Name: embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

이 작품은 O.S.A.로 향하는 UCSD 스타트업 펀드에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. C. 퀸케파시아투스 식민지 사육
<ol><li>버그 기숙사 케이지에 C. 퀸케파시아투스 성인의 여러 식민지를 설정합니다. 참고 : 식민지는 코넬 대학에서 박사 로라 해링턴에 의해 제공되었다20. 컬렉스 모기를 사육하기 위한 상세한 프로토콜은 다른문헌(21)에서찾을 수 있다.<ol>
<li>12:12 시간 :야간 주기와 30 %의 습도에서 25 ± 1 °C에서 모기를 유지합니다.</li>
		<li>케이지에 심지와 설탕 용액 용기를 도입하거나 설탕 용액으로 면공을 포화시켜 20% 설탕 용액 광고 리비툼을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모기가 혈액 공급 전에 적어도 3 일 동안 짝짓기를 허용(그림 2A).</li>
</ol>2. C. 퀸케파시아투스 전 분담 단계 배아의 수집
<ol><li>3-6일 후 백과사전 후, 합성 막을 통해 구형 소 혈액식의 1-2mL을 여성에게 제공하고 혈액 공급 시스템에서 약 40°C로 가열한다(도2B). 컬렉스 모기에 사용할 수 있는 대체 혈액 공급 프로토콜도 있습니다(예: 참조 참조21). 참고: C. 퀸케파시아투스는 조류 혈액을 선호하는 것으로 알려져 있습니다. 일부 실험실은 혈액 식사 소스21,22,23에대한 마취 라이브 조류 또는 조류혈액을사용합니다. 그러나 이 기능이 여러 세대에 걸쳐 선택되면 소 혈액이나 작은 설치류를 먹도록 식민지를 훈련/선택할 수 있습니다.<ol>
<li>여성이 혈액 공급 후 최소 3 일 동안 휴식을 허용하여 미세 주입 실험에 대한 oviposition을 유도하기 전에 oogenesis 및 계란 성숙을 겪게됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 미세 주입의 날에, 유기적으로 주입 된 oviposition 물와 oviposition 컵을 만들. oviposition 물은 토끼 대변 (50 g/L), 분해 잔디 (4.5 g/L), 또는 물고기 음식 (25 g/L)을 5 일 이상 동안 물에서 발효하여 만들어야한다24,25.</li>
	<li>oviposition 컵을 케이지에 넣고 전체 케이지를 어두운 위치(그림 2C)에놓습니다.</li>
	<li>30분마다 달걀 뗏목을 마시러 컵을 확인하세요.<ol>
<li>달걀 뗏목이 있는 경우 페인트 브러시로 뗏목을 수거하여 젖은 필터 용지에 놓습니다(그림2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. 퀸케파시아투스 전 분비전 배아의 정렬
<ol><li>뗏목을 누르고 잘게 다듬은 페인트 브러시와 집게(그림 2E)를사용하여 개별적으로 계란을 따로 뗏목에서 계란을 분리합니다.</li>
	<li>유리슬라이드(그림 2F)의상단에 배치된 양면 스티커 테이프의 얇은 스트립에 개별 계란을 정렬합니다.</li>
	<li>정렬하는 동안, 쉽게 접근성을 위해 동일한 방향으로 각 계란의 전방 측면을 가리킬 수 있습니다. 참고: 양면 스티커 테이프가 없는 대체 계란 정렬 방법은 이전에 발표된 나소니아 vitripennis 태아 미세 주입프로토콜(26)에서찾을 수 있다.</li>
	<li>할로카본 오일 믹스로 달걀을 덮습니다. 참고: 할로카본 믹스는 두 개의 할로카본 시약과 물(9:1:20, 할로카본 700 : 할로카본 27 : 초순수 수)를 부드럽게 혼합한 다음 할로카본 오일의 수포화를 용이하게 하기 위해 25°C에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양함으로써 미리 준비할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 미세 주입을위한 바늘 준비
<ol><li>유리 마이크로피펫 풀러를 사용하여 알루미노실리케이트 모세관 유리 바늘을 생성합니다.<ol>
<li>바늘 풀러의 사용자 설명서의 지침에 따라 알루미노실리케이트 모세관 유리를 바늘 풀러에 넣습니다. 참고: 석영과 보로실리케이트 모세관 바늘도 사용할 수 있지만, 이 실험을 위해 알루미노실리케이트는 상대적인 경제성과 내구성 때문에 선호됩니다.</li>
		<li>열을 516으로 설정하고, 속도는 100으로, 70으로 지연하고, 97로 당기고, 바늘 풀러에 500으로 압력을 가합니다.</li>
		<li>풀러의 지시에 따라 바늘 풀러를 활성화하고 추가 바늘에 필요한 대로 반복합니다. 참고: 주입 과정에서 바늘이 막히거나 실수로 파손되기 때문에 단일 실험을 위해 추가 바늘을 당기는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50° 각도에서 회전 다이아몬드 연마판에 당겨진 바늘 끝을 부드럽게 터치하여 바늘 끝을 구부립니다. 참고: 바늘을 베벨링하면 유체가 흐를 수 있도록 하는 동시에 배아로 쉽게 침투할 수 있는 선명한 팁을 만듭니다. 적절한 바늘의 예는 이전 제에서 볼 수 있습니다26.</li>
	<li>페트리 접시에 모델러의 점토 라인에 담아 바늘을 뽑아 서 보관하십시오. 참고: 바늘 팁에 대 한 최고의 품질을 보장 하기 위해, 바늘 은 신선 하 게 당겨 하 고 가능한 한 주입의 시간에 가까운 beveled 해야 합니다.</li>
</ol>5. 사출 혼합물을 적재
<ol><li>게놈 변형 시약(예를 들어, 200 ng/μL sgRNA 및 200 ng/μL Cas9 혼합물)으로 구성된 사출 혼합물을 준비하거나 선호하는 사출 용액을 얼음위에 보관한다. 참고 : 이 믹스는 계란이 놓일 때까지 기다리는 동안 준비 될 수 있습니다. Cas9 및 sgRNA 생산 및 미세 주입에 대한 준비에 대한 자세한 내용은 이전 간행물27,28,29,30에서확인할 수 있다.</li>
	<li>마이크로 로더 팁을 사용하여 주입 바늘에 주입 혼합물 2 μL을 적재합니다.</li>
</ol>6. 미세 주입 설정
<ol><li>전자 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 조작기 설정에 채워진 주입 바늘을 놓습니다.</li>
