Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

أشكر الدكتورة كارلا ج. شاتز على المشورة والدعم، والدكتورة باربرا ك. بروت وميشيل ك. دريس على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. ويدعم العمل المعهد الوطني للصحة EY02858 ومنح مؤسسة ماذرز الخيرية إلى المركز.

ويتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقاً لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة، وهو دليل أقرته لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة ستانفورد. كما تتوافق الطرق مع سياسات جمعية علم الأعصاب بشأن استخدام الحيوانات والبشر في أبحاث علم الأعصاب.
<p class="j...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

ويوضح البروتوكول الموصوف هنا أن شرائح فرس النهر التي تم الحصول عليها من الفئران البالغة والشيخوخة يمكن أن تظل صحية وقابلة للحياة لساعات عديدة بعد القطع. الشرائح المعدة باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لتسجيلات اللصق، وكذلك التسجيلات الميدانية طويلة الأمد في مناطق CA1.
هناك خ...

وقد سهل ظهور الثدييات الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة التجارب على المستوى الخلوية والتشابكية التي كانت ممكنة سابقا إلا في الاستعدادات اللافقارية مثل Aplysia1. وكان تطوير شرائح فرس النهر الحادة ذات أهمية خاصة، حيث أنها هيكل مسؤول عن تكوين الذاكرة والعمل والسياق، ولها دوائر ثلاثية متشابك متخصصة قابلة للتلاعب الفسيولوجي السهل. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من شرائح الدماغ الحادة لا تزال مستعدة من الفئران والجرذان الصغيرة نسبيا ، حيث أنه من الأسهل الحفاظ على الخلايا العصبية والدوائر الصحية ، وتبقى الشرائح قابلة للحياة لفترات أطول من الزمن2،3،4. هنا، نقدم تعديلات على بروتوكولات التقطيع القياسية التي تؤدي إلى زيادة جدوى شرائح قرن آمون الحادة من الفئران البالغة والشيخوخة.
العائق الرئيسي أمام قدرة الجسم الحي السابق على البقاء على المدى الطويل من الثديات الدماغ parenchyma هو الضرر hypoxic الأولية التي تحدث بسرعة بمجرد تدفق الدم إلى الدماغ يتوقف بعد قطع الرأس. فقدان الأكسجين النتائج في الاستهلاك الأيضي السريع من موارد الطاقة الرئيسية في الدماغ مع فقدان فوسفو الكرياتين (ف- الكرياتين) كونها أسرع، تليها الجلوكوز، الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، والجليكوجين4. الحفاظ على ATP له أهمية خاصة لصحة طويلة الأجل لشرائح الدماغ، كما هو مطلوب ATP للحفاظ على إمكانات الغشاء عبر ATPase نا-K، وبالتالي النشاط العصبي5،,6. مستوى ATP في الدماغ القوارض الكبار هو ~ 2.5 mM، ويسقط بشكل حاد داخل 20 ق من قطع الرأس للوصول إلى حالة ثابتة القاعدية (~ 0.5 mM) في حوالي 1 دقيقة بعد قطع الرأس4،7،8. في الحيوانات الصغيرة، يستغرق وقتا أطول لمراقبة نفس الانخفاض في ATP (~ 2 دقيقة)؛ مع التخدير الفينوباربيالي هو مزيد من تباطؤ إلى 4 دقيقة4. وتبين هذه الاعتبارات أن منع فقدان ATP وغيرها من موارد الطاقة هو استراتيجية ضرورية لمنع تلف نقص الأكسجة في الدماغ، وبدوره للحفاظ على صحة شرائح الدماغ على مدى فترات أطول من الزمن، وخاصة في الحيوانات البالغة.
