Name: embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av UCSD-startfonder riktade till O.S.A.

1. C. quinquefasciatus koloni uppfödning
<ol><li>Ställ in flera kolonier av C. quinquefasciatus vuxna i bug dorm burar. Obs: Kolonierna tillhandahölls av Dr. Laura Harrington vid Cornell University20. Detaljerade protokoll för uppfödning av Culex myggor finns i annan litteratur21.<ol>
<li>Håll myggorna på 25 ± 1 °C vid 30% luftfuktighet med en 12:12 h dag: nattcykel.</li>
		<li>Ge 20% sockerlösning ad libitum genom att introducera en sockerlösningsbehållare med en veke i buret eller genom att mätta bomullsbollar med sockerlösningen och placera den i buret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Låt myggor para sig i minst 3 dagar före blodmatning (figur 2A).</li>
</ol>2. Insamling av C. quinquefasciatus embryon före blastodermstadiet
<ol><li>Efter 3-6 dagar efter eclosion, ge kvinnor 1-2 ml av en citraterad nötkreatur blodmjöl genom ett syntetiskt membran och uppvärmd till cirka 40 °C i ett blodmatningssystem (Figur 2B). Det finns också alternativa blodmatningsprotokoll som kan användas för Culex myggor (t.ex. se ref21). OBS: C. quinquefasciatus är känd för att föredra fågelblod. Vissa laboratorier använder bedövade levande fåglar eller fågelblod för sin blodmåltid källa21,22,23. Kolonier kan dock tränas/väljas för att mata på nötkreatursblod eller små gnagare om denna funktion väljs i över flera generationer.<ol>
<li>Låt kvinnor vila i minst 3 dagar efter blodmatning för att genomgå oogenes och äggmognad innan de inducerar oviposition för mikroinjektionsexperiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På dagen för embryonala mikroinjektioner, skapa en oviposition kopp med organiskt infunderad oviposition vatten. Oviposition vatten bör göras genom jäsning av kaninavföring (50 g/L), sönderdelning av gräs (4,5 g/L) eller fiskmat (25 g/L) i vatten under loppet av 5 eller flerdagar 24,25.</li>
	<li>Placera ovipositionskoppen i buret och placera hela buret på en mörk plats (Figur 2C).</li>
	<li>Efter var 30: e minut, kontrollera koppen för äggflottar.<ol>
<li>Om det finns äggflottar samlar du flottarna genom att skopa dem med en pensel och placera dem på ett våtfilterpapper(figur 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inriktning av C. quinquefasciatus embryon före blastodermstadiet
<ol><li>Separera äggen från flottarna genom att trycka ner flotten och reta isär äggen individuellt med en fin spetsfärgborste och tång (Figur 2E).</li>
	<li>Rikta in enskilda ägg på en tunn remsa av dubbelsidig klistertejp placerad över toppen av en glasrutschbana (Figur 2F).</li>
	<li>När du justerar, försök att peka den främre sidan av varje ägg i samma riktning för enklare tillgänglighet. OBS: En alternativ äggjusteringsmetod utan dubbelsidig klistertejp finns i ett tidigare publicerat Nasonia vitripennis embryo microinjection protocol26.</li>
	<li>Täck ägg med halokarbonoljablandningen. OBS: Halokarbonblandningen kan beredas i förväg genom att försiktigt blanda två halokarbonreagenser och vatten (9:1:20, halokarbon 700 : halokarbon 27 : Ultrapure vatten) och sedan inkubera blandningen över natten vid 25οC för att underlätta vattenmättnad av halokarbonoljan.</li>
</ol>4. Nålberedning för mikroinjektioner
<ol><li>Generera aluminosilikaten kapillärglasnålar med hjälp av en glasmikropipettedragare.<ol>
<li>Placera ett aluminiumoxidokilikat kapillärglas i en nåldragare, enligt instruktioner från nåldragarens bruksanvisning. OBS: Kvarts- och borosilikatkapällar kan också användas, men för detta experiment är aluminosilikat att föredra på grund av dess relativa överkomlighet och hållbarhet.</li>
		<li>Ställ in Värme på 516, Hastighet till 100, Fördröjning till 70, Dra till 97 och Tryck på 500 på nåldragaren.</li>
