Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

אני מודה לד"ר קרלה ג'יי שץ על ייעוץ ותמיכה, וד"ר ברברה ק. בראט ומישל ק. דוקס על שקראו את כתב היד באופן ביקורתי. העבודה נתמכת על ידי NIH EY02858 וקרן הצדקה מאת'רס מעניקה ל-CJS.

הפרוטוקול מתבצע בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי הוועדה למוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת סטנפורד. שיטות הן גם בהתאם למדיניות של האגודה למדעי המוח על השימוש בבעלי חיים ובני אדם במחקר מדעי המוח.
הערה: כל העכברים נשמר?...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כי פרוסות היפוקמפוס המתקבלות מעכברים מבוגרים ומזדקנים יכולים להישאר בריאים וכדאיים במשך שעות רבות לאחר החיתוך. הפרוסות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מתאימות להקלטות של מהדק-תיקון, כמו גם להקלטות שדה לאורך זמן באזורי CA1.
קיימים שני שלבים קריטיים בפר...

הופעתם של ההכנות לחתיכה מוחית חריפה של היונקים הקלה על ניסויים ברמה התאית והסינופטית שהיו אפשריים בעבר רק בהכנות חסרי חוליות כמו Aplysia1. פיתוח פרוסות היפוקמפוס אקוטיות היה בעל משמעות מיוחדת, כפי שהוא מבנה אחראי על זיכרון עבודה היווצרות הקשר, ויש לו מעגלים תלת-סינפטיים מיוחדים כי הוא נוח מניפולציה פיזיולוגית קלה. עם זאת, הרוב המכריע של פרוסות מוח אקוטיות עדיין מוכנים מעכברים וחולדות צעירים יחסית, כפי שקל יותר לשמר נוירונים ומעגלים בריאים, ואת הפרוסות להישאר קיימא לפרקיזמן ארוכים יותר 2,,3,,4. כאן, אנו מציגים שינויים בפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים התוצאתם כדאיות מוגברת של פרוסות היפוקמפוס אקוטיות מעכברים בוגרים ומזדקנים.
המכשול העיקרי לכדאיות vivo לשעבר לטווח ארוך של parenchyma המוח יונקים הוא הנזק היפוקסי הראשוני המתרחשת במהירות ברגע זרימת הדם למוח מפסיק בעקבות עריפת ראש. אובדן חמצן גורם לצריכה חילוף חומרים מהירה של משאבי אנרגיה עיקריים במוח עם אובדן של פוספו-קריאטין (P-קריאטין) להיות המהיר ביותר, ואחריו גלוקוז, אדנוזין טריפוספט (ATP), וגלוקוגן4. שימור ATP הוא בעל חשיבות מיוחדת לבריאות לטווח ארוך של פרוסות מוח, כמו ATP נדרש כדי לשמור על פוטנציאל קרום באמצעות ATPase Na-K, וכתוצאה מכך את הפעילותהעצבית 5,6. רמת ה-ATP במוח המכרסמים הבוגרים היא כ-2.5 מ"מ, והיא יורדת במהירות בתוך 20 שניות של עריפת ראש כדי להגיע למצב יציב של בסיס (כ-0.5 מ"מ) בסביבות דקה לאחר עריפתראש 4,,7,,8. בבעלי חיים צעירים, לוקח יותר זמן לצפות באותה ירידה ATP (~ 2 דקות); עם הרדמה פנוברביטל הוא הואט עוד יותר 4 דקות4. שיקולים אלה מראים כי מניעת אובדן ATP ומשאבי אנרגיה אחרים היא אסטרטגיה הכרחית כדי למנוע נזק היפוקסי למוח ובכך כדי לשמור על הבריאות של פרוסות המוח על פני פרקי זמן ארוכים יותר, במיוחד בבעלי חיים בוגרים.