	<li>복합 현미경의 단계에 정렬 된 계란을 포함하는 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>미세 조작기 및 복합 현미경을 사용하여 바늘을 정렬하여 25-35 ° 각도로 배아의 후방 끝을 목표로합니다.</li>
</ol>7. 배아 미세 주입(그림 2G)
<ol><li>조심스럽게 배아에 바늘을 삽입하고 배아의 부피의 약 10 %의 양으로 혼합물을 주입 (계란의 크기에 따라 700-800 pL). 참고: 주입 할 때, 계란은 약간 팽창해야하지만, 너무 많은 액체가 주입되는 경우, 계란이 파열 될 수 있습니다, 또는 세포질 액체가 누출 될 수 있습니다.</li>
	<li>한 번에 약 20개의 알을 주입한 다음 중단하고 배아 회복 절차를 수행합니다. 참고 : 주입하는 동안, 나막히거나 휴식 바늘의 높은 기회가있다. 바늘을 통해 흐르는 주입 유체의 부족에 의해 결정 될 수있는 나막이가 발생하는 경우, 전자 마이크로 인젝터에 깨끗한 기능으로 바늘을 청소하거나 바늘을 재veveling시도. 두 단계 모두 작동하지 않으면 준비된 계란이 촉촉하게 유지되도록하면서 새 바늘로 빠르게 변경하십시오.</li>
</ol>8. 배아 회복 및 부화
<ol><li>계란을 5분 이상 방해받지 않고 둡니다. 주입 후 20분 이내에 깨끗한 페인트브러시(그림 2H)로가볍게 칫솔질을 하여 할로카본 오일을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>페인트 브러시를 사용하여 계란을 부드럽게 들어 올려 두 번 증류된 물 한 잔에 넣습니다(그림2I). 수면에 알을 보관하십시오.</li>
	<li>부화(그림 2J)에대한 7 일 동안 매일 계란을 확인합니다.</li>
	<li>정상적인 애벌레 양육절차(21)를따르십시오.</li>
</ol>9. 게놈 수정을 위한 검열
<ol><li>스테레오스코프(도2K)를사용하여 돌연변이 표현형을 위해 주입된 모기를 선별한다.<ol>
<li>쉽게 인식할 수 있는 표현형이 없는 돌연변이를 검증하고, PCR 증폭, T7 엔도누클레스 I 분석, 및 표적영역(31)의서브클링에 의한 시퀀싱에 의해 서열된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발아성 내의 유전성 돌연변이를 검출하기 위하여 주입된 개별 사이 추가 십자가를 설치합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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모기 벡터 제어를 위한 유전자 조작된 공구를 생성하기 위한 최근 노력으로, 일반적인 모기 질병 벡터를 위한 배아 미세 주입 프로토콜을 개발하고 최적화할 필요가 있습니다. Aedes와 Anopheles 모기를 위해 방법이 개발되었지만 Culex를 위해 특별히 설계된 프로토콜은 최소한으로 탐구되었습니다. 일반적으로 모기 배아 주입 프로토콜은 3가지 일반적인 단계로 나눌 수 있다: 1) 배아 수집 및 준비, 2) 배아 주입, 및 3) 후 주사 회복. 돌연변이를 성공적으로 생성하려면 세 단계 모두 대상 종에 최적화되어야 합니다. 배아 미세 주입을 위한 이 수정된 프로토콜은 Culex 모기의 성공적인 게놈 공학을 위해 특정합니다.
배아 수집을 극대화하는 것은 배아 미세 주입 프로토콜에서 일반적인 병목 현상입니다. 단기간에 수집된 계란의 수를 늘리기 위해 모기는 혈액 식사 후 2-3일 동안 oviposition 기판에서 제한되었다. C. 퀸케파시아투스는 포유류 의 근원 또는 포유류 혈액으로 수유하는 막반대로 조류 혈액 원을 선호하는 경향이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 그러나, 많은 연구원은 혈액 공급에 대 한 라이브 조류 또는 조류 혈액의 신뢰할 수 있는 소스를 취득 하는 어려움, 그래서 실험실 주식 더 접근 가능한 혈액 소스에 피드에 적응 될 수 있습니다. 또한 C. 퀸케파시아투스 및 대부분의 다른 컬렉스 벡터에 대한 oviposition 신호를 제공하기 때문에 배강기기류에 영양이 풍부한 물을 사용하는 것도 중요합니다. 영양이 풍부한 물을 생성하는 많은 방법이 있으며, 미세 주입을 위해 적절한 수의 계란을 보장하기 위해 실험실 간에 최적화해야 할 수도 있습니다. 예를 들어,이 방법은 5 일 이상 탈온 화 된 물에 발효 토끼 대변으로 가장 성공적이었지만, 다른 연구자들은 영양 공급원으로 잔디 또는 생선 음식과 더 많은 성공을 거두었으며 일부는증류수(21)로도더 많이 성공했습니다.
컬렉스 모기가 뗏목에 계란을 낳기 때문에 계란을 수집하는 것은 매우 간단합니다. 달걀은 페인트 브러시로 뗏목 전체를 스푸핑하여 수집할 수 있습니다. 계란 분리는 더 복잡하지만 성공적인 주입에 필수적입니다. 달걀은 페인트 브러시 또는 집게로 달걀 사이에 부드러운 하방 압력을 가하여 뗏목에서 조심스럽게 분리 할 수 있습니다. 몇 가지 연습으로, 여러 사용자가 안정적으로 계란 뗏목에서 단일 계란을 분리 할 수 있었다. 각 계란을 분리한 후, 계란은 양면 끈적끈적한 테이프에 동일한 방향으로 정렬되어 미세 주입 중에 계란을 안정시킵니다. 계란은 테이퍼 후방 끝에 주입되고 할로카본 오일을 첨가하면 조작 중에 계란을 촉촉하게 유지합니다.
미세 주입 중 배아 손상을 제한하려면 주사 바늘이 적절한 강도여야하며 적절한 각도로 베브해야합니다. 50° 각도에서 10초 동안 구겨진 알루미노실리케이트 바늘은 최상의 결과를 보였지만, 보로실리케이트와 석영 바늘은 내구성이 낮고 더 비싸더라도 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 적절한 바늘 베벨링은 Cas9 및 sgRNA 혼합물의 더 나은 흐름을 용이하게하고 배아로 쉽게 침투할 수 있도록 선명한 지점을 만듭니다. 많은 경우에, beveling신속 하 게 막힌 된 바늘을 대체 하는 시간과 노력을 지출 하는 대신 막힌 된 바늘을 해결 하는 효율적인 방법.
주입 후, 계란은 깨끗한 페인트 브러시로 부드럽게 닦아 할로카본 오일이 즉시 제거되는 동안 적어도 5 분 동안 방해받지 않도록 유지해야합니다. 할로카본 오일을 제거한 후 주입된 계란을 물에 배치하여 부화할 수 있으며, 이는 일반적으로 주입 후 3일 이내에 발생합니다. 연습과 계란의 충분한 수로, 이 프로토콜은 C. quinquefasciatus에 있는 일관된 체세포 및 생식선 돌연변이를 달성할 수 있고 그밖 Culex 모기에 쉽게 적응할 수 있어야 할 충분히 다재다능합니다.