		<li>Aktivera nåldragaren enligt pullerns anvisningar och upprepa efter behov för ytterligare nålar. OBS: Under injektionsprocessen blir nålar ofta igensatta eller oavsiktligt trasiga, därför rekommenderas att dra ytterligare nålar för ett enda experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fasa nålspetsen genom att försiktigt vidröra spetsen på den dragna nålen på den roterande diamant slipplattan i cirka 10 s i 50° vinkel. OBS: Om du fasar nålen öppnas den så att vätska kan flöda igenom samtidigt som den skapar en skarpare spets för enklare penetration i embryot. Ett exempel på en riktig nål kan ses i en tidigare artikel26.</li>
	<li>Förvara dragna och fasade nålar genom att bädda in dem i linjer av modellerarens lera i en Petri-skål. OBS: För att säkerställa bästa kvalitet för nålspetsar bör nålar dras och fasas så nära injektionstiden som möjligt.</li>
</ol>5. Lastning av injektionsblandningen
<ol><li>Förbered injektionsblandningen bestående av reagenser för genommodifiering (t.ex. 200 ng/μL sgRNA och 200 ng/μL Cas9-blandning), eller föredragna injektionslösningar och håll den på is. OBS: Denna blandning kan förberedas i väntan på att ägg ska läggas. Mer information om Cas9 och sgRNA produktion och förberedelse för mikroinjektion finns i tidigare publikationer27,28,29,30.</li>
	<li>Ladda 2 μL injektionsblandning i injektionsnålen med hjälp av en mikrolastarspets.</li>
</ol>6. Mikroinjektion inrättad
<ol><li>Placera den fyllda injektionsnålen i en mikromanipulator som är kopplad till en elektronisk mikroinjektor.</li>
	<li>Placera glasglaset som innehåller de justerade äggen på scenen i ett sammansatt mikroskop.</li>
	<li>Använd mikromanipulatorn och det sammansatta mikroskopet och rikta nålen mot embryots bakre ände i 25-35° vinkel.</li>
</ol>7. Mikroinjektion av embryon(figur 2G)
<ol><li>Sätt försiktigt in nålen i embryot och injicera blandningen med en mängd av ca 10% av embryots volym (700-800 pL beroende på äggets storlek). OBS: Vid injektion bör ägget svälla något, men om för mycket vätska injiceras kan ägg brista eller cytoplasmisk vätska läcka ut.</li>
	<li>Injicera cirka 20 ägg åt gången och stoppa och utför embryoåtervinningsprocedurer. OBS: Vid injektion finns det stor risk för att nålar antingen täpper till eller går sönder. Om en täppa uppstår, vilket kan bestämmas av brist på injektionsvätska som strömmar genom nålen, försök att antingen rengöra nålen med den rena funktionen på den elektroniska mikroinjektorn eller prova att fasa om nålen. Om inget avstegen fungerar, byt snabbt till en ny nål samtidigt som du ser till att de beredda äggen förblir fuktade.</li>
</ol>8. Embryoåtervinning och kläckning
<ol><li>Lämna äggen ostört i minst 5 minuter. Inom 20 min efter injektionen, ta försiktigt bort halokarbonoljan genom att borsta lätt med en ren pensel (Figur 2H).</li>
	<li>Lyft äggen försiktigt med en pensel och lägg dem i en kopp dubbeldestillerat vatten (figur 2I). Var noga med att hålla äggen på vattenytan.</li>
	<li>Kontrollera äggen dagligen i 7 dagar för kläckning (Figur 2J).</li>
	<li>Följ normala larvuppfödningsprocedurer21.</li>
</ol>9. Screening för genommodifiering
<ol><li>Screena de injicerade myggorna för mutanta fenotyper med hjälp av ett stereoscope (Figur 2K).<ol>
<li>Verifiera mutationer som inte har en lätt igenkännlig fenotyp, genom PCR-förstärkning, T7 Endonuclease I-analys och sekvensering genom subkloning av målregionen31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ställ in ytterligare kors mellan injicerade individer för att upptäcka ärftliga mutationer i könscellen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Med de senaste ansträngningarna för att generera genetiskt konstruerade verktyg för myggvektorkontroll finns det ett behov av att utveckla och optimera embryomikroinjektionsprotokoll för vanliga myggsjukdomsvektorer. Även om metoder har utvecklats för Aedes och Anopheles myggor, har ett protokoll speciellt utformat för Culex undersökts minimalt. I allmänhet kan myggembryoninjektionsprotokoll delas in i 3 allmänna steg: 1) embryosamling och beredning, 2) embryoinjektion och 3) återhämtning efter injektion. För att framgångsrikt generera mutanter måste alla tre stegen optimeras för målarten. Detta modifierade protokoll för embryomikroinjektion är specifikt för framgångsrik genomteknik av Culex myggor.
