Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Je remercie la Dre Carla J. Shatz pour ses conseils et leur soutien, ainsi que la Dre Barbara K. Brott et Michelle K. Drews d’avoir lu le manuscrit de façon critique. Les travaux sont soutenus par les NIH EY02858 et les subventions de la Fondation de bienfaisance Mathers à CJS.

Le protocole est réalisé conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health et approuvé par le Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Les méthodes sont également conformes aux politiques de la Society for Neuroscience on the Use of Animals and Humans in Neuroscience Research.
REMARQUE : Toutes les souris ont été maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Des souris de type sauvage sur des ant...

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	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Le protocole décrit ici démontre que les tranches hippocampales obtenues à partir de souris adultes et vieillissantes peuvent rester en bonne santé et viables pendant de nombreuses heures après la coupe. Les tranches préparées à l’aide de ce protocole sont appropriées pour les enregistrements de pinces à patch, ainsi que les enregistrements de terrain de longue durée dans les régions CA1.
Il y a deux étapes critiques dans ce protocole. La première étape est l’étape de perfu...

L’avènement des préparations aiguës de tranches cérébrales des mammifères a facilité des expériences au niveau cellulaire et synaptique qui n’étaient auparavant possibles que dans les préparations d’invertébrés comme l’Aplysia1. Le développement de tranches hippocampales aiguës était d’une importance particulière, car il s’agit d’une structure responsable de la mémoire de travail et de la formation de contexte, et dispose d’un circuit tri-synaptique spécialisé qui est susceptible de manipulation physiologique facile. Cependant, la grande majorité des tranches cérébrales aiguës sont encore préparées à partir de souris et de rats relativement jeunes, car il est plus facile de préserver les neurones et les circuits sains, et les tranches restent viables pendant de plus longues périodes de temps2,3,4. Ici, nous introduisons des modifications aux protocoles de tranchage standard qui se traduisent par une viabilité accrue des tranches hippocampales aiguës des souris adultes et vieillissantes.
Le principal obstacle à la viabilité ex vivo à long terme du parenchyme cérébral des mammifères est les dommages hypoxiques initiaux qui se produisent rapidement une fois que le flux sanguin vers le cerveau cesse après la décapitation. La perte d’oxygène entraîne une consommation métabolique rapide de ressources énergétiques importantes dans le cerveau avec la perte de phospho-créatine (P-créatine) étant la plus rapide, suivie par le glucose, l’adénosine triphosphate (ATP), et le glycogène4. La préservation de l’ATP est d’une importance particulière pour la santé à long terme des tranches de cerveau, comme ATP est nécessaire pour maintenir le potentiel de la membrane via le Na-K ATPase, et par conséquent l’activité neuronale5,6. Le niveau d’ATP dans le cerveau adulte de rongeur est ~2.5 mM, et il tombe précipitamment dans 20 s de décapitation pour atteindre un état stable basal (~0.5 mM) à environ 1 min post-décapitation4,7,8. Chez les jeunes animaux, il faut plus de temps pour observer la même baisse de l’ATP (~2 min); avec anesthésie phénobarbitale, il est encore ralenti à 4 min4. Ces considérations montrent que la prévention de la perte d’ATP et d’autres ressources énergétiques est une stratégie nécessaire pour prévenir les dommages hypoxiques au cerveau et à son tour pour maintenir la santé des tranches de cerveau sur de plus longues périodes de temps, en particulier chez les animaux adultes.
Les basses températures ralentissent le métabolisme. Par conséquent, il a été démontré que l’hypothermie modeste protège les réserves d’énergie du cerveau: chez les jeunes animaux, abaissant la température corporelle de six degrés, de 37 °C à 31 °C, préserve les niveaux d’ATP à environ 80% des niveaux normaux de plus de 4 h d’hypoxie contrôlée9. Les niveaux de p-créatine sont également préservés, ainsi que le potentiel global de phosphorylation9. Ceci suggère que l’abaissement de la température du corps avant la décapitation pourrait être neuroprotecteur, car des niveaux presque normaux d’ATP pourraient être maintenus par les périodes de découpage et de récupération de tranche.