C. 퀸케파시아투스는일반적으로 남부 집 모기로 알려져 있으며, 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염 및 동부 말 뇌염을 포함한 수많은 병원균의 유능한 벡터입니다. 특히, 1999년 뉴욕에서 처음 발견된 이래, WNV는 미국 대륙 전역의 주요 벡터 매개 질병이 되었으며, 1999년과 2018년 사이에 약 2,300명의 사망자가 발생하고 2008-2019년 사이에 4,500건 이상의 말사례가보고되었습니다. 또한 북미에서 발견되는 최소 23종의 조류종은 WNV3의결과로 복구할 수 없는 것으로 분류된 최소 12종의 WNV 감염의 영향을 받았습니다. WNV가 인간, 말 및 조류 집단에 미치는 영향은 벡터의 기회적 공급 행동 때문입니다. 일반적으로 조류는 WNV의 주요 호스트이며 인간과 말은 부수적이거나 막다른 호스트입니다. C. quinquefasciatus에 의해 벡터된 몇몇 병원체는 조류 말라리아 기생충, Plasmodium 유물과같은 조류를 감염합니다. 하와이에서 C. 퀸케파시아투스는 조류 말라리아의 주요 벡터이며 많은 토착 조류 종4,5의멸종을 일으켰습니다.
C. quinquefasciatus에의해 전달되는 질병을 통제하기 위하여는, 연구원 및 벡터 통제 기관은 살충제 응용 프로그램 6과 같은 일반적으로 확립된 모기 인구 통제 공구를 이용했습니다6,그러나, 이러한 방법은 종 특정이 아닌 비용이 많이 들고, 많은 C. quinquefasciatus 인구6,7,8,9에서높은 살충제에 대한 저항이 높기 때문에 제한된 효과를 갖는다. Wolbachia-기반인구 통제 전략과 같은 다른 제어 기술은 최근10,11에서 개발되었지만, Wolbachia 감염과 관련된 피트니스 비용은 이벡터(12)에대한 이 접근법의 타당성을 제한한다. 또한 Aedes aegypti13, 14, 아노펠레스 감비아(15) 및 아노펠레스 스네이16과같은 다른 모기 종에서 개발된 유전자 기반 조절 방법이 있는데, 병원균 내성 모기17,18,19의개발을 포함하여, 재구성도구가 설계되는 경우 C. quinquefasciatus를 위해 개발될 수 있다. 이 종을 위해 개발. 그러나, C. quinquefasciatus 생물학은 이 벡터에서 유사한 유전 기술의 발달을 어렵게 만든 그밖 Aedes 및 Anopheles 모기 벡터와 크게 다릅니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링 기술이 등장하면서 정밀 게놈 엔지니어링은 점점 더 사소하고 저렴하며 적응력이 뛰어나므로 다양한 종에서 새로운 유전 적 도구가 개발되었습니다.
CRISPR 기반 기술로 돌연변이를 생성하기 위해, 원하는 loci에 보완되는 Cas9 단백질 및 합성 가이드 RNA(sgRNA)의 혼합물은 전 blastoderm 단계 배아로 마이크로인주사된다. C. quinquefasciatus 암컷이 떠다니는 뗏목구조(그림 1)에부착된 그룹으로 알을 낳기 때문에 개별 계란, Aedes 및 Anopheles 모기의 특성, 배아 미세 주사는 이 종에서 점점 더 복잡해지고 있습니다. 컬렉스 애벌레는 또한수면(도 1)과접촉하는 각 계란의 전방 측에서 나타나므로 난자 방향 사후 조작이 이 종에서 중요하다. 여기에서 우리는 C. quinquefasciatus 태아로 Cas9 단백질 및 sgRNA의 미세 주입을 위해 디자인된 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 적시에 계란 수집 및 계란 생존을 위한 열쇠인 특정 단계를 통해 배아 생존 및 게놈 돌연변이 비율을 향상하기 위하여 Culex 생물학에 유일한 특성을 수용하기 위하여 디자인되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