Att maximera embryosamlingen är en vanlig flaskhals i embryomikroinjektionsprotokollen. För att öka antalet ägg som samlats in på kort tid begränsades myggor från ett ovipositionssubstrat i 2-3 dagar efter blodmjöl. Det är viktigt att notera att C. quinquefasciatus tenderar att föredra fågelblodkällor i motsats till däggdjurskällor eller membranmatning med däggdjursblod. Många forskare har dock svårt att förvärva en pålitlig källa till levande fågel eller fågelblod för blodmatning, så laboratorielager kan anpassas för att mata på mer tillgängliga blodkällor. Det är också viktigt att använda näringsrikt vatten för ovipositionssubstratet eftersom det ger ovipositionssignaler för C. quinquefasciatus och de flesta andra Culex-vektorer. Det finns många metoder för att generera näringsrikt vatten, som kan behöva optimeras mellan laboratorier för att säkerställa att ett lämpligt antal ägg finns tillgängliga för mikroinjektion. Till exempel, medan denna metod var den mest framgångsrika med kaninavföring fermenterad i avjoniserat vatten i 5 eller fler dagar, har andra forskare större framgång med gräs eller fiskmat som näringskälla och vissa även med destillerat vatten21.
Eftersom Culex myggor lägger grupper av ägg i flottar är insamling av ägg ganska enkelt. Ägg kan helt enkelt samlas in genom att skopa hela flotten med en pensel. Äggseparation är mer komplicerat, men viktigt för framgångsrik injektion. Ägg kan försiktigt separeras från flotten genom att applicera försiktigt nedåttryck mellan ägg med pensel eller tång. Med viss praxis kunde flera användare på ett tillförlitligt sätt separera enstaka ägg från äggflottar. Efter att ha separerat varje ägg justeras äggen i samma riktning på dubbelsidig klibbig tejp, vilket stabiliserar äggen under mikroinjektion. Ägg injiceras i den avsmalnande bakre änden och tillsats av halokarbonolja håller äggen fuktiga under manipulering.
För att begränsa embryoskadorna vid mikroinjektion måste injektionsnålarna vara av lämplig styrka och avfasas i lämplig vinkel. Aluminosilikatnålar som fasades i 10 sekunder i 50° vinkel hade de bästa resultaten, men borosilikat- och kvartsnålar kan också fungera, även om de kan vara mindre hållbara och dyrare. Dessutom underlättar korrekt nålfasning bättre flöde av Cas9- och sgRNA-blandningarna och skapar en skarpare punkt för enklare penetration i embryot. I många fall är avfasning också ett effektivt sätt att snabbt fixa igensatta nålar istället för att spendera tid och ansträngning för att ersätta igensatta nålar.
Efter injektionen ska äggen förbli ostörda i minst 5 minuter och halokarbonoljan avlägsnas omedelbart efteråt genom att försiktigt borsta bort den med en ren pensel. Efter avlägsnande av halokarbonoljan kan de injicerade äggen placeras i vatten för kläckning, vilket vanligtvis inträffar inom 3 dagar efter injektionen. Med övning och tillräckligt antal ägg kan detta protokoll uppnå konsekventa somatiska och könsceller mutationer i C. quinquefasciatus och är tillräckligt mångsidigt för att det enkelt ska kunna anpassas till andra Culex myggor.

