickelt für diese Art. Die Biologie von C. quinquefasciatus unterscheidet sich jedoch stark von anderen Aedes- und Anopheles-Mückenvektoren, was die Entwicklung ähnlicher genetischer Technologien in diesem Vektor erschwert hat. Mit dem Aufkommen von CRISPR-basierten Genom-Engineering-Technologien ist präzises Genome Engineering immer trivialer, erschwinglicher und anpassungsfähiger geworden und hat folglich zur Entwicklung neuartiger genetischer Werkzeuge in einer Vielzahl von Arten geführt.
Um Mutationen mit CRISPR-basierten Technologien zu erzeugen, wird eine Mischung aus Cas9-Protein und synthetischer Leit-RNA (sgRNA), die die gewünschten Loci ergänzt, in Embryonen im Präblastodermstadium mikroinjektiert. Da C. quinquefasciatus Weibchen ihre Eier in Gruppen ablegen, die in einer schwimmenden Floßstruktur befestigt sind (Abbildung 1), im Gegensatz zum Ovipositieren einzelner Eier, einem Merkmal von Aedes und Anopheles Moskitos, werden Embryo-Mikroinjektionen bei dieser Art zunehmend komplizierter. Culex-Larven treten auch von der vorderen Seite jedes Eies auf, die mit der Wasseroberfläche in Kontakt kommt (Abbildung 1), so dass die Eiorientierung nach der Manipulation bei dieser Art wichtig ist. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Cas9-Protein und sgRNA in C. quinquefasciatus-Embryonen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Merkmale zu berücksichtigen, die für die Culex-Biologie einzigartig sind, um das Überleben von Embryonen und die Genommutationsraten durch bestimmte Schritte zu verbessern, die für die rechtzeitige Eizellentnahme und das Überleben von Eizellen entscheidend sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus ist ein Vektor einer Vielzahl von vektorübertragenen Krankheiten wie Vogelmalaria, West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, östliche Pferdeenzephalitis, lymphatische Filariose und Saint Louis-Enzephalitis. Insbesondere vogelmalaria hat eine wichtige Rolle beim Aussterben zahlreicher endemischer Inselvogelarten gespielt, während WNV in den Vereinigten Staaten zu einer wichtigen vektorübertragenen Krankheit geworden ist. Um weitere Einblicke in die Biologie von C. quinquefasciatus zu erhalten und ihre genetische Kontroll-Toolbox zu erweitern, müssen wir effizientere und erschwinglichere Methoden für das Genome Engineering bei dieser Art entwickeln. Einige biologische Merkmale, die für Culex-Moskitos einzigartig sind, insbesondere ihre Eierflöße, haben es jedoch schwierig gemacht, Mikroinjektionsverfahren durchzuführen, die für das Genom-Engineering erforderlich sind. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein optimiertes Mikroinjektionsprotokoll für Embryonen entwickelt, das sich auf die Minderung der technischen Hindernisse konzentriert, die mit den einzigartigen Eigenschaften von Culex-Moskitos verbunden sind. Diese Verfahren zeigen optimierte Methoden für die Eizellentnahme, die Trennung von Eierfloßen und andere Handhabungsverfahren, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion bei C. quinquefasciatus unerlässlich sind. In Verbindung mit der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen uns diese Verfahren, ortsspezifische, effiziente und vererbbare Keimbahnmutationen zu erreichen, die erforderlich sind, um fortschrittliches Genom-Engineering durchzuführen und genetische Kontrolltechnologien in diesem wichtigen, aber derzeit noch nicht untersuchten Krankheitsvektor zu entwickeln.

In zuvor veröffentlichten Experimenten wurde diese Methode verwendet, um erfolgreich somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges, weiß (CPIJ005542)30 (Tabelle 1) kritisch ist. CRISPR/Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen der Puppenstufe von injizierten Personen (G0)bewertet. Somatische Mutationen waren im Allgemeinen als Mosaikphänotypen vorhanden, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen. Zum Beispiel führten somatische Mutationen des weißen Gens zu einer Mischung von Ommatidien mit Phänotypen, denen es an Pigmentierung mangelt, und solchen mit einem Wildtyp-pigmentierten Phänotyp30. Als es jedoch zu einer Keimbahnmutation des weißen Gens kam, erbte die nächste Generation (G1)den vollen weißäugige Phänotyp. Keimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik G0 Individuen und Scoring für vollständig weißäugige Nachkommen bestimmt (G1). Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64% bis 82% der Embryonen sowie zu einer somatischen Mutageneserate von 37% bis 57% und einer Keimbahnmutageneserate von >61% (Tabelle 1). Durch das Multiplexing von sgRNAs, um mehrere Loci im selben Gen anzusprechen, stiegen die mutageneseraten der somatischen und Keimbahnen auf bis zu 86% an (Tabelle 1). Darüber hinaus werden seit vielen Generationen lebensfähige homozygote Bestände der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Abbildung 1: C. quinquefasciatus Eierfloß und Einzeleimorphologie. Dorsale (A), laterale (B) und ventrale (C) Ansichten von C quinquefasciatus Eierflößen. C. quinquefasciatus Weibchen legen ihre Eier mit der bauchigeren vorderen Seite, die die Wasseroberfläche berührt, während die spitzere hintere Seite von der Wasseroberfläche entfernt ist (D). A- anterior; P- posterior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Zeitleiste für die Schaffung von C. quinquefasciatus-Mutanten durch Mikroinjektion. Zeitleiste der Vorbereitung der C. quinquefasciatus-Kolonie und der Embryonentnahme für die Mikroinjektion (A-D). Gesammelte Eier werden dann getrennt (E) in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet und mit Halogenkohlenstofföl (F) bedeckt. Die Eier werden dann injiziert (G) und mindestens 5 Minuten ruhen gelassen, bevor das Halogenkohlenstofföl (H) entfernt wird. Die Eier werden dann zum Schlüpfen in eine reinen Wasserquelle (I)überführt und auf mutierte Phänotypen ( K )untersucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Überleben</td>
			<td colspan="3">Somatischer Mosaikismus (G0)</td>
			<td>Keimbahnmutagenese (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Insgesamt (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Insgesamt (%)</td>
			<td>G1 Mutanten (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Überlebens- und Mutationsraten von Embryonen, die mit einzelnen und multiplexierten gRNAs injiziert wurden, die auf Weiße abzielen. Die Tabelle wird mit Genehmigung von30 nachgedruckt

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