컬렉스 퀸케파시아투스는 조류 말라리아, 웨스트 나일 바이러스(WNV), 일본 뇌염, 동부 말 뇌염, 림프성 필라리아증 및 세인트 루이스 뇌염과 같은 다양한 벡터 매개 질병의 벡터입니다. 특히, 조류 말라리아는 수많은 풍토성 섬 조류 종의 멸종에 중요한 역할을하고있다, WNV는 미국에서 중요한 벡터 매개 질병이되고있다 동안. C. quinquefasciatus 생물학에 대한 추가 통찰력을 얻고 그들의 유전 통제 공구 상자를 확장하기 위하여, 우리는 이 종에 있는 게놈 공학을 위한 더 효율적이고 적당한 방법을 개발해야 합니다. 그러나, Culex 모기, 특히 그들의 계란 뗏목에 특유의 몇몇 생물학 특성은, 게놈 공학에 필요한 미세 주입 절차를 능력을 발휘하기 어렵게 만들었습니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 우리는 Culex 모기의 독특한 특성과 관련된 기술적 장애물을 완화하는 데 초점을 맞춘 최적화 된 배아 미세 주입 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 절차는 C. quinquefasciatus에서 성공적인 미세 주입에 필수적인 계란 수집, 달걀 뗏목 분리 및 기타 취급 절차에 최적화 된 방법을 보여줍니다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술과 결합될 때, 이 절차는 우리가 고급 게놈 공학을 수행하고 이 중요하지만 현재 연구되지 않는 질병 벡터에서 유전 통제 기술을 개발하는 데 필요한 사이트 특정, 효율적이고 유전성 생식선 돌연변이를 달성할 수 있게 합니다.