Dans la mesure où une baisse d’ATP ne peut pas être complètement empêchée lors de la décapitation, on s’attend à une fonction partiellement altérée de l’ATPase Na-K, suivie d’une dépolarisation par l’afflux passif de sodium. Comme l’afflux passif de sodium est suivi par l’entrée de l’eau dans les cellules, il provoque l’œdème cytotoxique et éventuellement la pyknose. Chez les rats adultes, le remplacement des ions Na+ par du saccharose dans des solutions de coupe de tranches a été une stratégie réussie pour alléger le fardeau de l’œdème cytotoxique10,11. Plus récemment, les cations organiques méthylées qui diminuent la perméabilité des canaux de sodium12 ont montré qu’elles offrent une protection plus efficace que le saccharose, en particulier dans les tranches de souris adultes, le N-méthyl-D-glucamine (NMDG) étant le plus largement applicable à différents âges et régions du cerveau13,14,15,16.
De nombreux protocoles de coupe du cerveau impliquent l’utilisation de températures froides seulement pendant l’étape de coupe de tranches, parfois en combinaison avec la stratégie de remplacement de Na+ ion16,17. Chez les jeunes animaux, ces protocoles semblent offrir une neuroprotection suffisante puisque les cerveaux peuvent être extraits rapidement après la décapitation parce que le crâne est encore mince et facile à enlever3. Cependant, cette stratégie ne produit pas de tranches saines d’animaux adultes. Au fil du temps, un certain nombre de laboratoires d’étude des rongeurs adultes ont introduit la perfusion transcardique avec une solution glacée pour diminuer la température corporelle de l’animal, et donc des dommages hypoxiques au cerveau, avant la décapitation. Cette procédure a été appliquée avec succès pour produire des tranches de cérebelaire18, tranches de midbrain19, tranches néocorticales11,20, cortex périrhinal21, hippocampe rat10,22,23, ampoule olfactive24, striatum ventral25, cortex visuel26.
En dépit des avantages offerts par la perfusion transcardique et le remplacement de Na+ ion dans la préparation des tranches de rat et dans certaines régions du cerveau chez la souris, l’hippocampe souris reste l’un des domaines les plus difficiles à protéger de l’hypoxie13,20. À ce jour, l’une des approches les plus courantes pour trancher l’hippocampe à partir de souris vieillissantes et de modèles de souris de neurodégénérescence implique le tranchage rapide classique de l’hippocampe isolé27. Dans le protocole décrit ici, nous minimisons la perte d’ATP dans le cerveau adulte en introduisant l’hypothermie avant la décapitation par transcardially perfuser l’animal avecna+ glacé - fluide céphalo-rachidien artificiel à base de NMDG libre (NMDG-aCSF). Les tranches sont ensuite coupées en Na+-free NMDG-aCSF. Avec ce protocole amélioré, nous obtenons des tranches hippocampales aiguës de souris adultes et vieillissantes qui sont en bonne santé jusqu’à 10 h après le tranchage et sont appropriés pour les enregistrements de terrain à long terme et les études de patch-clamt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Les tranches hippocampales aiguës ont permis à des générations de neuroscientifiques d’explorer en détail les propriétés synaptiques, neuronales et de circuits et avec une haute fidélité. L’exploration des mécanismes de LTP et de LTD, le calcul dendritique de neurone simple, et les changements d’expérience-dépendant dans les circuits, n’aurait pas été possible sans cette préparation classique. Cependant, à quelques exceptions près, la plupart des recherches fondamentales utilisant des tranches hippocampales aiguës ont été effectuées à l’aide de tranches de rongeurs d’âges relativement jeunes, ~P20-P40, même si les mécanismes synaptiques et intrinsèques d’excitabilité ont une longue queue de développement qui atteint le P60. L’attrait principal de l’utilisation de jeunes tranches hippocampales est la préservation de la santé neuronale facilitée par une plus grande tolérance aux dommages hypoxiques. Cependant, il est nécessaire de comprendre la fonction neuronale à des stades plus matures du développement, accentué par le développement de divers modèles animaux de maladies neurodégénératives qui nécessitent une préparation du cerveau vieillissant. Ici, nous décrivons une modification à une préparation aiguë de tranche hippocampal qui fournit de manière fiable des tranches saines de l’adulte et le vieillissement hippocampe souris. Les étapes critiques du protocole sont la perfusion transcardique et la coupe avec nmdg-aSCF sans sodium sans glace. Ensemble, ces étapes atténuent la baisse induite par l’hypoxie dans l’ATP lors de la décapitation, ainsi que l’œdème cytotoxique provoqué par les flux passifs de sodium. Nous montrons comment couper les tranches transversales de l’hippocampe plus le cortex à l’aide d’un microtome vibrant. Les tranches hippocampales aiguës obtenues de cette façon sont fiables et saines pendant de nombreuses heures d’enregistrement, et sont appropriées pour les enregistrements sur le terrain et les enregistrements ciblés de correction-clamp, y compris le ciblage des neurones fluorescents étiquetés.