انخفاض درجات الحرارة تبطئ عملية التمثيل الغذائي. وبالتالي، فقد ثبت أن انخفاض حرارة الجسم متواضعة يحمي احتياطيات الطاقة في الدماغ: في الحيوانات الصغيرة، وخفض درجة حرارة الجسم بمقدار ست درجات، من 37 درجة مئوية إلى 31 درجة مئوية، يحافظ على مستويات ATP إلى حوالي 80٪ من المستويات العادية على مدى 4 ساعة من نقص الأكسجة الخاضعة للرقابة9. كما يتم الحفاظ على مستويات P-الكرياتين، وكذلك احتمالية الفسفور الشامل9. وهذا يشير إلى أن خفض درجة حرارة الجسم قبل قطع الرأس يمكن أن يكون عصبيا، حيث يمكن الحفاظ على مستويات شبه طبيعية من ATP من خلال قطع شريحة وشريحة فترات الانتعاش.
إلى درجة أن قطرة ATP لا يمكن منعها تماما عند قطع الرأس، ومن المتوقع وظيفة ضعف جزئي من ATPase نا- K، تليها إزالة التلوث عن طريق تدفق الصوديوم السلبي. كما يتبع تدفق الصوديوم السلبي من خلال دخول المياه إلى الخلايا، فإنه يسبب وذمة السامة للخلايا وفي نهاية المطاف pyknosis. في الفئران البالغة، استبدال نا + الأيونات مع السكروز في حلول قطع شريحة كانت استراتيجية ناجحة لتخفيف عبء الوذمة السامة للخلايا10،11. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الكاتيونات العضوية الميثيلية التي تقلل نفاذية قناة الصوديوم12 لتقديم حماية أكثر فعالية من السكروز، وخاصة في شرائح من الفئران الكبار، مع N-الميثيل-D-جلوكوامين (NMDG) يجري الأكثر انطباقا على نطاق واسع عبر مختلف الأعمار ومناطق الدماغ13،14،15،16.
العديد من بروتوكولات تشريح الدماغ تنطوي على استخدام درجات الحرارة الباردة فقط خلال خطوة قطع شريحة، وأحيانا في تركيبة مع نا+ استراتيجية استبدال الأيونات16،17. في الحيوانات الصغيرة ، يبدو أن هذه البروتوكولات توفر الحماية العصبية الكافية حيث يمكن استخراج الأدمغة بسرعة بعد قطع الرأس لأن الجمجمة لا تزال رقيقة وسهلة لإزالة3. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية لا تنتج شرائح صحية من الحيوانات البالغة. مع مرور الوقت، أدخلت عدد من المختبرات التي تدرس القوارض البالغة الضخ عبر القلب مع محلول الجليد البارد لخفض درجة حرارة جسم الحيوان، وبالتالي تلف نقص الأكسجة في الدماغ، قبل قطع الرأس. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح لإنتاج شرائح cerebellar18، شرائح midbrain19، شرائح القشرة الجديدة11،20، القشرة الرحاين21، قرن آمون الفئران10،22،23، لمبة الشم24، المخطط البطيني25، القشرة البصرية26.
على الرغم من المزايا التي يوفرها الضخ عبر القلب وNa+ استبدال الأيونات في إعداد شرائح من الفئران وفي بعض مناطق الدماغ في الفئران، يبقى قرن الماوس قرن آمين واحدة من أكثر المناطق تحديا للحماية من نقص الأكسجة13،20. حتى الآن، واحدة من النهج الأكثر شيوعا لشرائح قرن آمون من الفئران الشيخوخة ونماذج الماوس من الانعزال العصبي ينطوي على تشريح سريع الكلاسيكية من فرس النهر المعزول27. في البروتوكول الموصوف هنا ، نحن نقلل من فقدان ATP في الدماغ البالغ من خلال إدخال انخفاض حرارة الجسم قبل قطع الرأس عن طريق ضخ الحيوان عبر القلب مع الثلج البارد Na+- السائل النخاعي الاصطناعي المجاني NMDG القائم على NMDG (NMDG-aCSF). ثم يتم قطع شرائح في الجليد الباردة نا+-خالية NMDG-aCSF. مع هذا البروتوكول المعزز نحصل على شرائح قرن آمون حادة من الفئران البالغة والشيخوخة التي هي صحية لمدة تصل إلى 10 ساعة بعد التقطيع ومناسبة لتسجيلات ميدانية طويلة الأجل ودراسات التصحيح المشبك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

