Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Jeg takker Dr. Carla J. Shatz for råd og støtte, og Dr. Barbara K. Brott og Michelle K. Drews for kritisk at læse manuskriptet. Arbejdet er støttet af NIH EY02858 og Mathers Charitable Foundation tilskud til CJS.

Protokollen udføres i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health og godkendt af Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Metoder er også i overensstemmelse med politikkerne i Society for Neuroscience om brugen af dyr og mennesker i Neuroscience Research.
BEMÆRK: Alle mus blev vedligeholdt i et patogenfrit miljø. Vilde mus på blandet C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetisk baggrund blev anvendt her, medmindre andet e...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her, viser, at hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus kan forblive sunde og levedygtige i mange timer efter opskæring. De udsnit, der er udarbejdet ved hjælp af denne protokol, er velegnede til patch-clamp-optagelser samt langvarige feltoptagelser i CA1-områderne.
Der er to kritiske trin i denne protokol. Første skridt er transkardieperfusionstrinnet med en iskold opløsning. Hurtig clearance af blod signaleres ved hurtig ændring af leverfarve. Ekstr...

Fremkomsten af pattedyr akut hjerne skive præparater lettet eksperimenter på celle- og synaptisk niveau, der tidligere var kun muligt i hvirvelløse præparater som Aplysia1. Udvikling af akutte hippocampale skiver var af særlig betydning, da det er en struktur, der er ansvarlig for arbejdshukommelse og kontekstdannelse, og har en specialiseret tri-synaptisk kredsløb, der er modtagelig for let fysiologisk manipulation. Men langt størstedelen af akutte hjerne skiver er stadig fremstillet af relativt unge mus og rotter, da det er lettere at bevare sunde neuroner og kredsløb, og skiverne forbliver levedygtige i længere tid2,3,4. Her introducerer vi ændringer af standard udskæringsprotokoller, der resulterer i øget levedygtighed af akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus.
Den største hindring for den langsigtede ex vivo levedygtighed pattedyr hjerne parenkym er den oprindelige hypoxiske skader, der opstår hurtigt, når blodtilførslen til hjernen stopper efter halshugning. Tab af ilt resulterer i hurtigt metabolisk forbrug af store energiressourcer i hjernen med tab af fosfor-kreatin (P-kreatin) er den hurtigste, efterfulgt af glukose, adenosin tripfosfat (ATP), og glykogen4. Bevarelse af ATP er af særlig betydning for den langsigtede sundhed hjerne skiver, som ATP er nødvendig for at opretholde membranpotentialet via Na-K ATPase, og dermed neurale aktivitet5,6. ATP-niveauet i den voksne gnaver hjerne er ~ 2,5 mM, og det falder brat inden for 20 s af halshugning at nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på omkring 1 min post-halshugning4,7,8. Hos unge dyr tager det længere tid at observere det samme fald i ATP (~2 min); med fænobarbital anæstesi det er yderligere bremset til 4 min4. Disse overvejelser viser, at forebyggelse af tab af ATP og andre energiressourcer er en nødvendig strategi for at forebygge hypoxiske skader på hjernen og til gengæld for at opretholde sundheden for hjerneskiver over længere perioder, især hos voksne dyr.
Lave temperaturer bremse stofskiftet. Det er derfor blevet påvist, at beskedne hypotermi beskytter hjernens energireserver: hos unge dyr, der sænker kropstemperaturen med seks grader, fra 37 °C til 31 °C, bevarer ATP-niveauet til ca. 80 % af de normale niveauer over 4 timer kontrolleret hypoxi9. P-kreatin niveauer er ligeledes bevaret, samt den samlede fosforylering potentiale9. Dette tyder på, at sænke kropstemperaturen før halshugning kunne være neuroprotektive, som næsten normale niveauer af ATP kunne opretholdes gennem skiven skæring og skive restitutionsperioder.
I det omfang et ATP-fald ikke kan forhindres fuldstændigt ved halshugning, forventes en delvist forringet funktion af Na-K ATPase, efterfulgt af depolarisering via passiv natriumtilstrømning. Da den passive natriumtilstrømning efterfølges af vand indtræden i celler, forårsager det cytotoksisk ødem og i sidste ende pyknose. Hos voksne rotter har udskiftning af na+ ioner med saccharose i skæreopløsninger været en vellykket strategi for at lette byrden ved cytotoksisk ødem10,11. For nylig, methylerede organiske kationer, der reducerer natrium kanal permeabilitet12 har vist sig at tilbyde mere effektiv beskyttelse end saccharose, især i skiver fra voksne mus, med N-methyl-D-glucamin (NMDG) er mest anvendelig på tværs af forskellige aldre og hjerne regioner13,14,15,16.
