Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Ich danke Dr. Carla J. Shatz für ihre Beratung und Unterstützung und Dr. Barbara K. Brott und Michelle K. Drews für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wird von NIH EY02858 und der Mathers Charitable Foundation an CJS unterstützt.

Das Protokoll wird in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Die Methoden entsprechen auch der Politik der Gesellschaft für Neurowissenschaften über den Einsatz von Tieren und Menschen in der neurowissenschaftlichen Forschung.
HINWEIS: Alle Mäuse wurden in einer pathogenenfreien Umgebung gehalten. Wildtyp-Mäuse auf gem...

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	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll zeigt, dass Hippocampus-Scheiben, die von erwachsenen und alternden Mäusen erhalten werden, nach dem Schneiden für viele Stunden gesund und lebensfähig bleiben können. Die mit diesem Protokoll vorbereiteten Slices eignen sich für Patch-Clamp-Aufnahmen sowie für langlebige Feldaufnahmen in den CA1-Regionen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei wichtigen Schritten. Der erste Schritt ist der transkardiale Perfusionsschritt mit einer eiskalten Lösung. Schnelle B...

Das Aufkommen von akuten Hirnscheibenpräparaten von Säugetieren erleichterte Experimente auf zellulärer und synaptischer Ebene, die bisher nur in wirbellosen Präparaten wie Aplysia1möglich waren. Die Entwicklung von akuten Hippocampus-Scheiben war von besonderer Bedeutung, da es sich um eine Struktur handelt, die für die Arbeitsgedächtnis- und Kontextbildung verantwortlich ist, und eine spezialisierte tri-synaptische Schaltung hat, die für eine einfache physiologische Manipulation zugänglich ist. Jedoch, die überwiegende Mehrheit der akuten Gehirnscheiben sind immer noch von relativ jungen Mäusen und Ratten vorbereitet, da es einfacher ist, gesunde Neuronen und Schaltkreise zu erhalten, und die Scheiben bleiben lebensfähig für längere Zeit2,3,4. Hier führen wir Änderungen an Standard-Slicing-Protokollen ein, die zu einer erhöhten Lebensfähigkeit von akuten Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen führen.
Das Haupthindernis für die langfristige Ex-vivo-Lebensfähigkeit des Säugetierhirnparenchyms ist die anfängliche hypoxische Schädigung, die schnell auftritt, sobald der Blutfluss zum Gehirn nach der Enthauptung aufhört. Der Verlust von Sauerstoff führt zu einem schnellen metabolischen Verbrauch wichtiger Energieressourcen im Gehirn, wobei der Verlust von Phospho-Kreatin (P-Kreatin) am schnellsten ist, gefolgt von Glukose, Adenosintriphosphat (ATP) und Glykogen4. Die Erhaltung von ATP ist von besonderer Bedeutung für die langfristige Gesundheit von Hirnscheiben, da ATP benötigt wird, um das Membranpotenzial über die Na-K ATPase und damit die neuronale Aktivität5,6zu erhalten. Der ATP-Spiegel im erwachsenen Nagetierhirn beträgt 2,5 mM, und er fällt steil innerhalb von 20 s der Enthauptung ab, um einen basalen stationären Zustand (0,5 mM) bei etwa 1 min nach der Enthauptung4,7,8zu erreichen. Bei Jungtieren dauert es länger, den gleichen Rückgang der ATP zu beobachten (ca. 2 min); mit Phenobarbitalanästhesie wird es weiter auf 4 min4verlangsamt. Diese Überlegungen zeigen, dass die Verhinderung des Verlusts von ATP und anderen Energieressourcen eine notwendige Strategie ist, um hypoxische Schädigungen des Gehirns zu verhindern und im Gegenzug die Gesundheit von Gehirnscheiben über längere Zeiträume, insbesondere bei erwachsenen Tieren, aufrechtzuerhalten.