טמפרטורות נמוכות מאטות את חילוף החומרים. כתוצאה מכך, הוכח כי היפותרמיה צנועה מגנה על עתודות אנרגיית המוח: בבעלי חיים צעירים, הורדת טמפרטורת הגוף בשש מעלות, מ 37 °C ל 31 ° C, משמרת את רמות ATP סביב 80% של רמות נורמליות מעל 4 שעות של היפוקסיהמבוקרת 9. רמות P-קריאטין נשמרים באופן דומה, כמו גם פוטנציאל פוספורילציההכוללת 9. זה מצביע על כך שהורדת טמפרטורת הגוף לפני עריפת ראש יכול להיות neuroprotective, כמו רמות כמעט נורמליות של ATP יכול להישמר באמצעות חיתוך פרוסה ופרוסה התאוששות תקופות.
במידה כי ירידה ATP לא ניתן למנוע לחלוטין על עריפת ראש, פונקציה לקויה חלקית של ATPase Na-K צפוי, ואחריו depolarization באמצעות זרם נתרן פסיבי. כמו זרם נתרן פסיבי מלווה בכניסת מים לתאים, זה גורם בצקת ציטוקוקסית ובסופו של דבר פיקנוזיס. בחולדות בוגרות, החלפת יונים Na+ עם סוכרוז בפתרונות חיתוך פרוסה כבר אסטרטגיה מוצלחת כדי להקל על הנטל של בצקת cytotoxic10,11. לאחרונה, cations אורגני מתילציה המפחיתים חחולערוץ נתרן 12 הראו להציע הגנה יעילה יותר מאשר סוכרוז, במיוחד פרוסות מעכברים בוגרים, עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) להיות ישים ביותר על פני גילאים שונים ואזורי מוח13,,14,,15,,16.
פרוטוקולים רבים לחיתוך מוח כרוכים בשימוש בטמפרטורות קרות רק במהלך שלב חיתוך הפרוסה, לעתים בשילוב עם Na+ ion החלפתאסטרטגיה 16,17. בבעלי חיים צעירים, פרוטוקולים אלה מופיעים להציע הגנה עצבית מספקת מאז המוח ניתן לחלץ במהירות לאחר עריפת ראש כי הגולגולת היא עדיין רזה וקל להסיר3. עם זאת, אסטרטגיה זו אינה מייצרת פרוסות בריאות מבעלי חיים בוגרים. עם הזמן, מספר מעבדות החוקרות מכרסמים בוגרים הציגו זיעה בין-לבית עם תמיסה קרה כקרח כדי להקטין את טמפרטורת הגוף של החיה, ולכן נזק היפוקסי למוח, לפני עריפת ראש. הליך זה הוחל בהצלחה כדי לייצר פרוסות המוח18, פרוסות המוח האמצעי19, פרוסות neocortical11,20, קליפת פריהינלית21, היפוקמפוסחולדה 10,22,23, נורהחוש הריח 24, סטריאטוםאוורור 25, קליפת המוח,החזותית 26.
למרות היתרונות המוצעים על ידי עירוי transcardial ו Na+ תחליף יון בהכנת פרוסות מעכברוש ובאיזורים מסוימים במוח בעכברים, היפוקמפוס העכבר נשאר אחד האזורים המאתגרים ביותר כדי להגן מפני היפוקסיה13,20. עד כה, אחת הגישות הנפוצות ביותר לחיתוך היפוקמפוס מעכברים מזדקנים ומודלים עכבר של ניוון עצבי כרוך חיתוך מהיר קלאסי של היפוקמפוס מבודד27. בפרוטוקול המתואר כאן, אנו ממזערים את אובדן ATP במוח הבוגר על ידי הצגת היפותרמיה לפני עריפת הראש על ידי חפירת החיה באופן טראנס-קר עם Na קר כקרח+- נוזל מוחי מוחי מלאכותי מבוסס NMDG חינם (NMDG-aCSF). לאחר מכן, הפרוסות נחתכו ב-Naהקר כקרח +NMDG-aCSF ללא תשלום. עם פרוטוקול משופר זה אנו מקבלים פרוסות היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאימים לטווח ארוך שדה הקלטות מחקרים טלאי-מהדק.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