Nous avons appliqué le protocole ci-dessus pour générer des tranches d’hippocampe de CamKIIa-Cre+; Souris WT sur un fond génétique mixte C57Bl/ 6 x SV/ 129J, à P > 120. Un grand nombre de cellules pyramidales dans le champ CA1 (figure 2A) et le subiculum (figure 2B) apparaissent en contraste faible lorsqu’elles sont observées sous microscopie différentielle de contraste infrarouge (IR-DIC), une caractéristique des cellules saines dans une préparati...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Il s’agit d’un protocole pour la préparation des tranches aiguës de l’adulte et le vieillissement hippocampi souris qui tire parti de la perfusion transcardique et la coupe de tranches avec la glace-froid NMDG-aCSF pour réduire les dommages hypoxiques au tissu. Les tranches qui en résultent restent en bonne santé pendant de nombreuses heures et conviennent aux corrections à long terme et aux enregistrements sur le terrain.

Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Le protocole présenté ici diminue les dommages hypoxiques excessifs pendant la préparation des tranches hippocampal adultes et vieillissantes de souris, éliminant ainsi un obstacle majeur pour étudier la fonction des circuits neuronaux mûrs et vieillissants. L’introduction de l’hypothermie dans les solutions sans sodium entraîne des tranches hippocampiques qui sont en bonne santé jusqu’à 10 heures après la coupe et appropriées pour les enregistrements sur le terrain à long terme et les études patch-clamp. Cette méthode de préparation des tranches hippocampiques pourrait être particulièrement pertinente pour les modèles animaux dans les maladies neurodégénératives qui, par définition, nécessitent une préparation vieillissante du cerveau.L’étape la plus critique de ce protocole est l’introduction de l’hypothermie par profusion transcardique avec une solution glacée. Avec une certaine pratique, les chercheurs seront en mesure d’exécuter cette étape de manière fiable. Commencez par préparer un litre de solution aCSF pour la chambre de récupération et les enregistrements ultérieurs.Préparez ensuite 300 millilitres de NMDG-aCSF pour la profusion transcardique et les étapes de coupe. Placez le plateau vibrant de coupe de microtome et le disque de montage dans un congélateur de moins 20 degrés Celsius. Pour préparer la chambre de récupération, remplissez-la juste au-dessus de la maille de fixation de tranche et commencez le bubbler gardant la chambre sur le banc à température ambiante.Réfrigérer les 300 millilitres entiers de NMDG-aCSF dans un congélateur jusqu’à ce que des cristaux de glace commencent à se former à la surface et sur les parois de la bouteille. Placez la bouteille avec réfrigérée et NMDG-aCSF sur la glace et bouillonnez-la, en gardant la solution entre zéro et deux degrés Celsius. Sortez le disque de montage tissulaire du congélateur et essuyez-le à sec, si nécessaire.Découpez un bloc de 5% d’agar de la taille d’un cerveau de souris et collez-le au centre du disque à l’aide d’une fine couche de colle cyanoacrylate. Placez le disque avec une agar collée sur la glace et couvrez-le avec du papier absorbant jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Sortez le plateau de coupe du congélateur, placez-le dans la microtome, puis entourez-le de glace et chargez la lame.Préparez tous les outils à l’avance pour la dissection du cerveau. Installez la pompe périssaltique pour la perfusion transcardique. Insérez un côté du tube de pompe dans la bouteille avec du NMDG-aCSF glacé et adaptez l’autre côté avec une aiguille de calibre 27.Réglez la vitesse de la pompe à environ 3,5 millilitres par minute. À cette vitesse, la sortie d’un NMDG-aCSF est un voyage rapide, pas un flux continu. Placez la souris sur le dos sur une couche.Avant de continuer, a confirmé que la souris est à un plan chirurgical de l’anesthésie en effectuant une pincement des pieds. La souris doit être insensible, puis scotchée sur ses pattes avant et arrière afin que la poitrine et l’abdomen soient exposés. Découpez une grande tache de la peau sur la poitrine, allant du dessous du sternum à la gorge.Prenez le sternum avec des forceps, soulevez-le doucement et commencez à couper à travers la cage thoracique des deux côtés jusqu’à ce que la cavité thoracique soit exposée. Couper à travers le diaphragme, en laissant le rabat de la cage thoracique attachée par un mince morceau de muscle. Il devrait être possible de le mettre de côté sans le faire retoissez sur la cavité thoracique exposée.Vérifiez que le cœur bat encore et assurez-vous que la majeure partie du foie est visible. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche, qui semble plus léger en couleur que la droite. Pour stabiliser l’aiguille, conduisez-la à travers les côtes restantes sur le côté gauche du corps.Localisez l’atrium droit de couleur rouge foncé et coupez-le à l’aide de petits ciseaux. Le sang devrait commencer à couler. Démarrez la pompe et observez le foie, qui changera de couleur du rouge au brun.Surveillez la couleur du foie et continuez la perfusion jusqu’à ce que le foie brun pâle. Faire fonctionner la pompe encore quelques minutes. La température corporelle de l’animal devrait tomber à 28 à 29 degrés Celsius et son nez doit être froid au toucher.Décapiter la souris avec de grands ciseaux de décapitation, puis utiliser un scalpel avec une lame numéro 10 pour ouvrir la peau sur le dessus du crâne. Avec de petits ciseaux inclinés, couper le crâne à la ligne médiane. Ensuite, utilisez les trois forceps numéro trois pour éloigner les moitiés droite et gauche du crâne, en prenant soin de prendre le dura loin avec elle.Retirez le cerveau, qui devrait être d’une couleur blanc éteint en le ramassant à l’aide d’une spatule et déposez-le dans la solution NMDG-aCSF sur la glace. Laissez-le là jusqu’à une minute. Sortez le cerveau du NMDG-aCSF et placez-le sur un morceau de papier filtre.Couper et enlever un coin de tissu de 60 degrés avec un outil à 60 degrés centré à la ligne médiane de l’extrémité rostrale du cerveau antérieur. Utilisez les côtés coupés de la surface de montage car il fournit l’angle approprié pour les tranches hippocampiques. Séparez les hémisphères vers le bas de la ligne médiane avec le scalpel et collez-les sur le disque de montage.Prenez le disque de montage de la glace et essuyez-le à sec, si nécessaire. Collez ensuite chaque hémisphère devant le bloc d’agar, coupez le côté vers le bas. Assurez-vous que les côtés ventraux des deux hémisphères touchent le bloc d’agar et que les côtés dorsal des deux hémisphères font face à la lame.Lorsqu’il est collé sur le côté coupé, chaque hémisphère doit être orienté par rapport à la lame d’une manière qui assure des tranches transversales de l’hippocampe dorsale in situ. Submergez le disque avec les hémisphères dans une chambre de coupe contenant du NMDG-aCSF carbogenated glacé. Couper une section de 400 micromètres, puis utiliser une pipette de transfert jetable avec une pointe de coupure pour transférer la tranche dans une chambre de récupération contenant du NMDG-aCSF carbogenated à température ambiante.Continuez à couper le reste des sections et à les transférer à la chambre de récupération en ne prenant pas plus de 10 minutes pour couper un total de huit à dix tranches de la région dorsale de l’hippocampe. Incuber les tranches à température ambiante pendant environ deux heures avant l’enregistrement. Ce protocole a été utilisé pour générer des tranches hippocampiques à partir de souris adultes.Un grand nombre de cellules pyramidales dans le champ CA1 et subiculum apparaissent en faible contraste, une caractéristique des cellules saines, lorsqu’elles sont observées sous microscopie à contraste différentiel infrarouge. Les enregistrements patch-clamp peuvent être obtenus à partir de neurones CA1 de souris âgées de plus de six mois. Dans l’exemple d’expérience ici, la fréquence des courants postsynaptiques excitateurs miniatures a été mesurée après que NMDA-LTD ait été induit par rapport aux conditions de contrôle.La fréquence des courants postsynaptiques excitatifs miniatures était plus faible dans les neurones après une induction de NMDA-LTD, indiquant l’élagage dépendant de l’activité des synopses dans CA1. Des changements dans l’amplitude n’ont pas été détectés. Au cours des enregistrements mEPSC, les cellules CA1 ont également été remplies de biocytine et intacte tonnelle dendritique et habitus cellulaire sain des neurones pyramidaux peuvent être vus ici.Une distribution robuste du colorant fluorescent dans toute la cellule permet l’analyse des dendrites et des épines dendritiques dans différentes conditions. Une potentialisation à long terme, ou LTP, des synapses CA3-CA1 d’environ 170 % a été observée, ce qui suggère que le maintien des cascades de signalisation nécessaires au LTP est présent dans les tranches préparées à partir de souris adultes. Un signal potentiel excitateur robuste sur le terrain suggère que la connectivité réseau a également été préservée.Deux aspects critiques du protocole sont la profusion transcardique avec une solution glacée pour induire l’hypothermie et l’introduction d’un NMDG comme substitut d’ion de sodium dans des solutions pour empêcher l’oedème cytotoxique. En utilisant ces précautions, des tranches aiguës peuvent être préparées à partir de n’importe quelle région du cerveau. En outre, les tranches préparées de cette manière peuvent être utilisées pour l’imagerie par calcium et tension à l’aide d’une microscopie à deux photons ou à champ large.Ce protocole pourrait servir de base à une préparation normalisée pour les tranches hippocampiques aiguës des animaux vieillissants et ainsi faciliter des comparaisons entre les études dans le contexte des mécanismes neurodegenerative de maladie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Recherche

Neurosciences

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l&#39;aide aiguë coupes d&#39;hippocampe des rongeurs

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Préparation de tranches d’hippocampe humaine aiguë pour les enregistrements électrophysiologiques

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Électroencéphalogramme vidéo continu pendant l’hypoxie-ischémie chez les souris néonatales

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...