Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Ringrazio la dottoressa Carla J. Shatz per i consigli e il supporto, e la dottoressa Barbara K. Brott e Michelle K. Drews per aver letto criticamente il manoscritto. Il lavoro è sostenuto da NIH EY02858 e dalla Mathers Charitable Foundation concede a CJS.

Il protocollo viene eseguito in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stanford University. I metodi sono anche in conformità con le politiche della Società per le neuroscienze sull'uso degli animali e degli esseri umani nella ricerca sulle neuroscienze.
NOTA: tutti i topi sono stati mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni. Qui sono sta...

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M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Il protocollo qui descritto dimostra che le fette di ippocampo ottenute da topi adulti e anziani possono rimanere sane e vitali per molte ore dopo il taglio. Le sezioni preparate utilizzando questo protocollo sono appropriate per le registrazioni di patch-clamp, così come le registrazioni sul campo di lunga durata nelle regioni CA1.
Esistono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo passo è il passo di perfusione trascardica con una soluzione ghiacciata. La rapida liquidazione del ...

L'avvento dei preparati a fette cerebrali acute dei mammiferi ha facilitato esperimenti a livello cellulare e sinaptico che in precedenza erano possibili solo in preparazioni invertebrate come Aplysia1. Lo sviluppo di fette acute di ippocampo era di particolare importanza, in quanto è una struttura responsabile della memoria di lavoro e della formazione del contesto, e ha un circuito tri-sinaptico specializzato che è su misura per una facile manipolazione fisiologica. Tuttavia, la stragrande maggioranza delle fette cerebrali acute sono ancora preparate da topi e ratti relativamente giovani, in quanto è più facile preservare neuroni e circuiti sani e le fette rimangono vitali per lunghi periodidi tempo 2,3,4. Qui, introduciamo modifiche ai protocolli di sezionamento standard che si traducono in una maggiore vitalità delle fette acute di ippocampo da topi adulti e invecchiati.
Il principale ostacolo alla vitalità ex vivo a lungo termine del parenchyma cerebrale dei mammiferi è il danno ipossico iniziale che si verifica rapidamente una volta che il flusso sanguigno al cervello smette di essere decapitato. La perdita di ossigeno si traduce in un rapido consumo metabolico di grandi risorse energetiche nel cervello con la perdita di fosfo-creatina (P-creatine) essendo il più rapido, seguito da glucosio, adenosina triphosphate (ATP), e glicogeno4. La conservazione dell'ATP è di particolare importanza per la salute a lungo termine delle fette cerebrali, in quanto l'ATP è necessario per mantenere il potenziale della membrana tramite l'ATPase Na-K, e di conseguenza l'attività neurale5,6. Il livello ATP nel cervello dei roditori adulti è di 2,5 mM, e scende precipitosamente entro 20 s di decapitazione per raggiungere uno stato stabile basale (0,5 mM) a circa 1 min dopo ladecapitazione 4,7,8. Negli animali giovani, ci vuole più tempo per osservare lo stesso calo dell'ATP (2 min); con anestesia fenobarbitale è ulteriormente rallentato a 4 min4. Queste considerazioni dimostrano che prevenire la perdita di ATP e altre risorse energetiche è una strategia necessaria per prevenire danni ipossici al cervello e a sua volta per mantenere la salute delle fette cerebrali per lunghi periodi di tempo, soprattutto negli animali adulti.
Le basse temperature rallentano il metabolismo. Di conseguenza, è stato dimostrato che una modesta ipotermia protegge le riserve di energia cerebrale: negli animali giovani, abbassando la temperatura corporea di sei gradi, da 37 gradi centigradi a 31 gradi centigradi, mantiene i livelli di ATP a circa l'80% dei livelli normali oltre i 4 h di ipossiacontrollata 9. I livelli di P-creatina sono conservati allo stesso modo, così come il potenziale di fosforilazione complessiva9. Ciò suggerisce che abbassare la temperatura corporea prima della decapitazione potrebbe essere neuroprotettivo, come quasi normale livelli di ATP potrebbero essere mantenuti attraverso il taglio fetta e slice periodi di recupero.