Talrige hjerne-udskæring protokoller indebærer brug af kolde temperaturer kun under skive-skæring trin, undertiden i kombination med Na+ ion udskiftning strategi16,17. Hos unge dyr, disse protokoller synes at tilbyde tilstrækkelig neuroprotection da hjernen kan udvindes hurtigt efter halshugning, fordi kraniet er stadig tynd og let at fjerne3. Men denne strategi producerer ikke sunde skiver fra voksne dyr. Over tid har en række laboratorier, der studerer voksne gnavere, indført transkardiisk perfusion med en iskold opløsning for at nedsætte dyrets kropstemperatur og dermed hypoxiske skader på hjernen før halshugning. Denne procedure blev anvendt med succes til at producere cerebellar skiver18, midbrain skiver19, neocortical skiver11,,20,perirhinal cortex21, rotte hippocampus10,22,,23, olfaktoriskepære 24, ventral striatum25, visuel cortex26.
På trods af de fordele, som transcardial perfusion og Na+ ion udskiftning i udarbejdelsen skiver fra rotte og i nogle hjerneregioner i mus, mus hippocampus er fortsat en af de mest udfordrende områder for at beskytte mod hypoxi13,20. Til dato, en af de mest almindelige tilgange til udskæring hippocampus fra aldrende mus og mus modeller af neurodegeneration indebærer den klassiske hurtige udskæring af den isolerede hippocampi27. I den protokol, der er beskrevet her, minimerer vi tabet af ATP i den voksne hjerne ved at indføre hypotermi før halshugning ved transkardiisk perfusing dyret med iskold Na+- gratis NMDG-baserede kunstige cerebrospinalvæske (NMDG-aCSF). Skiver skæres derefter i iskold Na+-fri NMDG-aCSF. Med denne forbedrede protokol opnår vi akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus, der er sunde i op til 10 timer efter udskæring og er passende til langsigtede felt-optagelser og patch-clamp undersøgelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Akutte hippocampale skiver har gjort det muligt for generationer af neuroforskere at udforske synaptiske, neuronale, og kredsløb egenskaber i detaljer og med high fidelity. Udforskning af LTP og LTD mekanismer, enkelt neuron dendritisk beregning, og erfaring-afhængige ændringer i kredsløb, ville ikke have været muligt uden denne klassiske forberedelse. Men med nogle få undtagelser, de fleste grundforskning ved hjælp af akut hippocampal skiver er blevet udført ved hjælp af skiver fra gnavere i relativt unge aldre, ~ P20-P40, selv om synaptiske og iboende ophidselse mekanismer har en lang udviklingsmæssige hale, der når forbi P60. Den vigtigste appel ved at bruge unge hippocampal skiver er bevarelse af neuronal sundhed hjulpet af højere tolerance over for hypoxiske skader. Men, der er behov for at forstå neuronal funktion på mere modne stadier af udviklingen, yderligere forstærket af udviklingen af forskellige dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, der kræver en aldrende hjerne forberedelse. Her beskriver vi en ændring af en akut hippocampal skive forberedelse, der pålideligt leverer sunde skiver fra voksne og aldrende mus hippocampi. Protokollens kritiske trin er transkardieperfusion og skæring med iskold natriumfri NMDG-aSCF. Tilsammen dæmper disse trin hypoxi-induceret fald i ATP ved halshugning samt cytotoksisk ødem forårsaget af passive natriumflukser. Vi demonstrerer, hvordan man skærer tværgående skiver af hippocampus plus cortex ved hjælp af en vibrerende mikrotom. Akutte hippocampale skiver opnået på denne måde er pålideligt sunde over mange timers optagelse, og er passende for både felt-optagelser og målrettede patch-clamp optagelser, herunder målretning af fluorescerende mærket neuroner.

Vi anvendte ovenstående protokol til at generere hippocampus skiver fra CamKIIa-Cre +; WT mus på en blandet genetisk baggrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, ved P > 120. Et stort antal pyramideceller i feltet CA1 (Figur 2A) og subiculum (figur 2B) vises i lav kontrast, når det observeres under infrarød differentialkontrastmikroskopi (IR-DIC), et kendetegn for sunde celler i et skivepræparat. Med dette præparat, en høj sats af giga-ohm sæler (> 90%) opnås rutinem?...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Dette er en protokol for akut skive forberedelse fra voksne og aldrende mus hippocampi, der udnytter transcardial perfusion og skive skæring med iskold NMDG-aCSF at reducere hypoxiske skader på vævet. De resulterende skiver forbliver sunde over mange timer, og er velegnede til langsigtede patch-clamp og felt-optagelser.