وقد مكنت شرائح فرس النهر الحادة أجيال من علماء الأعصاب لاستكشاف خصائص متشابك، العصبية، والدوائر بالتفصيل وبدقة عالية. استكشاف LTP و LTD آليات، واحدة حساب تسخين الخلايا العصبية، والتغيرات التي تعتمد على الخبرة في الدوائر، لم يكن ممكنا بدون هذا الإعداد الكلاسيكي. ومع ذلك، مع بعض الاستثناءات القليلة، تم إجراء معظم البحوث الأساسية باستخدام شرائح فرس النهر الحادة باستخدام شرائح من القوارض من أعمار مبكرة نسبيا، ~ P20-P40، على الرغم من أن آليات الإثارة متشابك ومتأصلة لها ذيل التنموية الطويلة التي تصل إلى P60 الماضي. النداء الرئيسي لاستخدام شرائح فرس النهر الشباب هو الحفاظ على صحة الخلايا العصبية بمساعدة ارتفاع التسامح للأضرار نقص الأكسجة. ومع ذلك، هناك حاجة لفهم وظيفة الخلايا العصبية في مراحل أكثر نضجا من التنمية، وزيادة من خلال تطوير نماذج حيوانية مختلفة من الأمراض العصبية التي تتطلب إعداد الدماغ الشيخوخة. هنا وصفنا تعديلا لإعداد شريحة قرن آمون الحاد الذي يسلم بشكل موثوق شرائح صحية من فرس النهر الماوس الكبار والشيخوخة. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي الضخ عبر القلب والقطع مع الجليد الباردة خالية من الصوديوم NMDG-aSCF. معا، هذه الخطوات تخفيف انخفاض نقص الأكسجة الناجم عن ATP عند قطع الرأس، فضلا عن وذمة السامة للخلايا الناجمة عن تدفقات الصوديوم السلبية. نُوضِّفُ كيفية قصّ شرائح مُنَعَرِفِ مِنْ قرن آمون بالإضافة إلى قشرةِ قَدَسْةِ تَعْزِزِيْ بِنْفِرِةِ. شرائح فرس النهر الحادة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صحية بشكل موثوق على مدى ساعات عديدة من التسجيل ، وهي مناسبة لكل من التسجيلات الميدانية والتسجيلات المستهدفة باللصقبص ، بما في ذلك استهداف الخلايا العصبية ذات التسمية الفلورية.

طبقنا البروتوكول أعلاه لتوليد شرائح قرن آمون من CamKIIa-Cre+; WT الفئران على خلفية وراثية مختلطة C57Bl / 6 × SV / 129J، في P > 120. تظهر أعداد كبيرة من الخلايا الهرمية في حقل CA1(الشكل 2A)و subiculum(الشكل 2B)في تباين منخفض عندما لوحظ تحت المجهر التفاضلي للتباين تحت الحمراء (IR-DIC)، وهي ?...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

هذا هو بروتوكول لإعداد شريحة حادة من الكبار والشيخوخة فرس النهر الماوس الذي يستفيد من الضخ عبر القلب وقطع شريحة مع الجليد البارد NMDG-aCSF للحد من الضرر نقص الأكسجة في الأنسجة. تبقى الشرائح الناتجة في صحة جيدة على مدار ساعات عديدة ، وهي مناسبة لـ Patch-clamp على المدى الطويل والتسجيلات الميدانية.