פרוסות היפוקמפוס אקוטי אפשרו דורות של מדעני מוח לחקור תכונות סינפטיות, עצביות, ומעגל בפירוט ובנאמנות גבוהה. חקירה של מנגנוני LTP ו-LTD, חישוב דנדריטי נוירון יחיד, ושינויים תלויי ניסיון במעגלים, לא היו אפשריים ללא הכנה קלאסית זו. עם זאת, עם כמה יוצאים מן הכלל, המחקר הבסיסי ביותר באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפה בוצע באמצעות פרוסות מכרסמים של גילים צעירים יחסית, ~ P20-P40, למרות מנגנוני עירור סינפטיים פנימיים יש זנב התפתחותי ארוך שמגיע מעבר P60. הערעור העיקרי של שימוש בפרוסות היפוקמפוס צעירות הוא שימור של בריאות עצבית בסיוע סובלנות גבוהה יותר לנזק היפוקסי. עם זאת, יש צורך להבין את התפקוד העצבי בשלבים בוגרים יותר של התפתחות, מודגש עוד יותר על ידי התפתחות מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות ניווניות הדורשות הכנה מוחית מזדקנת. כאן אנו מתארים שינוי בהכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה המספקת באופן אמין פרוסות בריאות מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם זיעה וחיתוך בין-לב וחיתוך עם NMDG-aSCF ללא נתרן קר כקרח. יחד, שלבים אלה להחית את הירידה המושרה היפוקסיה ATP על עריפת ראש, כמו גם בצקת ציטוקוקסית הנגרמת על ידי שטף נתרן פסיבי. אנו מדגימים כיצד לחתוך פרוסות טרנסוורס של היפוקמפוס בתוספת קליפת המוח באמצעות מיקרוטומיה רוטטת. פרוסות היפוקמפוס אקוטיות שהושגו בדרך זו הן בריאות באופן מהימנים במשך שעות רבות של הקלטה, והן מתאימות הן להקלטות שדה והן להקלטות ממוקדות של מהדק טלאי, כולל מיקוד של נוירונים המסומנים בפלורסנט.

יישם את הפרוטוקול לעיל כדי ליצור פרוסות היפוקמפוס מ Camkiia-Cre+; עכברי WT על רקע גנטי מעורב C57Bl / 6 x SV / 129J, ב P > 120. מספר גדול של תאים פירמידתיים בשדה CA1 (איור 2A) וסוביקולום(איור 2B)מופיעים בניגודיות נמוכה כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ ניגודיות דיפרה-אדום (IR-DIC), סימן היכר ש...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

הפרוטוקול המוצג כאן מפחית נזק היפוקסי מוגזם במהלך הכנת פרוסות היפוקמפוס עכבר בוגר ומזדקן, ובכך מסיר מכשול מרכזי לחקר תפקוד המעגלים העצביים הבוגרים והמזדקנים. מבוא של היפותרמיה בפתרונות ללא נתרן תוצאות פרוסות ההיפוקמפוס כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאים הן עבור הקלטות שדה לטווח ארוך מחקרים מהדק טלאי. שיטה זו של הכנת פרוסות היפוקמפוס יכולה להיות רלוונטית במיוחד עבור מודלים של בעלי חיים במחלות ניווניות שמעצם הגדרתן דורשות הכנת מוח מזדקן.הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא החדרת היפותרמיה באמצעות שפע טרנסקרדיאלי עם פתרון קר כקרח. עם תרגול מסוים, החוקרים יוכלו לבצע צעד זה באופן אמין. התחל על ידי הכנת ליטר אחד של פתרון aCSF עבור תא ההתאוששות והקלטות הבאות.לאחר מכן הכינו 300 מיליליטר של NMDG-aCSF לצעדי ההתגלות והחיתוך הטרנס-קרדיאליים. מניחים את מגש חיתוך המיקרוטום הרוטט ואת דיסק ההרכבה במקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תא ההתאוששות, למלא אותו רק מעל פרוסת מחזיק רשת ולהתחיל את הבועה שמירה על התא על הספסל בטמפרטורת החדר.