C. quinquefasciatus, allmänt känd som den södra husmyggan, är en kompetent vektor av många patogener inklusive West Nile virus (WNV), japansk encefalit, Saint Louis encefalit och östra hästencefalit. Särskilt sedan det först upptäcktes i New York 1999 har WNV blivit en stor vektorburen sjukdom i hela kontinentala USA (USA) med över 50 000 rapporterade mänskliga fall som resulterar i cirka 2 300 dödsfall mellan 1999 och 20181 samt över 4 500 rapporterade hästfall mellan 2008-20192. Dessutom har minst 23 fågelarter som finns i Nordamerika påverkats av WNV-infektioner med minst 12 arter som klassificerats som oåterkalleliga till följd av WNV3. WNV: s inverkan på mänskliga, häst- och fågelpopulationer beror på vektorns opportunistiska utfodringsbeteende. Vanligtvis är fåglar de primära värdarna för WNV, och människor och hästar är tillfälliga eller återvändsgrändvärdar. Vissa patogener vektorerade av C. quinquefasciatus infekterar endast fåglar som fågel malariaparasiten, Plasmodium relictum. På Hawaii är C. quinquefasciatus en huvudvektor för fågel malaria och har orsakat utrotning av många inhemska fågelarter4,5.
För att kontrollera sjukdomar som överförs av C. quinquefasciatushar forskare och vektorkontrollbyråer använt allmänt etablerade myggpopulationskontrollverktyg som insekticidapplikation6, men dessa metoder är kostsamma, inte artspecifika och har begränsad effektivitet eftersom resistensen mot insekticider är hög hos många C. quinquefasciatuspopulationer 6,7,8,9. Andra kontrolltekniker, såsom Wolbachia-baseradebefolkningskontrollstrategier har utvecklats under de senasteåren 10,11, men fitnesskostnaderna i samband med Wolbachia-infektion begränsar genomförbarheten av detta tillvägagångssätt för denna vektor12. Det finns också genbaserade kontrollmetoder som har utvecklats hos andra myggarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 och Anopheles stephensi16, inklusive utveckling av patogenresistenta myggor17,18,19, som också kan utvecklas för C. quinquefasciatus om de rekvirerade genomteknikverktygen är utvecklats för denna art. C. quinquefasciatus biologi skiljer sig dock mycket från andra Aedes och Anopheles myggvektorer som har gjort utvecklingen av liknande genetisk teknik svår i denna vektor. Med tillkomsten av CRISPR-baserad genomteknik har exakt genomteknik blivit alltmer trivial, prisvärd och anpassningsbar och har därför lett till utveckling av nya genetiska verktyg i en mängd olika arter.
För att generera mutationer med CRISPR-baserad teknik, en blandning av Cas9 protein och syntetisk guide RNA (sgRNA), som kompletterar önskad lokus, mikroin injiceras i embryon före blastodermstadiet. Eftersom C. quinquefasciatus honor lägger sina ägg i grupper som är fästa i en flytande flottstruktur (Figur 1), i motsats till ovipositing enskilda ägg, en egenskap hos Aedes och Anopheles myggor, embryo mikroinjektioner blir alltmer komplicerade i denna art. Culex larver kommer också ut från den främre sidan av varje ägg, som är i kontakt med vattenytan (Figur 1), så äggorientering efter manipulering är viktigt i denna art. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll utformat för mikroinjektion av Cas9 protein och sgRNA i C. quinquefasciatus embryon. Detta protokoll har utformats för att tillgodose egenskaper som är unika för Culex biologi för att förbättra embryoöverlevnaden och genommutationshastigheterna genom vissa steg som är viktiga för kort äggsamling och äggöverlevnad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus är en vektor av ett varierat utbud av vektorburna sjukdomar som fågel malaria, West Nile virus (WNV), japansk encefalit, östra hästencefalit, lymfatisk filariasis och Saint Louis encefalit. Noterbart är att fågel malaria har spelat en viktig roll i utrotningen av många endemiska öfågelarter, medan WNV har blivit en viktig vektorburen sjukdom i USA. För att få ytterligare insikt i C. quinquefasciatus biologi och utöka deras verktygslåda för genetisk kontroll måste vi utveckla effektivare och billigare metoder för genomteknik i denna art. Vissa biologiska egenskaper som är unika för Culex myggor, särskilt deras äggflottar, har dock gjort det svårt att utföra mikroinjektionsförfaranden som krävs för genomteknik. För att möta dessa utmaningar har vi utvecklat ett optimerat embryomikroinjektionsprotokoll som fokuserar på att mildra de tekniska hindren i samband med de unika egenskaperna hos Culex myggor. Dessa förfaranden visar optimerade metoder för ägg insamling, ägg flotte separation och andra hantering förfaranden som är väsentliga för framgångsrika microinjection i C. quinquefasciatus. I kombination med CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik, gör dessa procedurer det möjligt för oss att uppnå platsspecifika, effektiva och ärftliga könsceller mutationer, som krävs för att utföra avancerad genomteknik och utveckla genkontrollteknik i denna viktiga, men för närvarande understudied, sjukdom vektor.