تقليل نقص الأكسجة في شرائح فرس النهر من الكبار والشيخوخة الفئران

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

البروتوكول المقدم هنا يقلل من الضرر المفرط نقص الأكسجة أثناء إعداد شرائح فرس النهر الماوس الشيخوخة والشيخوخة، وبالتالي إزالة عقبة رئيسية لدراسة وظيفة الدوائر العصبية ناضجة والشيخوخة. يؤدي إدخال انخفاض حرارة الجسم في حلول الصوديوم الحرة إلى شرائح فرس النهر التي تكون صحية لمدة تصل إلى 10 ساعات بعد القطع ومناسبة لكل من التسجيلات الميدانية طويلة الأجل ودراسات المشبك. هذه الطريقة لإعداد شرائح فرس النهر يمكن أن تكون ذات صلة خاصة لنماذج الحيوانات في الأمراض العصبية التي تتطلب بحكم التعريف إعداد الدماغ الشيخوخة.الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إدخال انخفاض حرارة الجسم عن طريق إسراف عبر القلب مع محلول الجليد الباردة. مع بعض الممارسة، سوف يكون الباحثون قادرين على تنفيذ هذه الخطوة بشكل موثوق. تبدأ من خلال إعداد لتر واحد من حل ACSF لغرفة الانتعاش والتسجيلات اللاحقة.ثم إعداد 300 ملليلتر من NMDG-ACSF لإسراف عبر القلب وخطوات القطع. ضع علبة القطع المجهرية المهتزة والقرص المتصاعد في ثلاجة ناقص 20 درجة مئوية. لإعداد غرفة الاسترداد، تعبئة إلى ما يزيد قليلا على شريحة عقد شبكة والبدء في فقاعة حفظ الغرفة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.هدئ 300 ملليلتر كامل من NMDG-aCSF في ثلاجة حتى تبدأ بلورات الثلج في التشكل على السطح وجدران الزجاجة. ضع الزجاجة مع المبردة و NMDG-aCSF على الجليد والفقاعة، والحفاظ على الحل بين صفر واثنين من درجات مئوية. أخرج قرص الأنسجة المتصاعد من الفريزر وامسحه جافًا، إذا لزم الأمر.قطع كتلة من 5 ٪ أجار حول حجم دماغ الماوس والغراء في وسط القرص باستخدام طبقة رقيقة من الغراء سيانوكرايل. ضع القرص مع أجار لاصقة على الجليد وتغطيته بالمناشف الورقية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. أخرجي صينية القطع من الفريزر، وضعها في الميكراتوم، ثم أحاطه بالثلج وحمّل النصل.إعداد جميع الأدوات في وقت مسبق لتشريح الدماغ. إعداد مضخة ال peristaltic ل perfusion عبر القلب. أدخل جانبًا واحدًا من أنابيب المضخة في الزجاجة باستخدام NMDG-aCSF المثلج وتناسب الجانب الآخر بإبرة قياس 27.تعيين سرعة المضخة إلى حوالي 3.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. بهذه السرعة، فإن تدفق NMDG-aCSF هو رحلة سريعة، وليس تدفق مستمر. ضع الماوس على ظهره على حفاضة.قبل الاستمرار، وأكد أن الماوس هو في طائرة جراحية من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع قدم. يجب أن يكون الماوس لا يستجيب ، ثم يتم تسجيله أسفل ساقيه الأماميتين والذريتين بحيث يتعرض الصدر والبطن. قطع رقعة كبيرة من الجلد على الصدر، والذهاب من تحت القص إلى الحلق.الاستيلاء على القص مع ملقط، ورفعه بلطف والبدء في قطع من خلال القفص الصدري على كلا الجانبين حتى يتم الكشف عن تجويف الصدر. قطع من خلال الحجاب الحاجز، وترك رفرف القفص الصدري تعلق عن طريق قطعة رقيقة من العضلات. وينبغي أن يكون من الممكن وضعها جانبا دون أن يكون لها تقع مرة أخرى على تجويف الصدر المكشوفة.تأكد من أن القلب لا يزال ينبض وتأكد من أن معظم الكبد مرئي. أدخل الإبرة في البطين الأيسر، الذي يبدو أخف لونًا من اللون الأيمن. لتثبيت الإبرة، محركها من خلال الأضلاع المتبقية على الجانب الأيسر من الجسم.حدد مكان الأذين الأيمن الداكن ذو اللون الأحمر ويقطعه بمقص صغير. يجب أن يبدأ الدم بالتدفق بدء المضخة ومراقبة الكبد، والتي سوف تغير اللون من الأحمر إلى البني.مراقبة لون الكبد ومواصلة الانفعال حتى يتحول الكبد البني شاحب. تشغيل المضخة لبضع دقائق أخرى. يجب أن تنخفض درجة حرارة الجسم من الحيوان إلى 28 إلى 29 درجة مئوية وأنفها يجب أن يكون باردا لمسة.قطع رأس الماوس مع مقص قطع الرأس كبيرة، ثم استخدام مشرط مع شفرة رقم 10 لقطع فتح الجلد على رأس الجمجمة. مع مقص صغير الزاوية، وقطع الجمجمة في خط الوسط. بعد ذلك ، استخدم عدد ثلاثة ملقط لابعاد النصفين الأيمن والأيسر من الجمجمة ، مع الحرص على اتخاذ دورا بعيدا معها.