Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Ik dank Dr. Carla J. Shatz voor advies en ondersteuning, en Dr. Barbara K. Brott en Michelle K. Drews voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk wordt ondersteund door NIH EY02858 en de Mathers Charitable Foundation subsidies aan CJS.

Het protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Methoden zijn ook in overeenstemming met het beleid van de Society for Neuroscience on the Use of Animals and Humans in Neuroscience Research.
OPMERKING: Alle muizen werden onderhouden in een ziekteverwekkervrije omgeving. Wild-type muizen op gemengde C57Bl/ 6 x SV/ 1...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Het hier beschreven protocol toont aan dat hippocampale plakjes verkregen van volwassen en oudere muizen gezond en levensvatbaar kunnen blijven gedurende vele uren na het snijden. De segmenten die met dit protocol zijn bereid, zijn geschikt voor patch-clamp-opnames, evenals langdurige veldopnames in de CA1-regio's.
Er zijn twee kritieke stappen in dit protocol. Eerste stap is de transcardiale perfusiestap met een ijskoude oplossing. Snelle klaring van het bloed wordt gesignaleerd door een snel...

De komst van zoogdier acute hersenen slice preparaten vergemakkelijkt experimenten op cellulair en synaptisch niveau die voorheen alleen mogelijk waren in ongewervelde preparaten zoals Aplysia1. Ontwikkeling van acute hippocampal plakjes was van bijzonder belang, want het is een structuur die verantwoordelijk is voor het werkgeheugen en contextvorming, en heeft een gespecialiseerde tri-synaptische circuits die vatbaar is voor eenvoudige fysiologische manipulatie. Echter, de overgrote meerderheid van de acute hersenen plakjes zijn nog steeds bereid van relatief jonge muizen en ratten, want het is gemakkelijker om gezonde neuronen en circuits te behouden, en de plakjes levensvatbaar blijven voor langere tijd2,3,4. Hier introduceren we wijzigingen in standaard snijprotocollen die resulteren in een verhoogde levensvatbaarheid van acute hippocampale plakjes van volwassen en oudere muizen.
De belangrijkste belemmering voor de lange termijn ex vivo levensvatbaarheid van zoogdier hersenen parenchyma is de eerste hypoxische schade die snel optreedt zodra de bloedtoevoer naar de hersenen stopt na onthoofding. Verlies van zuurstof resulteert in een snelle metabole consumptie van belangrijke energiebronnen in de hersenen met het verlies van fosfo-creatine (P-creatine) is de snelste, gevolgd door glucose, adenosine triphosfate (ATP), en glycogeen4. Behoud van ATP is van bijzonder belang voor de gezondheid op lange termijn van de hersenen plakjes, zoals ATP nodig is om het membraan potentieel te behouden via de Na-K ATPase, en dus de neurale activiteit5,6. Het ATP-niveau in het volwassen knaagdierbrein is ~2,5 mM, en het daalt snel binnen 20 s van onthoofding om een basale steady state (~0,5 mM) te bereiken op ongeveer 1 min na de onthoofding4,7,8. Bij jonge dieren duurt het langer om dezelfde daling van de ATP (~ 2 min) waar te nemen; met fenobarbital anesthesie wordt het verder vertraagd tot 4 min4. Deze overwegingen tonen aan dat het voorkomen van verlies van ATP en andere energiebronnen is een noodzakelijke strategie om hypoxische schade aan de hersenen te voorkomen en op zijn beurt om de gezondheid van de hersenen plakjes te handhaven over langere perioden van tijd, vooral bij volwassen dieren.
Lage temperaturen vertragen de stofwisseling. Bijgevolg is aangetoond dat bescheiden onderkoeling de energiereserves van de hersenen beschermt: bij jonge dieren, waarbij de lichaamstemperatuur met zes graden wordt verlaagd, van 37 °C tot 31 °C, behoudt atp-niveaus tot ongeveer 80% van de normale niveaus meer dan 4 uur van gecontroleerde hypoxie9. P-creatine niveaus zijn eveneens bewaard gebleven, evenals de totale fosforylatie potentieel9. Dit suggereert dat het verlagen van de lichaamstemperatuur voorafgaand aan onthoofding neuroprotectieve zou kunnen zijn, als bijna-normale niveaus van ATP kan worden gehandhaafd door de slice snijden en slice herstel periodes.