Niedrige Temperaturen verlangsamen den Stoffwechsel. Daher wurde nachgewiesen, dass eine bescheidene Unterkühlung die Energiereserven des Gehirns schützt: Bei Jungen Tieren, die die Körpertemperatur um sechs Grad von 37 °C auf 31 °C senken, bleibt der ATP-Gehalt auf etwa 80 % des normalen Niveaus über 4 h der kontrollierten Hypoxie9erhalten. Die P-Kreatin-Spiegel sind in ähnlicher Weise erhalten, ebenso wie das Gesamtphosphorylierungspotential9. Dies deutet darauf hin, dass die Senkung der Körpertemperatur vor der Enthauptung neuroprotektive sein könnte, da fast normale NIVEAUS von ATP durch die Schnitt- und Slice-Recovery-Perioden aufrechterhalten werden könnten.
In dem Maße, in dem ein ATP-Tropfen bei Enthauptung nicht vollständig verhindert werden kann, wird eine teilweise beeinträchtigte Funktion des Na-K ATPase erwartet, gefolgt von einer Depolarisation über passiven Natriumzufluss. Da auf den passiven Natriumzufluss wasserdurchströmt wird, verursacht er zytotoxische Ödeme und schließlich Pyknose. Bei erwachsenen Ratten war das Ersetzen von Na+-Ionen durch Saccharose in Slice-Cutting-Lösungen eine erfolgreiche Strategie, um die Belastung durch zytotoxische Ödeme zu lindern10,11. In jüngerer Zeit haben methylierte organische Kationen, die die Natriumkanaldurchlässigkeit12 verringern, gezeigt, dass sie einen wirksameren Schutz als Saccharose bieten, insbesondere in Scheiben von erwachsenen Mäusen, wobei N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) in verschiedenen Altersgruppen und Gehirnregionen am weitesten verbreitet ist13,14,15,16.
Zahlreiche Brain-Slicing-Protokolle beinhalten die Verwendung kalter Temperaturen nur während des Slice-Cutting-Schritts, manchmal in Kombination mit DerN+ Ionen-Ersatzstrategie16,17. Bei Jungen Tieren scheinen diese Protokolle ausreichend Neuroprotektion zu bieten, da die Gehirne nach der Enthauptung schnell extrahiert werden können, da der Schädel noch dünn und leicht zu entfernen ist3. Diese Strategie produziert jedoch keine gesunden Scheiben von erwachsenen Tieren. Im Laufe der Zeit haben eine Reihe von Laboratorien, die erwachsene Nagetiere untersuchen, eine transkardiale Perfusion mit einer eiskalten Lösung eingeführt, um die Körpertemperatur des Tieres und damit hypoxische Schädigungen des Gehirns vor der Enthauptung zu verringern. Dieses Verfahren wurde erfolgreich angewendet, um Kleinhirnscheiben18, Midbrain Scheiben19, neokortikale Scheiben11,20, perirhinal cortex21, rat hippocampus10,22,23, olfaktorische Glühbirne24, ventrales Striatum25, visuelle Kortex26.
Trotz der Vorteile, die die transkardiale Perfusion und der Na+ Ionenersatz bei der Vorbereitung von Scheiben von Ratten und in einigen Hirnregionen bei Mäusen bieten, bleibt der Hippocampus der Maus einer der schwierigsten Bereiche, um vor Hypoxie zu schützen13,20. Bis heute beinhaltet einer der häufigsten Ansätze, Hippocampus aus alternden Mäusen und Mausmodellen der Neurodegeneration zu schneiden, das klassische schnelle Schneiden des isolierten Hippocampi27. In dem hier beschriebenen Protokoll minimieren wir den Verlust von ATP im erwachsenen Gehirn, indem wir Hypothermie vor der Enthauptung einführen, indem wir das Tier transkardial mit eiskaltem Na+- freier künstlicher NMDG-basierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (NMDG-aCSF) durchdringen. Die Scheiben werden dann in eiskalten Na+-free NMDG-aCSF geschnitten. Mit diesem verbesserten Protokoll erhalten wir akute Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen, die nach dem Schneiden bis zu 10 h gesund sind und für langzeitige Feldaufnahmen und Patch-Clamp-Studien geeignet sind.