Minimering af hypoxi i Hippocampal Skiver fra voksne og aldrende mus

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Protokollen præsenteres her mindsker overdreven hypoxiske skader under udarbejdelsen af voksne og aldrende mus hippocampal skiver, og dermed fjerne en stor hindring for at studere funktion af modne og aldrende neurale kredsløb. Indførelse af hypotermi i natriumfrie opløsninger resulterer i hippocampale skiver, der er sunde i op til 10 timer efter opskæring og passende for både de langsigtede feltoptagelser og patch-clamp undersøgelser. Denne metode til fremstilling af hippocampal skiver kunne være særligt relevant for dyremodeller i neurodegenerative sygdomme, der pr. definition kræver en aldrende hjernepræparat.Det mest kritiske skridt i denne protokol er at indføre hypotermi via transcardial overflod med en iskold opløsning. Med nogle praksis, forskere vil være i stand til pålideligt at udføre dette trin. Begynd med at forberede en liter aCSF-løsning til genoprettelseskammeret og efterfølgende optagelser.Derefter forberede 300 milliliter NMDG-aCSF for transcardial overflod og skære trin. Anbring den vibrerende mikrotomskærebakke og monteringsskiven i minus 20 grader Celsius-fryseren. For at forberede bjærgningskammeret skal du fylde det til lige over skivens holdemaske og starte bobleren holde kammeret på bænken ved stuetemperatur.Chill hele 300 milliliter NMDG-aCSF i en fryser, indtil iskrystaller begynder at danne på overfladen og væggene i flasken. Placer flasken med kølet og NMDG-aCSF på is og boble det, holde løsningen mellem nul og to grader Celsius. Tag vævsmonteringsskiven ud af fryseren og tør den tørre, hvis det er nødvendigt.Skær en blok på 5% agar på størrelse med en mus hjerne og lim det i midten af disken ved hjælp af et tyndt lag af cyanoacrylat lim. Placer disken med limet agar på is og dække det med papirservietter, indtil klar til brug. Tag skærebakken ud af fryseren, læg den i mikrotomen, omgød den derefter med is og læg klingen i.Forbered alle værktøjer på et tidspunkt for hjernen dissektion. Opsæt den peristaltiske pumpe til transcardial perfusion. Sæt den ene side af pumpeslangen i flasken med iset NMDG-aCSF og sæt den anden side i med en 27 gauge nål.Indstil pumpehastigheden til ca. 3,5 milliliter i minuttet. Ved denne hastighed er udstrømningen af en NMDG-aCSF en hurtig tur, ikke et kontinuerligt flow. Placer musen på ryggen på en ble.Før du fortsætter, bekræftet, at musen er på et kirurgisk plan af anæstesi ved at udføre en tå knivspids. Musen skal være afvisende, derefter tapede ned sin for- og bagben, således at brystet og maven er udsat. Skær et stort plaster på huden på brystet, går fra under brystbenet til halsen.Grib brystbenet med scer, løft det forsigtigt og begynde at skære gennem brystkassen på begge sider, indtil brysthulen er udsat. Skær gennem mellemgulvet, forlader flappen af brystkassen fastgjort via et tyndt stykke muskel. Det bør være muligt at sætte den til side uden at få den til at falde tilbage på det udsatte brysthule.Kontroller, at hjertet stadig slår og sikre, at det meste af leveren er synlig. Sæt nålen i venstre hjertekammer, som ser lysere ud i farven end højre. For at stabilisere nålen, køre den gennem de resterende ribben på venstre side af kroppen.Find den mørkerøde højre atrium og skær igennem det med en lille saks. Blodet burde begynde at flyde ud. Start pumpen og observere leveren, som vil ændre farve fra rød til brun.Overvåg leverfarven og fortsæt perfusionen, indtil leveren bliver lysebrun. Kør pumpen i et par minutter mere. Dyrets kropstemperatur skal falde til 28 til 29 grader Celsius, og dets næse skal være kold at røre ved.Halshugge musen med store halshugning saks, derefter bruge en skalpel med en nummer 10 klinge til at skære åbne huden på toppen af kraniet. Med små vinklede saks, skære kraniet på midterlinjen. Dernæst skal du bruge nummer tre krafterne til at lirke væk højre og venstre halvdel af kraniet, være omhyggelig med at tage dura væk med det.Fjern hjernen, som bør være en off-white farve ved at øse det ud med en spatel og slip det ind i NMDG-aCSF løsning på is. Lad det stå der i op