إزالة الدماغ، والتي ينبغي أن يكون لون أبيض من قبل يغرف بها مع ملعقة وإسقاطه في حل NMDG-aCSF على الجليد. اتركه هناك لمدة تصل إلى دقيقة. أخرج الدماغ من NMDG-aCSF وضعه على قطعة من ورق التصفية.قطع وإزالة إسفين 60 درجة من الأنسجة مع أداة 60 درجة تركزت في خط الوسط من نهاية الرسترالية من forebrain. استخدام الجانبين قطع من سطح تصاعد كما أنه يوفر زاوية مناسبة لشرائح فرس النهر. فصل نصفي الكرة الأرضية أسفل خط الوسط مع مشرط واللصق لهم على القرص المتصاعد.خذ القرص المتصاعد من الجليد وامسحه جافًا ، إذا لزم الأمر. ثم الغراء كل نصف الكرة أمام كتلة أجار، وقطع الجانب إلى أسفل. تأكد من أن الجانبين البطنيين لكلا نصفي الكرة الأرضية تلامس كتلة أجار وأن الجانبين الظهريين لكلا نصفي الكرة الأرضية تواجه النصل.عندما لصقها على الجانب قطع، ينبغي أن يكون موجها كل نصف الكرة الأرضية بالنسبة إلى شفرة بطريقة تضمن شرائح عرضية من الحصين الظهرية في الموقع. غمر القرص مع نصفي الكرة الأرضية في غرفة القطع التي تحتوي على الجليد الباردة carbdG-aCSF. قطع قسم 400 ميكرومتر، ثم استخدام ماصة نقل المتاح مع طرف قطع لنقل شريحة إلى غرفة الانتعاش التي تحتوي على NMDG-aCSF carbogenated في درجة حرارة الغرفة.مواصلة قطع بقية المقاطع ونقلها إلى غرفة الإنعاش لا تستغرق أكثر من 10 دقائق لقطع ما مجموعه ثماني إلى 10 شرائح من منطقة الحصين الظهرية. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تقريبا قبل التسجيل. تم استخدام هذا البروتوكول لتوليد شرائح فرس النهر من الفئران البالغة.تظهر أعداد كبيرة من الخلايا الهرمية في حقل CA1 و subiculum في تباين منخفض ، وهي سمة مميزة للخلايا السليمة ، عندما لوحظ تحت المجهر التفاضلي للتباين تحت الحمراء. يمكن الحصول على تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية CA1 من الفئران التي هي أكثر من ستة أشهر من العمر. في التجربة المثال هنا، تم قياس تردد التيارات ما بعد التشنج مصغرة بعد تم حث NMDA-LTD نسبة إلى ظروف التحكم.وكان تواتر مصغرة التيارات بعد الإثارة أقل في الخلايا العصبية بعد التعريفي NMDA-LTD، مما يشير إلى النشاط تعتمد تقليم من synopses في CA1. ولم يتم الكشف عن تغيرات في السعة. خلال تسجيلات mEPSC، كما تم شغل خلايا CA1 biocytin وarbor dendritic سليمة ويمكن رؤية عادة الخلايا الصحية من الخلايا العصبية الهرمية هنا.يتيح التوزيع القوي للصبغة الفلورية في جميع أنحاء الخلية تحليل التشعبات والعمود الفقري التشعبي في ظل ظروف مختلفة. لوحظت التقوية طويلة الأجل، أو LTP، من نقاط الاشتباك العصبي CA3-CA1 من حوالي 170٪، مما يشير إلى أن الحفاظ على الشلالات الإشارات اللازمة لLTP موجودة في شرائح أعدت من الفئران البالغة. تشير إشارة محتملة قوية إلى وجود حقل مثير للإثارة إلى أنه تم الحفاظ أيضًا على اتصال الشبكة.جانبان حاسمان للبروتوكول هما الإسراف عبر القلب مع محلول الجليد البارد للحث على انخفاض حرارة الجسم وإدخال NMDG كبديل أيون الصوديوم في حلول لمنع الوذمة السامة للخلايا. باستخدام هذه الاحتياطات، يمكن إعداد شرائح حادة من أي منطقة الدماغ. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام شرائح أعدت بهذه الطريقة للكالسيوم والجهد التصوير باستخدام المجهر 2-فوتون أو widefield.ويمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لإعداد موحد لشرائح قرن آمون حادة من الحيوانات الشيخوخة وبالتالي تسهيل المقارنات عبر الدراسات في سياق آليات الأمراض العصبية التنكسية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

إعداد Oligomeric β اميلويد 1-42 والتعريفي للعاهة اللدونة متشابك على شرائح الحصين

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

إعداد شرائح الحصين الحادة من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك وامراض الشيخوخة خلال اميلويد

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

تصوير كهربية الدماغ بالفيديو المستمر أثناء نقص الأكسيجة -الإقفارية في فئران حديثي الولادة

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...