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Akute Hippocampus-Scheiben haben es Generationen von Neurowissenschaftlern ermöglicht, synaptische, neuronale und Schaltkreiseigenschaften im Detail und mit hoher Genauigkeit zu erforschen. Die Erforschung von LTP- und LTD-Mechanismen, eine einzelne neurondendritische Berechnung und erfahrungsabhängige Veränderungen in den Schaltkreisen wären ohne diese klassische Zubereitung nicht möglich gewesen. Jedoch, mit wenigen Ausnahmen, die meisten Grundlagenforschung mit akuten Hippocampus Scheiben wurde mit Scheiben von Nagetieren relativ jungen Alters durchgeführt, P20-P40, obwohl synaptische und intrinsische Erregbarkeitsmechanismen haben einen langen Entwicklungsschwanz, der über P60 reicht. Der Hauptreiz der Verwendung von jungen Hippocampus-Scheiben ist die Erhaltung der neuronalen Gesundheit durch höhere Toleranz gegenüber hypoxischen Schäden unterstützt. Es ist jedoch notwendig, die neuronale Funktion in reiferen Entwicklungsstadien zu verstehen, was durch die Entwicklung verschiedener Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen, die eine alternde Gehirnpräparation erfordern, noch verstärkt wird. Hier beschreiben wir eine Modifikation zu einem akuten Hippocampus-Scheibenpräparat, das zuverlässig gesunde Scheiben von erwachsenen und alternden Maus-Hippocampi liefert. Die entscheidenden Schritte des Protokolls sind die transkardiale Perfusion und das Schneiden mit eiskaltem natriumfreiem NMDG-aSCF. Zusammen dämpfen diese Schritte den Hypoxie-induzierten Rückgang des ATP bei enthauptender Enthauptung sowie zytotoxische Ödeme, die durch passive Natriumflüsse verursacht werden. Wir zeigen, wie man transversale Scheiben von Hippocampus plus Kortex mit einem vibrierenden Mikrotom schneidet. Akute Hippocampus-Scheiben, die auf diese Weise erhalten werden, sind über viele Stunden der Aufnahme zuverlässig gesund und eignen sich sowohl für Feldaufnahmen als auch für gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen, einschließlich der Ausrichtung auf fluoreszierend markierte Neuronen.

Wir haben das obige Protokoll angewendet, um Hippocampus-Slices aus CamKIIa-Cre+ zu erzeugen; WT-Mäuse mit gemischtem genetischem Hintergrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, bei P > 120. Eine große Anzahl von Pyramidenzellen im CA1-Feld (Abbildung 2A) und Subikulum (Abbildung 2B) erscheinen in geringem Kontrast, wenn sie unter infraroter Differentialkontrastmikroskopie (IR-DIC) beobachtet werden, einem Kennzeichen gesunder Zellen in einer Scheibenpräparation. Mit dieser...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Das hier vorgestellte Protokoll verringert übermäßige hypoxische Schäden bei der Vorbereitung von hippocampuslen Scheiben der Erwachsenen und der alternden Maus, wodurch ein großes Hindernis für die Untersuchung der Funktion reifer und alternder neuronaler Schaltkreise beseitigt wird. Die Einführung der Hypothermie in natriumfreien Lösungen führt zu Hippocampusscheiben, die bis zu 10 Stunden nach dem Schneiden gesund sind und sowohl für die Langzeit-Feldaufnahmen als auch für Patch-Clamp-Studien geeignet sind. Diese Methode zur Herstellung von Hippocampus-Scheiben könnte besonders für Tiermodelle bei neurodegenerativen Erkrankungen relevant sein, die per definitionem eine alternde Gehirnpräparation erfordern.Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Einführung von Hypothermie über transkardiale Profusion mit einer eiskalten Lösung. Mit einigen Praktiken werden Forscher in der Lage sein, diesen Schritt zuverlässig auszuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Liters einer CSF-Lösung für die Rückgewinnungskammer und nachfolgende Aufnahmen.Dann bereiten 300 Milliliter NMDG-aCSF für die transkardialen Überfluss- und Schneidschritte vor. Legen Sie das vibrierende Mikrotom-Schneidtablett und die Montagescheibe in einen Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius. Um die Rückgewinnungskammer vorzubereiten, füllen Sie sie bis knapp über der Scheibe, die Mesh hält, und starten Sie die Blase, die