이전에 발표된 실험에서 이 방법은 어두운 안료의 발달에 중요한 유전자의 체세포 및 생식선 돌연변이를 성공적으로 생성하기 위해 사용되었다, 흰색 (CPIJ005542)30 (표 1). CRISPR/Cas9 생성된 체세포 돌연변이는 주입된 개별의 pupal 단계 눈에서 착색의 손실을 위한 검열에 의해 득점되었다 (G0). 체세포 돌연변이는 일반적으로 모든 세포가 돌연변이 표현형을 가지고 있지만 일부하지만 모조 표현형으로 존재하였다. 예를 들어, 백색 유전자의 체세포 돌연변이는 색소 침착이 결여된 표현형과 야생형 색소형 표현형30을가진 옴마티디아의 혼합물을 초래하였다. 그러나 백색 유전자의 생식선 돌연변이가 있었을 때, 그러나, 차세대(G1)는전체 백색 눈 표현형을 승계하였다. 생식선 돌연변이 율은 모자이크 G0 개인을 교차하고 완전히 흰색 눈 자손에 대한 점수 (G1)에의해 결정되었다. 이러한 실험으로 인해 64%에서 82%의 배아 생존율뿐만 아니라 37%에서 57%의 체세포 돌연변이 발생율 및 >61% 생식선 돌연변이 발생률(표1)을초래하였다. 동일한 유전자에서 다중 로시를 표적으로 하는 sgRNAs를 멀티플렉스함으로써, 체세포 및 생식선 돌연변이 발생률은 86%(표1)만큼상향 증가했다. 또한, 여러 세대에 걸쳐 백색 돌연변이의 가능한 동질주들이 실험실에 성공적으로 보관되어 왔습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> 그림 1: C. 퀸케파시아투스 달걀 뗏목과 단일 계란 형태. 도르살(A),측면(B),및 복부(C)C quinquefasciatus 계란 뗏목의 전망. C. 퀸케파시아투스 암컷은 수면을 더 구근 전방으로 만지는 구근 전방으로 알을 낳고,수면(D)에서더 뾰족한 후방을 가리킨다. A- 전방; P-후방이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> 그림 2: 미세 주입에 의한 C. 퀸케파시아투스 돌연변이를 만들기 위한 타임라인입니다. C. 퀸케파시아투스 식민지 제제 및 미세 주입을 위한 배아 수집의 타임라인(A-D). 수집된 계란은 동일한방향으로 정렬되고 할로카본오일(F)으로덮여 있습니다. 계란은 그 때 주입(G)할로탄소 오일(H)를제거하기 전에 최소 5 분 동안 휴식을 허용한다. 그런 다음 계란은 부화(J)를위해 깨끗한 수원(I)으로옮겨지고 돌연변이 표현형(K)을검사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">생존</td>
			<td colspan="3">체세포 모자이크 (G0)</td>
			<td>생식선 돌연변이 발생 (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>G1 돌연변이 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 백색을 표적으로 하는 단 하나 및 멀티플렉스 gRNA로 주입된 태아의 생존 그리고 돌연변이 비율. 테이블은30의 허가하에 다시 인쇄됩니다.

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

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Research

JoVE Journal

Genetics

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