מצננים את כל 300 המיליליטרים של NMDG-aCSF במקפיא עד גבישי קרח מתחילים להיווצר על פני השטח ועל קירות הבקבוק. מניחים את הבקבוק עם מצונן NMDG-aCSF על קרח בועה זה, שמירה על הפתרון בין אפס לשתי מעלות צלזיוס. מוציאים את הדיסק להרכבת הרקמות מהמקפיא ומנגבים אותו יבש, במידת הצורך.חותכים בלוק של 5% אגר על הגודל של מוח העכבר ולהדביק אותו במרכז הדיסק באמצעות שכבה דקה של דבק cyanoacrylate. מניחים את הדיסק עם אגר מודבק על קרח ומכסים אותו במגבות נייר עד מוכן לשימוש. מוציאים את מגש החיתוך מהמקפיא, מניחים אותו במיקרוטום, ואז מקיפים אותו בקרח ועומסים את הלהב.הכן את כל הכלים מראש עבור ניתוח המוח. הגדר את המשאבה הפריסטואלית לזלוד ארעי. הכנס צד אחד של צינורות המשאבה לתוך הבקבוק עם NMDG-aCSF קר להתאים את הצד השני עם מחט 27 מד.הגדר את מהירות המשאבה לכ-3.5 מיליליטר לדקה. במהירות זו, הזרימה של NMDG-aCSF היא נסיעה מהירה, לא זרימה רציפה. מניחים את העכבר על גבו על חיתול.לפני שתמשיך, אישר כי העכבר נמצא במישור כירורגי של הרדמה על ידי ביצוע צביטה בוהן. העכבר צריך להיות לא מגיב, ואז מודבק במורד רגליו הקדמיות והיש מאחור, כך החזה והבטן חשופים. חותכים חלק גדול של העור על החזה, הולך מתחת עצם החזה אל הגרון.תופסים את עצם החזה במדפים, מרימים אותה בעדינות ומתחילים לחתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים עד שנחשף חלל החזה. חותכים דרך הסרעפת, משאירים את הדש של כלוב הצלעות מחובר דרך חתיכה דקה של שריר. זה צריך להיות אפשרי לשים אותו בצד מבלי שזה ייפול בחזרה על חלל החזה החשוף.בדוק כי הלב עדיין פועם ולוודא כי רוב הכבד גלוי. הכנס את המחט לחדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מימין. כדי לייצב את המחט, כונן אותו דרך הצלעות הנותרות בצד שמאל של הגוף.אתר את ה אטריום הימני בצבע אדום כהה וחתוך דרכו במספריים קטנים. הדם צריך להתחיל לזרום החוצה. התחל את המשאבה ולהתבונן בכבד, אשר ישנה את הצבע מ אדום לחום.לפקח על צבע הכבד ולהמשיך חליטה עד הכבד הופך חום חיוור. הפעל את המשאבה עוד כמה דקות. טמפרטורת הגוף של החיה צריכה לרדת ל 28 עד 29 מעלות צלזיוס והאף שלה צריך להיות קר למגע.ערפו את ראשו של העכבר עם מספריים גדולים של עריפת ראש, ולאחר מכן השתמשו באזמל עם להב מספר 10 כדי לחתוך את העור על גבי הגולגולת. עם מספריים זוויתיים קטנים, חותכים את הגולגולת בקו האמצע. לאחר מכן, השתמש במדפים מספר שלוש כדי לחטט את החצאים הימניים והשמאליים של הגולגולת, נזהר לקחת את הדורה משם עם זה.הסר את המוח, אשר צריך להיות צבע לבן על ידי גורף אותו עם מרית ושחרר אותו לתוך פתרון NMDG-aCSF על קרח. תשאיר את זה שם עד דקה. מוציאים את המוח מה-NMDG-aCSF ומניחים אותו על פיסת נייר סינון.