die Kammer auf der Bank bei Raumtemperatur hält.Kühlen Sie die gesamten 300 Milliliter NMDG-aCSF in einem Gefrierschrank ab, bis sich Eiskristalle an der Oberfläche und an den Wänden der Flasche zu bilden beginnen. Die Flasche mit gekühltem und NMDG-aCSF auf Eis legen und blasen, wobei die Lösung zwischen null und zwei Grad Celsius bleibt. Nehmen Sie die Gewebemontagescheibe aus dem Gefrierschrank und wischen Sie sie bei Bedarf trocken.Schneiden Sie einen Block von 5%Agar über die Größe eines Mausgehirns aus und kleben Sie ihn in der Mitte der Scheibe mit einer dünnen Schicht Cyanoacrylatkleber. Legen Sie die Scheibe mit geklebtem Agar auf Eis und bedecken Sie sie mit Papiertüchern, bis sie einsatzbereit ist. Nehmen Sie die Schneidschale aus dem Gefrierschrank, legen Sie sie in das Mikrotom, dann umgeben Sie es mit Eis und laden Sie die Klinge.Bereiten Sie alle Werkzeuge im Voraus für die Gehirnsektion vor. Richten Sie die peristaltische Pumpe für die transkardiale Perfusion ein. Legen Sie eine Seite des Pumpenschlauchs mit vereistem NMDG-aCSF in die Flasche ein und passen Sie die andere Seite mit einer 27-Spur-Nadel an.Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf ca. 3,5 Milliliter pro Minute ein. Bei dieser Geschwindigkeit ist der Abfluss eines NMDG-aCSF eine schnelle Fahrt, kein kontinuierlicher Fluss. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf eine Windel.Bevor Sie fortfahren, bestätigt, dass die Maus auf einer chirurgischen Ebene der Anästhesie durch die Durchführung einer Zehenprise. Die Maus sollte nicht ansprechbar sein, dann ihre Vorder- und Hinterbeine heruntergeklebt, so dass Brust und Bauch freigelegt werden. Schneiden Sie einen großen Fleck der Haut auf der Brust, von unterhalb des Brustbeins bis zum Hals.Schnappen Sie sich das Brustbein mit Zange, heben Sie es sanft an und beginnen Sie, den Rippenkäfig auf beiden Seiten zu durchschneiden, bis die Brusthöhle freigelegt ist. Schneiden Sie durch das Zwerchfell, so dass die Klappe des Rippenkäfigs über ein dünnes Stück Muskel befestigt. Es sollte möglich sein, es beiseite zu legen, ohne dass es auf die exponierte Brusthöhle zurückfällt.Überprüfen Sie, ob das Herz immer noch schlägt und stellen Sie sicher, dass der größte Teil der Leber sichtbar ist. Setzen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein, der farblich heller aussieht als der rechte. Um die Nadel zu stabilisieren, fahren Sie sie durch die verbleibenden Rippen auf der linken Seite des Körpers.Suchen Sie das dunkelrot gefärbte rechte Atrium und schneiden Sie es mit einer kleinen Schere durch. Das Blut sollte zu fließen beginnen. Starten Sie die Pumpe und beobachten Sie die Leber, die Farbe von rot zu braun ändern wird.Überwachen Sie die Leberfarbe und setzen Sie die Perfusion fort, bis die Leber blassbraun wird. Führen Sie die Pumpe noch ein paar Minuten aus. Die Körpertemperatur des Tieres sollte auf 28 bis 29 Grad Celsius sinken und seine Nase sollte kalt sein.Enthaupten Sie die Maus mit einer großen Enthauptungsschere, dann verwenden Sie ein Skalpell mit einer Klinge der Zahl 10, um die Haut auf dem Schädel zu schneiden. Mit einer kleinen abgewinkelten Schere den Schädel an der Mittellinie schneiden. Als nächstes verwenden Sie die Nummer drei Zangen, um die rechte und linke Hälfte des Schädels wegzuhebeln, vorsichtig zu sein, um die Dura mit ihm wegzunehmen.Entfernen Sie das Gehirn, das eine weiße Farbe sein sollte, indem Sie es mit einem Spachtel aushöhlen und in die NMDG-aCSF-Lösung auf Eis fallen lassen. Lassen Sie es dort für bis zu einer Minute. Nehmen Sie das Gehirn aus dem NMDG-aCSF und legen Sie es auf ein Stück Filterpapier.Schneiden und entfernen Sie einen 60-Grad-Keil aus Gewebe mit einem 60-Grad-Werkzeug zentriert an der Mittellinie aus dem rostralen Ende des Vorderhirns. Verwenden Sie die geschnittenen Seiten