In de mate dat een ATP-daling bij onthoofding niet volledig kan worden voorkomen, wordt een gedeeltelijk verminderde functie van de Na-K ATPase verwacht, gevolgd door depolarisatie via passieve natriuminstroom. Als de passieve natrium instroom wordt gevolgd door water binnenkomst in cellen, het veroorzaakt cytotoxisch oedeem en uiteindelijk pyknosis. Bij volwassen ratten is het vervangen van Na+ ionen door sacharose in slice-cutting oplossingen een succesvolle strategie geweest om de last van cytotoxisch oedeem10,11te verlichten . Meer recentelijk hebben gemethyleerde organische kations die de doorlaatbaarheid van natriumkanaal verminderen12, aangetoond dat ze een effectievere bescherming bieden dan sacharose, vooral in plakjes van volwassen muizen, waarbij N-methyl-D-glucamine (NMDG) het meest van toepassing is in verschillende leeftijden en hersengebieden13,14,15,16.
Tal van brein-snijden protocollen betrekken het gebruik van koude temperaturen alleen tijdens de slice-cutting stap, soms in combinatie met Na+ ionvervanging strategie16,17. Bij jonge dieren lijken deze protocollen voldoende neuroprotectie te bieden, omdat de hersenen snel na onthoofding kunnen worden geëxtraheerd omdat de schedel nog dun is en gemakkelijk te verwijderen3. Deze strategie produceert echter geen gezonde plakjes van volwassen dieren. Na verloop van tijd hebben een aantal laboratoria die volwassen knaagdieren bestuderen transcardiale perfusie geïntroduceerd met een ijskoude oplossing om de lichaamstemperatuur van het dier te verlagen, en dus hypoxische schade aan de hersenen, voorafgaand aan onthoofding. Deze procedure werd met succes toegepast op de productie van cerebellar plakjes18, midbrain plakjes19, neocorticale plakjes11,20, perirhinale cortex21, rat hippocampus10,22,23, reukbol24, ventrale striatum25, visuele cortex26.
Ondanks de voordelen die transcardiale perfusie en Na+ ionenvervanging bieden bij het bereiden van plakjes ratten en in sommige hersengebieden bij muizen, blijft muis hippocampus een van de meest uitdagende gebieden om te beschermen tegen hypoxie13,20. Tot op heden, een van de meest voorkomende benaderingen voor het snijden hippocampus van veroudering muizen en muis modellen van neurodegeneratie omvat de klassieke snelle snijden van de geïsoleerde hippocampi27. In het hier beschreven protocol minimaliseren we het verlies van ATP in de volwassen hersenen door onderkoeling te introduceren voorafgaand aan de onthoofding door het dier transcardieel te doorbrengen met ijskoude Na+- gratis op NMDG gebaseerde kunstmatige hersenvocht (NMDG-aCSF). Plakjes worden vervolgens gesneden in ijskoude Na+-vrije NMDG-aCSF. Met dit verbeterde protocol verkrijgen we acute hippocampal plakjes van volwassen en oudere muizen die gezond zijn voor maximaal 10 uur na het snijden en geschikt zijn voor lange termijn veldopnames en patch-clamp studies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Acute hippocampal plakjes hebben generaties neurowetenschappers in staat gesteld om synaptische, neuronale en circuit eigenschappen in detail en met hoge trouw te verkennen. Verkenning van LTP- en LTD-mechanismen, enkelvoudige neuron dendritische berekening en ervaringsafhankelijke veranderingen in circuits zouden niet mogelijk zijn geweest zonder deze klassieke voorbereiding. Echter, met een paar uitzonderingen, meest elementaire onderzoek met behulp van acute hippocampal plakjes is uitgevoerd met behulp van plakjes van knaagdieren van relatief jonge leeftijden, ~ P20-P40, hoewel synaptische en intrinsieke prikkelbaarheid mechanismen hebben een lange ontwikkelingsstaart die voorbij P60 bereikt. De belangrijkste aantrekkingskracht van het gebruik van jonge hippocampal plakjes is het behoud van neuronale gezondheid geholpen door een hogere tolerantie voor hypoxische schade. Echter, Er is een noodzaak om neuronale functie te begrijpen in meer volwassen stadia van ontwikkeling, verder geaccentueerd door de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekten die een veroudering van de hersenen voorbereiding vereisen. Hier beschrijven we een wijziging aan een acute hippocampal slice voorbereiding die betrouwbaar levert gezonde plakjes van volwassen en veroudering muis hippocampi. De kritieke stappen van het protocol zijn transcardiale perfusie en snijden met ijskoude natriumvrije NMDG-aSCF. Samen verzachten deze stappen de door hypoxie veroorzaakte daling van atp bij onthoofding, evenals cytotoxisch oedeem veroorzaakt door passieve natriumfluxen. We laten zien hoe transversale plakjes hippocampus plus cortex kunnen snijden met behulp van een trillende microtome. Acute hippocampal plakjes verkregen op deze manier zijn betrouwbaar gezond gedurende vele uren van de opname, en zijn geschikt voor zowel veld-opnames en gerichte patch-klem opnames, met inbegrip van targeting van fluorescerend gelabeld neuronen.