חותכים ומסירים טריז 60 מעלות של רקמה עם כלי 60 מעלות מרוכז בקו האמצע מקצה rostral של המוח הקדם. השתמש בצדדים החתוכים של משטח ההרכבה מכיוון שהוא מספק את הזווית המתאימה לפרוסות היפוקמפוס. הפרד את ההמיספרות לאורך קו האמצע עם האזמל והדבק אותן על דיסק ההרכבה.קח את דיסק ההרכבה מהקרח ונגב אותו יבש, במידת הצורך. ואז להדביק כל חצי כדור מול גוש אגר, לחתוך את הצד כלפי מטה. ודא כי הצדדים הגחוני של שתי ההמיספרות נוגעים בלוק אגר ושצדדים הגביים של שתי ההמיספרות פונים אל הלהב.כאשר מודבק בצד החתך, כל חצי הכדור צריך להיות מכוון יחסית ללהב באופן המבטיח פרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי באתרו. להטביע את הדיסק עם ההמיספרות לתוך תא חיתוך המכיל קר כקרח פחמימות NMDG-aCSF. חותכים קטע 400 מיקרומטר, ולאחר מכן להשתמש פיפטה העברה חד פעמית עם קצה ניתוק כדי להעביר את הפרוסה לתא התאוששות המכיל פחמימות NMDG-aCSF בטמפרטורת החדר.המשך לחתוך את שאר החלקים ולהעביר אותם לתא ההתאוששות לוקח לא יותר מ 10 דקות כדי לחתוך בסך הכל שמונה עד 10 פרוסות מאזור ההיפוקמפוס הגבי. הדגירה את הפרוסות בטמפרטורת החדר כשעתיים לפני ההקלטה. פרוטוקול זה שימש ליצירת פרוסות היפוקמפוס מעכברים בוגרים.מספרים גדולים של תאים פירמידליים בשדה CA1 ובסוביקום מופיעים בניגודיות נמוכה, סימן ההיכר של תאים בריאים, כאשר הם נצפו תחת מיקרוסקופיה של ניגודיות דיפרנציאלית אינפרא-אדום. הקלטות מהדק טלאי ניתן להשיג נוירונים CA1 של עכברים כי הם מעל שישה חודשים. בניסוי לדוגמה כאן, התדירות של זרמים מיניאטוריים סינקרטיים נמדדה לאחר NMDA-LTD היה המושרה ביחס לתנאי הבקרה.התדירות של זרמים מיניאטוריים סינטטיים סינפטיים הייתה נמוכה יותר בנוירונים לאחר אינדוקציה NMDA-LTD, המציין פעילות תלויה גיזום של תקצירים ב CA1. לא זוהו שינויים משרעת. במהלך הקלטות mEPSC, תאי CA1 היו גם מלאים biocytin ו arbor דנדריטי שלם הרגל תא בריא של נוירונים פירמידליים ניתן לראות כאן.התפלגות חזקה של הצבע הפלואורסצנטי בכל התא מאפשרת ניתוח של דנדריטים וקוצים דנדריטיים בתנאים שונים. עוצמה לטווח ארוך, או LTP, של סינפסות CA3-CA1 של כ 170%, מה שמרמז כי תחזוקה של מפלים איתות הדרושים LTP קיים פרוסות מוכן מעכברים בוגרים. אות פוטנציאלי פוסט-סינפטי חזק של השדה מרמז על כך שגם קישוריות הרשת נשמרה.שני היבטים קריטיים של הפרוטוקול הם שפע טרנסקרדיאלי עם פתרון קר כקרח כדי לגרום להיפותרמיה והכנסת NMDG כתחליף יון נתרן בפתרונות למניעת בצקת ציטוקסטית. באמצעות אמצעי זהירות אלה, פרוסות חריפות ניתן להכין מכל אזור במוח. יתר על כן, פרוסות שהוכנו באופן זה ניתן להשתמש עבור הדמיה סידן ומתח באמצעות שני פוטון או מיקרוסקופיה שדה רחב.פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להכנה מתוקקנת לפרוסות היפוקמפוס חריפות מבעלי חיים מזדקנים ובכך להקל על השוואות בין מחקרים בהקשר של מנגנוני מחלה נוירודגנרטיבית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

אלקטרואנצפלוגרמה וידאו רציפה במהלך היפוקסיה-איסכמיה בעכברים יילודים

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...