der Montagefläche, da sie den richtigen Winkel für Hippocampusscheiben bietet. Trennen Sie die Halbkugeln an der Mittellinie mit dem Skalpell und kleben Sie sie auf die Montagescheibe.Nehmen Sie die Montagescheibe vom Eis und wischen Sie sie bei Bedarf trocken. Dann kleben Sie jede Hemisphäre vor dem Agarblock, seitlich abschneiden. Stellen Sie sicher, dass die ventralen Seiten beider Hemisphären den Agarblock berühren und dass die Rückenseiten beider Hemisphären der Klinge zugewandt sind.Wenn sie auf die geschnittene Seite geklebt wird, sollte jede Hemisphäre relativ zur Klinge so ausgerichtet sein, dass querscheibendes des dorsalen Hippocampus in situ gewährleistet wird. Untertauchen Sie die Scheibe mit den Hemisphären in eine Schneidkammer mit eiskaltem, kariertem NMDG-aCSF. Schneiden Sie einen 400-Mikrometer-Abschnitt, und verwenden Sie dann eine Einweg-Transferpipette mit einer Trennspitze, um die Scheibe in eine Rückgewinnungskammer mit kariertem NMDG-aCSF bei Raumtemperatur zu übertragen.Schneiden Sie den Rest der Abschnitte weiter und übertragen Sie sie in die Rückgewinnungskammer, die nicht länger als 10 Minuten dauert, um insgesamt acht bis zehn Scheiben aus der dorsalen Hippocampus-Region zu schneiden. Inkubieren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur für etwa zwei Stunden vor der Aufnahme. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Hippocampus-Scheiben von erwachsenen Mäusen zu erzeugen.Eine große Anzahl von Pyramidenzellen im CA1-Feld und Subiculum erscheinen in geringem Kontrast, einem Kennzeichen gesunder Zellen, wenn sie unter infraroter Differentialkontrastmikroskopie beobachtet werden. Patch-Clamp-Aufnahmen können von CA1-Neuronen von Mäusen erhalten werden, die über sechs Monate alt sind. Im Beispielexperiment hier wurde die Häufigkeit der miniaturexzitatorischen postsynaptischen Ströme gemessen, nachdem NMDA-LTD relativ zu den Kontrollbedingungen induziert wurde.Die Häufigkeit der miniaturexzitatorischen postsynaptischen Ströme war in Neuronen nach einer NMDA-LTD-Induktion niedriger, was auf aktivitätsabhängiges Belaufen von Synopsen in CA1 hindeutet. Änderungen der Amplitude wurden nicht erkannt. Während der mEPSC-Aufnahmen wurden auch CA1-Zellen mit Biocytin gefüllt und intakte dendritische Laube und ein gesunder Zellhabitus der pyramidenförmigen Neuronen sind hier zu sehen.Eine robuste Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Zelle ermöglicht die Analyse von Dendriten und dendritischen Stacheln unter verschiedenen Bedingungen. Es wurde eine Langfristige Potenzierung (LTP) von CA3-CA1-Synapsen von etwa 170 % beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Aufrechterhaltung der für LTP benötigten Signalkaskaden in Scheiben von erwachsenen Mäusen vorhanden ist. Ein robustes, auferregendes postsynaptisches Potenzialsignal deutet darauf hin, dass auch die Netzwerkkonnektivität erhalten blieb.Zwei kritische Aspekte des Protokolls sind die transkardiale Profusion mit einer eiskalten Lösung zur Induzieren von Hypothermie und die Einführung eines NMDG als Natriumionenersatz in Lösungen zur Vorbeugung zytotoxischer Ödeme. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen können akute Scheiben aus jeder Hirnregion hergestellt werden. Darüber hinaus können auf diese Weise hergestellte Scheiben für die Kalzium- und Spannungsbildgebung mittels Zweiphotonen- oder Weitfeldmikroskopie verwendet werden.Dieses Protokoll könnte als Grundlage für eine standardisierte Vorbereitung auf akute Hippocampusscheiben von alternden Tieren dienen und so Vergleiche zwischen Studien im Kontext neurodegenerativer Krankheitsmechanismen erleichtern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Kontinuierliches Video-Elektroenzephalogramm während Hypoxie-Ischämie bei neonatalen Mäusen

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...