We pasten het bovenstaande protocol toe om hippocampusplakjes te genereren van CamKIIa-Cre+; WT muizen op een gemengde genetische achtergrond C57Bl/ 6 x SV/ 129J, bij P > 120. Grote aantallen piramidale cellen in het CA1-veld(figuur 2A) en subiculum (figuur 2B) verschijnen in een laag contrast wanneer waargenomen onder infrarood differentiaal contrastmicroscopie (IR-DIC), een kenmerk van gezonde cellen in een segmentpreparaat. Met deze voorbereiding, een hoog pe...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Het hier gepresenteerde protocol vermindert overmatige hypoxische schade tijdens de voorbereiding van volwassen en verouderende muis hippocampal plakjes, waardoor een groot obstakel voor het bestuderen van de functie van volwassen en veroudering neurale circuits. Introductie van onderkoeling in natriumvrije oplossingen resulteert in hippocampale plakjes die tot 10 uur na het snijden gezond zijn en geschikt zijn voor zowel de lange termijn veldopnames als patchklemstudies. Deze methode voor de voorbereiding van hippocampal plakjes kan bijzonder relevant zijn voor dierlijke modellen in neurodegeneratieve ziekten die per definitie vereisen een veroudering van de hersenen voorbereiding.De meest kritieke stap in dit protocol is de invoering van onderkoeling via transcardiale overvloed met een ijskoude oplossing. Met enige praktijk, zullen onderzoekers in staat zijn om betrouwbaar uit te voeren deze stap. Begin met het voorbereiden van een liter aCSF-oplossing voor de herstelkamer en de daaropvolgende opnames.Bereid vervolgens 300 milliliter NMDG-aCSF voor op de transcardiale overdaad en snijstappen. Plaats de trillende microtome snijlade en montageschijf in een min 20 graden Celsius vriezer. Om de herstelkamer voor te bereiden, vul deze tot net boven het slice holding mesh en start de bubbler houden van de kamer op de bank op kamertemperatuur.Chill de volledige 300 milliliter NMDG-aCSF in een vriezer tot ijskristallen beginnen te vormen op het oppervlak en de wanden van de fles. Plaats de fles met gekoelde en NMDG-aCSF op ijs en bel het, waardoor de oplossing tussen nul en twee graden Celsius blijft. Haal de weefselbevestigingsschijf uit de vriezer en veeg het droog, indien nodig.Knip een blok van 5% agar over de grootte van een muis hersenen en lijm het in het midden van de schijf met behulp van een dunne laag cyanoacrylaat lijm. Plaats de schijf met gelijmde agar op ijs en bedek het met papieren handdoeken tot klaar voor gebruik. Haal de snijlade uit de vriezer, plaats het in de microtome, dan omringen met ijs en laad het mes.Bereid alle tools van tevoren voor de hersendissectie. Zet de peristaltische pomp voor transcardiale perfusie. Steek de ene kant van de pompslang in de fles met ijs NMDG-aCSF en pas de andere kant met een naald van 27 meter.Stel de pompsnelheid in op ongeveer 3,5 milliliter per minuut. Met deze snelheid is de uitstroom van een NMDG-aCSF een snelle reis, geen continue stroom. Plaats de muis op zijn rug op een luier.Voordat u verdergaat, bevestigd dat de muis zich in een chirurgisch vlak van anesthesie bevindt door een teensnufje uit te voeren. De muis moet niet reageren, vervolgens afgeplakt zijn voor-en achterpoten, zodat de borst en buik worden blootgesteld. Snijd een groot stukje van de huid op de borst, gaande van onder het borstbeen naar de keel.Pak het borstbeen met tangen, til het voorzichtig op en begin aan beide kanten door de ribbenkast te snijden totdat de borstholte wordt blootgelegd. Snijd door het middenrif, waardoor de flap van de ribbenkast bevestigd via een dun stukje spier. Het moet mogelijk zijn om het opzij te zetten zonder dat het terugvallen op de blootgestelde borstholte.Controleer of het hart nog steeds klopt en zorg ervoor dat het grootste deel van de lever zichtbaar is. Steek de naald in de linker ventrikel, die ziet er lichter in kleur dan rechts. Om de naald te stabiliseren, rijdt u ermee door de resterende ribben aan de linkerkant van het lichaam.Zoek het donkerrood gekleurde rechteratrium en snijd er met een kleine schaar doorheen. Het bloed moet beginnen te stromen. Start de pomp en observeer de lever, die van kleur verandert van rood naar bruin.Controleer de leverkleur en ga door met perfusie totdat de lever lichtbruin wordt. Voer de pomp nog een paar minuten uit. De lichaamstemperatuur van het dier moet dalen tot 28 tot 29 graden Celsius en de neus moet koud aan.Onthoofd de muis met een grote onthoofdingsschaar en gebruik