Nella misura in cui un calo ATP non può essere completamente impedito al momento della decapitazione, si prevede una funzione parzialmente compromessa del Na-K ATPase, seguita dalla depolarizzazione tramite afflusso passivo di sodio. Poiché l'afflusso passivo di sodio è seguito dall'ingresso di acqua nelle cellule, provoca edema citotossico e infine pyknosis. Nei ratti adulti, la sostituzione degli ioni di Naè con il saccarosio nelle soluzioni di taglio delle fette è stata una strategia di successo per alleviare il peso dell'edema citotossico10,11. Più di recente, le cations organiche metilate che riducono la permeabilità del canale di sodio12 hanno dimostrato di offrire una protezione più efficace rispetto al saccarosio, soprattutto nelle fette di topi adulti, con N-methyl-D-glucamina (NMDG) più ampiamente applicabile tra diverse età e regioni del cervello13,14,15,16.
Numerosi protocolli di taglio del cervello prevedono l'utilizzo di temperature fredde solo durante la fase di taglio delle fette, a volte in combinazionecon la strategia di sostituzione degli ioniNa 16,17. Nei giovani animali, questi protocolli sembrano offrire sufficiente neuroprotezione poiché il cervello può essere estratto rapidamente dopo la decapitazione perché il cranio è ancora sottile e facile da rimuovere3. Tuttavia, questa strategia non produce fette sane da animali adulti. Nel corso del tempo, un certo numero di laboratori che studiano roditori adulti hanno introdotto la perfusione transcardiale con una soluzione ghiacciata per diminuire la temperatura corporea dell'animale, e quindi danni ipossici al cervello, prima della decapitazione. Questa procedura è stata applicata con successo per produrre fette cerebellari18, fette midbrain19, fette neocorticali11,20, corteccia perirhinale21, ippocampo di ratto10,22,23, bulbo olfattivo24, ventrala stritatum25, corteccia visiva26.
Nonostante i vantaggi offerti dalla perfusione transcarriale e dalla sostituzione degli ioni na- nella preparazione di fette di ratto e in alcune regioni cerebrali nei topi, l'ippocampo dei topi rimane una delle aree più impegnative da proteggere dall'ipossia13,20. Ad oggi, uno degli approcci più comuni per affettare l'ippocampo da topi e modelli murini di invecchiamento della neurodegenerazione comporta il classico affettatura veloce dell'ippocampoisolato 27. Nel protocollo qui descritto, riduciamo al minimo la perdita di ATP nel cervello adulto introducendo l'ipotermia prima della decapitazione mediante la decifrazione dell'animale conna- liquido cerebrospinale artificiale a base di NMDG (NMDG-aCSF) gratuito. Le fette vengono poi tagliate+in NMDG-aCSF senza ghiaccio. Con questo protocollo avanzato otteniamo fette acute di ippocampo da topi adulti e di invecchiamento che sono sani fino a 10 h dopo il sezionamento e sono appropriati per le registrazioni sul campo a lungo termine e gli studi di patch-clamp.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Le fette acute dell'ippocampo hanno permesso a generazioni di neuroscienziati di esplorare le proprietà sinaptiche, neuronali e dei circuiti in dettaglio e con alta fedeltà. L'esplorazione dei meccanismi LTP e LTD, il calcolo dendritico singolo neurone e i cambiamenti dipendenti dall'esperienza nei circuiti, non sarebbero stati possibili senza questa preparazione classica. Tuttavia, con poche eccezioni, la maggior parte della ricerca di base utilizzando fette acute di ippocampo è stata eseguita utilizzando fette di roditori di età relativamente giovani, P20-P40, anche se i meccanismi di eccitabilità sinaptica e intrinseca hanno una lunga coda di sviluppo che raggiunge oltre P60. Il fascino principale dell'utilizzo di giovani fette di ippocampo è la conservazione della salute neuronale aiutata da una maggiore tolleranza ai danni ipossici. Tuttavia, c'è bisogno di comprendere la funzione neuronale in fasi più mature di sviluppo, ulteriormente accentuate dallo sviluppo di vari modelli animali di malattie neurodegenerative che richiedono una preparazione cerebrale di invecchiamento. Qui descriviamo una modifica a una preparazione acuta a fette di ippocampo che fornisce in modo affidabile fette sane da ippocampo di topo adulto e invecchiamento. I passaggi critici del protocollo sono la perfusione trascardica e il taglio con NMDG-aSCF senza sodio ghiacciato. Insieme, questi passaggi attenuano il calo indotto dall'ipossia nell'ATP al momento della decapitazione, così come l'edema citotossico causato da flussi di sodio passivo. Dimostriamo come tagliare fette trasversali di ippocampo più corteccia utilizzando un microtome vibrante. Le fette acute di ippocampo ottenute in questo modo sono affidabili per molte ore di registrazione e sono appropriate sia per le registrazioni sul campo che per le registrazioni mirate di morsetto patch, incluso il targeting dei neuroni etichettati fluorescentemente.

Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per generare fette di ippocampo da CamKIIa-Cre; Topi WT su sfondo genetico misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, a P > 120. Un gran numero di cellule piramidali nel campo CA1 (Figura 2A) e subiculum (Figura 2B) appaiono in basso contrasto quando osservati sotto la microscopia a contrasto differenziale a infrarossi (IR-DIC), un segno distintivo delle cellule sane in una preparazione di sezione. Con questa preparazione, un alto ta...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Il protocollo qui presentato riduce l'eccessivo danno ipossia durante la preparazione di fette ippocampali di topo adulte e invecchianti, rimuovendo così un grosso ostacolo per lo studio della funzione dei circuiti neurali maturi e invecchiati. L'introduzione dell'ipotermia nelle soluzioni senza sodio si traduce in fette ippocampali che sono sane fino a 10 ore dopo il taglio e appropriate sia per le registrazioni sul campo a lungo termine che per gli studi di patch-clamp. Questo metodo di preparazione delle fette ippocampali potrebbe essere particolarmente rilevante per i modelli animali nelle malattie neurodegenerative che per definizione richiedono una preparazione cerebrale invecchiata.Il passaggio più critico di questo protocollo è l'introduzione dell'ipotermia tramite profusione trascardica con una soluzione ghiacciata. Con una certa pratica, i ricercatori saranno in grado di eseguire in modo affidabile questo passaggio. Inizia preparando un litro di soluzione aCSF per la camera di recupero e le registrazioni successive.Quindi preparare 300 millilitri di NMDG-aCSF per la profusione trascardica e le fasi di taglio. Posizionare il vassoio di taglio del microtomo vibrante e il disco di montaggio in un congelatore meno 20 gradi Celsius. Per preparare la camera di recupero, riempirla appena sopra la fetta che tiene la maglia e avviare il bubbler mantenendo la camera sul banco a temperatura ambiente.Raffreddare tutti i 300 millilitri di NMDG-aCSF in un congelatore fino a quando i cristalli di ghiaccio iniziano a formarsi sulla superficie e sulle pareti della bottiglia. Posizionare la bottiglia con refrigerato e NMDG-aCSF sul ghiaccio e bollarla, mantenendo la soluzione tra zero e due gradi Celsius. Togliere il disco di montaggio del tessuto dal congelatore e asciugarlo, se necessario.Ritaglia un blocco di agar al 5% delle dimensioni di un cervello di topo e incollalo al centro del disco usando un sottile strato di colla cianoacrilato. Posizionare il disco con agar incollato sul ghiaccio e coprirlo con tovaglioli di carta fino a quando non è pronto per l'uso. Togliere il vassoio di taglio dal congelatore, posizionarlo nel microtomo, quindi circondarlo di ghiaccio e caricare la lama.Preparare tutti gli strumenti in anticipo per la dissezione cerebrale. Impostare la pompa peristaltica per la perfusione trascardica. Inserire un lato del tubo della pompa nella bottiglia con NMDG-aCSF ghiacciato e montare l'altro lato con un ago calibro 27.Impostare la velocità della pompa su circa 3,5 millilitri al minuto. A questa velocità, il deflusso di un NMDG-aCSF è un viaggio veloce, non un flusso continuo. Posizionare il mouse sulla schiena su un pannolino.Prima di continuare, ha confermato che il topo si trova su un piano chirurgico di anestesia eseguendo un pizzico di dito del piedi. Il topo non deve rispondere, quindi assottigliato le zampe anteriori e posteriori in modo che il torace e l'addome siano esposti. Ritaglia una grande macchia della pelle sul petto, andando da sotto lo sterno alla gola.Afferrare lo sterno con le forcep, sollevarlo delicatamente e iniziare a tagliare attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati fino a quando la cavità toracica non è esposta. Tagliare il diaframma, lasciando il lembo della gabbia toracica attaccato tramite un sottile pezzo di muscolo. Dovrebbe essere possibile rlo da parte senza farlo ripierere sulla cavità toracica esposta.Controllare che il cuore batte ancora e assicurarsi che la maggior parte del fegato sia visibile. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro, che sembra di colore più chiaro rispetto a destra. Per stabilizzare l'ago, guidarlo attraverso le costole rimanenti sul lato sinistro del corpo.Individuare l'atrio destro di colore rosso scuro e tagliarlo con piccole forbici. Il sangue dovrebbe iniziare a scorrere. Avvia la pompa e osserva il fegato, che cambierà colore dal rosso al marrone.Monitorare il colore del fegato e continuare la perfusione fino a quando il fegato diventa marrone pallido. Eseguire la pompa per qualche altro minuto. La temperatura corporea dell'animale dovrebbe scendere a 28-29 gradi Celsius e il suo naso dovrebbe essere freddo al tatto.Decapitare il topo con grandi forbici di decapitazione, quindi utilizzare un bisturi con una lama numero 10 per aprire la pelle sopra il cranio. Con piccole forbici angolate, taglia il cranio alla linea mediana. Quindi, usa le pini numero tre per allontanare la metà destra e sinistra del cranio, facendo attenzione a portare via la dura con esso.Rimuovere il cervello, che dovrebbe essere un colore bianco sconto raccogliendolo con una spatola e lasciarlo cadere nella soluzione NMDG-aCSF sul ghiaccio. Lascialo lì per un massimo di un minuto. Estorsi il cervello dall'NMDG-aCSF e posizionarlo su un pezzo di carta da filtro.Tagliare e rimuovere un cuneo di tessuto di 60 gradi con uno strumento di 60 gradi centrato sulla linea mediana dall'estremità rostrale del forebrain. Utilizzare i lati tagliati della superficie di montaggio in quanto fornisce l'angolo corretto per le fette ippocampali. Separare gli emisferi lungo la linea mediana con il bisturi e incollarli sul disco di montaggio.Prendere il disco di montaggio dal ghiaccio e asciugarlo, se necessario. Quindi incollare ogni emisfero di fronte al blocco di agar, tagliare lateralmente verso il basso. Assicurarsi che i lati ventrali di entrambi gli emisferi tocchino il blocco di agar e che i lati dorsali di entrambi gli emisferi siano rivolti verso la lama.Quando incollato sul lato tagliato, ogni emisfero dovrebbe essere orientato rispetto alla lama in modo da garantire fette trasversali dell'ippocampo dorsale in situ. Immergere il disco con gli emisferi in una camera di taglio contenente NMDG-aCSF carbogenato ghiacciato. Tagliare una sezione di 400 micrometri, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta con una punta di taglio per trasferire la fetta in una camera di recupero contenente NMDG-aCSF carbogenato a temperatura ambiente.Continuare a tagliare il resto delle sezioni e trasferirle nella camera di recupero non più di 10 minuti per tagliare un totale di otto-10 fette dalla regione dell'ippocampo dorsale. Incubare le fette a temperatura ambiente per circa due ore prima della registrazione. Questo protocollo è stato utilizzato per generare fette ippocampali da topi adulti.Un gran numero di cellule piramidali nel campo CA1 e nel subicolo appaiono in basso contrasto, un segno distintivo delle cellule sane, quando osservate sotto microscopia a contrasto differenziale infrarosso. Le registrazioni patch-clamp possono essere ottenute da neuroni CA1 di topi che hanno più di sei mesi. Nell'esperimento di esempio qui, la frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura è stata misurata dopo che NMDA-LTD è stato indotto rispetto alle condizioni di controllo.La frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura era inferiore nei neuroni dopo un'induzione di NMDA-LTD, indicando la potatura dipendente dall'attività delle sinapsi in CA1. Non sono stati rilevati cambiamenti di ampiezza. Durante le registrazioni mEPSC, le cellule CA1 sono state riempite anche biocitina e arbor dendritico intatto e habitus cellulare sano dei neuroni piramidali possono essere visti qui.Una robusta distribuzione del colorante fluorescente in tutta la cellula consente l'analisi di dendriti e spine dendritiche in diverse condizioni. È stato osservato un potenziamento a lungo termine, o LTP, delle sinapsi CA3-CA1 di circa il 170%, suggerendo che il mantenimento delle cascate di segnalazione necessarie per l'LTP è presente in fette preparate da topi adulti. Un robusto segnale potenziale postinaptico eccitatorio sul campo suggerisce che anche la connettività di rete è stata preservata.Due aspetti critici del protocollo sono la profusione trascardica con una soluzione ghiacciata per indurre l'ipotermia e l'introduzione di un NMDG come sostituto degli ioni di sodio nelle soluzioni per prevenire l'edema citotossico. Usando queste precauzioni, le fette acute possono essere preparate da qualsiasi regione cerebrale. Inoltre, le fette preparate in questo modo possono essere utilizzate per l'imaging di calcio e tensione utilizzando microscopia a due fotoni o a campo largo.Questo protocollo potrebbe servire come base per una preparazione standardizzata per le fette ippocampali acute degli animali che invecchiano e quindi facilitare il confronto tra gli studi nel contesto dei meccanismi delle malattie neurodegenerative.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...