I tidigare publicerade experiment användes denna metod för att framgångsrikt generera somatiska och könsceller mutationer av en gen som är kritisk för utvecklingen av mörk ögonpigmentering, vit (CPIJ005542)30 (Tabell 1). CRISPR/Cas9 genererade somatiska mutationer gjordes genom screening för förlust av pigmentering i pupal stadium ögon av injicerade individer (G0). Somatiska mutationer var i allmänhet närvarande som mosaik fenotyper där vissa men inte alla celler har mutant fenotyp. Till exempel resulterade somatiska mutationer av den vita genen i en blandning av ommatidia med fenotyper som saknar pigmentering och de med en vildtyp pigmenterad fenotyp30. När det fanns en könsceller mutation av den vita genen, ärvde dock nästa generation (G1) den helvita eyed fenotyp. Bakterielinjen mutation priser fastställdes genom intercrossing mosaik G0 individer och poäng för helt vitögda avkommor (G1). Dessa experiment resulterade i en överlevnadsgrad på 64 till 82% embryo, liksom en 37% till 57% somatisk mutagenes och en >61% könscells mutagenesfrekvens (tabell 1). Genom multiplexering av sgRNAs för att rikta in sig på flera lokus i samma gen ökade somatiska och könsceller mutagenesfrekvensen uppåt till så mycket som 86% (tabell 1). Dessutom har livskraftiga homozygous lager av de vita mutanterna framgångsrikt hållits i labbet i många generationer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figur 1: C. quinquefasciatus äggflotte och äggmorfologi. Dorsal (A), laterala (B) och ventrala (C) vyer över C quinquefasciatus äggflottar. C. quinquefasciatus honor lägger sina ägg med den mer bulbous främre sidan som vidrör vattenytan medan den mer spetsiga bakre bort från vattenytan (D). A- främre; P- posterior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figur 2: Tidslinje för att skapa C. quinquefasciatus mutanter genom mikroinjektion. Tidslinje för C. quinquefasciatus koloniberedning och embryosamling för mikroinjektion (A-D). Uppsamlade ägg separeras sedan( E) i samma riktning och täcks med halokarbonolja (F). Äggen injiceras sedan (G) och får vila i minst 5 minuter innan halokarbonoljan (H). Ägg överförs sedan till en ren vattenkälla (I) för kläckning (J) och screenas för mutanta fenotyper (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Överlevnad</td>
			<td colspan="3">Somatisk mosaicism (G0)</td>
			<td>Könscellsslemhinnan (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA (sgRNA)</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Totalt (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Totalt (%)</td>
			<td>G1 mutanter (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1 (på 1)</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2 (på 2)</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3 (på 1999)</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Överlevnads- och mutationshastigheter hos embryon som injicerats med enstaka och multiplexerade gRNAs riktade mot vitt. Tabellen skrivs ut igen med tillstånd från30

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Detta protokoll beskriver mikroinjektionsförfaranden för Culex quinquefasciatus embryon som är optimerade för att fungera med CRISPR / Cas9 genredigeringsverktyg. Denna teknik kan effektivt generera platsspecifika, ärftliga, könsceller mutationer som kan användas för att bygga genetisk teknik i denna understudied sjukdom vektor.

Embryomikroinjektionsteknik för effektiv platsspecifik mutagenes i Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Laser-assisted cytoplasmatisk mikroinjektion i Boskap Zygoter

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Leverans av nukleinsyror genom Embryo mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målinriktad<em&gt; In situ</em&gt; mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroskop och Transplantation teknik för Nasonia vitripennis genomet Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-riktade slumpmässig mutagenes att välja Heterokromatin-destabiliserande proteasom mutanter i Fission jäst

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

En roman mättnad mutagenes strategi: Enda steg karakterisering av reglerande proteinet bindningsställen i RNA med hjälp av Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transkriptionsstyrt plasmiduttryckssystem för undersökning av stabiliteten hos mRNA-avskrifter i primära Alveolar Epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...