vervolgens een scalpel met een nummer 10-mes om de huid op de bovenkant van de schedel open te snijden. Met een kleine schuine schaar, snijd de schedel op de middellijn. Gebruik vervolgens de nummer drie tangen om de rechter en linker helften van de schedel weg te wrikken, voorzichtig te zijn om de dura mee te nemen.Verwijder de hersenen, die een off-white kleur moet zijn door het eruit te scheppen met een spatel en laat het in de NMDG-aCSF oplossing op ijs. Laat het daar voor maximaal een minuut. Haal de hersenen uit de NMDG-aCSF en plaats het op een stuk filterpapier.Snijd en verwijder een 60 graden wig van weefsel met een 60 graden gereedschap gecentreerd op de middellijn van het rostrale uiteinde van de voorhersenen. Gebruik de gesneden zijkanten van het montageoppervlak omdat het de juiste hoek biedt voor hippocampale plakjes. Scheid de hemisferen in de middellijn met de scalpel en lijm ze op de montageschijf.Neem de montageschijf van het ijs en veeg het droog, indien nodig. Dan lijm elke hemisfeer in de voorkant van de agar blok, snijd kant naar beneden. Zorg ervoor dat de ventrale zijkanten van beide hemisferen het agarblok raken en dat de rugzijden van beide hemisferen naar het blad gericht zijn.Wanneer gelijmd op de snijkant, moet elke hemisfeer worden georiënteerd ten opzichte van het blad op een manier die zorgt voor dwarse plakjes van de rug hippocampus in situ. Dompel de schijf met de hemisferen onder in een snijkamer met ijskoude carbogenated NMDG-aCSF. Snijd een 400 micrometer sectie, gebruik dan een wegwerp transfer pipet met een cutoff tip om de slice over te dragen aan een herstelkamer met carbogenated NMDG-aCSF bij kamertemperatuur.Blijf de rest van de secties snijden en breng ze naar de herstelkamer en neem niet meer dan 10 minuten om in totaal acht tot tien plakjes uit de rug hippocampus regio te snijden. Incubeer de plakjes bij kamertemperatuur ongeveer twee uur voor de opname. Dit protocol werd gebruikt om hippocampal plakjes van volwassen muizen te genereren.Grote aantallen piramidale cellen in het CA1-veld en subiculum verschijnen in een laag contrast, een kenmerk van gezonde cellen, wanneer waargenomen onder infrarood differentiaal contrast microscopie. Patch-clamp opnames kunnen worden verkregen uit CA1 neuronen van muizen die meer dan zes maanden oud. In het voorbeeldexperiment hier werd de frequentie van miniatuur excitatory postsynaptic stromen gemeten nadat NMDA-LTD werd geïnduceerd ten opzichte van de controleomstandigheden.De frequentie van miniatuur excitatory postsynaptic stromen was lager in neuronen na een NMDA-LTD inductie, wat aangeeft activiteit afhankelijk snoeien van synopses in CA1. Veranderingen in amplitude werden niet gedetecteerd. Tijdens mEPSC opnames, CA1 cellen werden ook gevuld biocytine en intacte dendritische prieel en gezonde cel habitus van de piramidale neuronen kan hier worden gezien.Een robuuste verdeling van de fluorescerende kleurstof door de cel maakt analyse van dendrieten en dendritische stekels onder verschillende omstandigheden mogelijk. Langdurige potentiëring, of LTP, van CA3-CA1 synapsen van ongeveer 170% werd waargenomen, wat suggereert dat het onderhoud van signaleringscascade's die nodig zijn voor LTP aanwezig is in plakjes die zijn bereid van volwassen muizen. Een robuust veld excitatory postsynaptic potentieel signaal suggereert dat netwerkconnectiviteit ook werd bewaard.Twee kritieke aspecten van het protocol zijn transcardiale overvloed met een ijskoude oplossing om onderkoeling en introductie van een NMDG als natriumionvervanger in oplossingen te veroorzaken om cytoxisch oedeem te voorkomen. Met behulp van deze voorzorgsmaatregelen, acute plakjes kunnen worden voorbereid uit elk hersengebied. Bovendien kunnen op deze manier bereide plakjes worden gebruikt voor calcium- en spanningsbeeldvorming met behulp van tweefoton of breedveldmicroscopie.Dit protocol zou kunnen dienen als basis voor een gestandaardiseerde voorbereiding op acute hippocampale plakjes van oudere dieren en zo vergelijkingen tussen studies in de context van neurodegeneratieve ziektemechanismen vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Voorbereiding van oligomere β-amyloïde 1-42 En Inductie van synaptische plasticiteit Waardevermindering op hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Continu video-elektro-encefalogram tijdens hypoxie-ischemie bij neonatale muizen

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...