til et minut. Tag hjernen ud af NMDG-aCSF og læg den på et stykke filterpapir.Skær og fjern en 60 graders vævskile med et 60 graders værktøj centreret i midterlinjen fra forhjernens rostrale ende. Brug de afskårne sider af monteringsoverfladen, da det giver den rette vinkel for hippocampale skiver. Adskiv halvkuglerne ned ad midterlinjen med skalpellen og lim dem på monteringsskiven.Tag monteringsskiven fra isen og tør den tørre, hvis det er nødvendigt. Lim derefter hver halvkugle foran agarblokken, skær siden nedad. Sørg for, at de ventrale sider af begge halvkugler rører agarblokken, og at de to halvkuglers overdelser vender mod klingen.Når limet på den afskårne side, bør hver halvkugle være orienteret i forhold til bladet på en måde, der sikrer tværgående skiver af dorsal hippocampus in situ. Nedsænk disken med halvkugler i et skærekammer, der indeholder iskold carbogenated NMDG-aCSF. Skær en 400 mikrometer sektion, derefter bruge en engangs-overførsel pipette med en cutoff tip til at overføre skiven til et opsving kammer, der indeholder carbogenated NMDG-aCSF ved stuetemperatur.Fortsæt med at skære resten af sektionerne og overføre dem til bjærgningskammeret tager ikke mere end 10 minutter at skære i alt otte til 10 skiver fra den dorsale hippocampus region. Skuber skiverne ved stuetemperatur i ca. to timer før optagelsen. Denne protokol blev brugt til at generere hippocampale skiver fra voksne mus.Et stort antal pyramideceller i CA1-feltet og subiculum vises i lav kontrast, et kendetegn for sunde celler, når de observeres under infrarød differentialkontrastmikroskopi. Patch-clamp optagelser kan fås fra CA1 neuroner af mus, der er over seks måneder gamle. I eksempeleksperimentet her blev hyppigheden af miniature excitatoriske postsynaptiske strømme målt efter NMDA-LTD blev induceret i forhold til kontrolbetingelser.Hyppigheden af miniature excitatoriske postsynaptiske strømme var lavere i neuroner efter en NMDA-LTD induktion, hvilket indikerer aktivitetsafhængig beskæring af synopser i CA1. Der blev ikke fundet ændringer i amplitude. Under mEPSC optagelser, CA1 celler blev også fyldt biocytin og intakt dendritisk arbor og sunde celle habitus af pyramideale neuroner kan ses her.En robust fordeling af fluorescerende farvestof i hele cellen tillader analyse af dendritter og dendritiske pigge under forskellige forhold. Langsigtet potensering, eller LTP, af CA3-CA1 synapser på ca 170% blev observeret, hvilket tyder på, at vedligeholdelse af signalering kaskader behov for LTP er til stede i skiver fremstillet af voksne mus. Et robust felt excitatoriske postsynaptiske potentielle signal tyder på, at netværksforbindelsen også blev bevaret.To kritiske aspekter af protokollen er transkardie-formering med en iskold opløsning til at fremkalde hypotermi og indførelse af en NMDG som natriumion erstatning i løsninger til forebyggelse af cytotoksisk ødem. Ved hjælp af disse forholdsregler, akutte skiver kan fremstilles fra enhver hjerne region. Desuden kan skiver tilberedt på denne måde bruges til calcium og spændingsbilleddannelse ved hjælp af to-foton eller widefield mikroskopi.Denne protokol kunne tjene som grundlag for en standardiseret forberedelse til akut hippocampal skiver fra aldrende dyr og dermed lette sammenligninger på tværs af undersøgelser i forbindelse med neurodegenerative sygdomsmekanismer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering og dyrkning af hippocampus neuroner fra Prænatal Mus

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Undersøgelse af Synaptic Tagging / Capture og Cross-capture hjælp Akut hippocampusskiver fra Gnavere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering af Synapse tæthed i hippocampus gnaver hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic medrivning af hippocampus Theta svingninger i opfører sig mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Forberedelse af akut humane hippocampale skiver til elektrofysiologiske optagelser

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Kontinuerlig video elektroencefalogram under hypoxi-iskæmi i neonatale mus

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...